Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm men moniliella có khả năng sinh tổng hợp đường erythritol

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu Trung tâm Hóa sinh cơng nghiệp Môi trường, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên thầy cô, gia đình bạn bè Lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Thị Minh Khanh, người tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đề tài Viện Công nghiệp thực phẩm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Trung tâm Hóa sinh công nghiệp Môi trường, Viện công nghiệp thực phẩm ln nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt cơng việc Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học thầy cô giáo Bộ mơn động viên dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Cuối xin dành lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè ln động viên khích lệ tơi đường học tập, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Hà Nội, Ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Thương SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Nấm men đen Moniliella 1.1.1 Giới thiệu chung nấm men đen Moniliella 1.1.2 Lịch sử tìm kiếm phân loại 1.1.3 Đặc điểm hình thái sinh sản Moniliella 1.1.4 Ưu điểm ứng nấm men đen Moniliella sản xuất Erythritol 1.2 Sự ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng yếu tố khác mơi trường đến q trình phát triển nấm men đen Moniliella 1.2.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon 1.2.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ 1.2.3 Nguồn khoáng chất[6] 1.2.4 Nguồn vitamin 10 1.2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ 10 1.2.6 Ảnh hưởng pH 11 1.2.7 Thời gian lên men 11 1.2.8 Nồng độ đường 12 1.2.9.Cường độ khơng khí lắc trộn 12 1.3 Đường chức Erythritol 13 1.3.1 Giới thiệu chung 13 1.3.2 Cấu tạo tính chất 13 1.3.3 Ứng dụng 16 1.4.Quá trình nấm men Moniliella biến đổi đường Glucose thành Erythrytol 17 1.4.1 Sự khác biệt q trình tích lũy đường Erythrytol vi khuẩn nấm men 17 1.4.2 Con đường Pentose photphate chủng nấm men chịu áp suất thẩm thấu cao 19 PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Các môi trường giữ giống, nuôi cấy 22 2.3 Các hóa chất cần thiết 23 SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 2.4 Các thiết bị q trình tiến hành thí nghiệm 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp giữ giống 23 2.5.2 Phương pháp xác định khả lên men loại đường 24 2.5.3 Phương pháp kiểm tra ảnh hưởng pH 24 2.5.4 Phương pháp kiểm tra ảnh hưởng nhiệt độ tới khả lên men 24 2.5.5 Phương pháp hấp phụ than hoạt tính bột trợ lọc 25 2.5.6 Xác định khả sinh trưởng phát triển vi sinh vật phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD) 26 2.5.7 Xác định đường phương pháp Graxianop ( Kali ferixianua) 27 2.5.8 Phương pháp sắc kí lớp mỏng TLC 28 Một số đặc tính hình thái chủng nấm men Moniliella từ sưu tập giống Viện Công nghiệp thực phẩm 31 3.2 Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men phù hợp với phát triển nấm men đen Moniliella 32 3.3 Đánh giá khả tích lũy đường Erythritol chủng nấm men Moniliella từ sưu tập 33 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng 35 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 35 3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ đường Glucose 36 3.4.3 Ảnh hưởng tỉ lệ giống 38 3.4.4 Ảnh hưởng nồng độ yeast extract 39 3.4.5 Ảnh hưởng muối vô 40 3.4.6 Ảnh hưởng loại vitamin 42 3.5 Ảnh hưởng yếu tố môi trường khác 42 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả thu dịch lên men 42 3.5.2 Ảnh hưởng pH tới trình lên men 44 3.5.3 Ảnh hưởng thời gian lên men 45 3.5.4 Ảnh hưởng điều kiện lắc 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chủng nấm men đen Moniliella phân lập trung tâm vi sinh – Viện Công nghiệp thực phẩm năm 2010 [1] Error! Bookmark not defined Bảng 1.2 Bảng hàm lượng chất khoáng cần cho nấm men.Error! Bookmark not defined Bảng 2.1 Một số chủng nấm men Monlilella từ sưu tập giống Viện Công nghiệp Thực phẩm Error! Bookmark not defined Bảng 3.1 Kết đo OD (bước sóng 610nm) số chủng nấm men đen Moniliella lên men môi trường GYU 20 YM bổ sung 20% Glucose.Error! Bookmark no Bảng 3.2 Kết kiểm tra thông số chủng nấm men Moniliella sau ngày lên men môi trường GYU 20 Error! Bookmark not defined Bảng 3.3 Kết kiểm tra thông số liên quan số chủng nấm men sau ngày nuôi cấy nguồn cacbon khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella nồng độ đường Glucose khác nhau.Error! Bookmark not defined Bảng 3.5 Kết đo OD (bước sóng 610nm) chủng nấm men đen Moniliella tỉ lệ giống khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.6 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella nồng độ yeast extract khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.7 Kết thông số liên quan chủng nấm men đen môi trường GYU 20 có bổ sung số loại muối khống khác nhau.Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện lên men có bổ sung loại vitamin khác nhau.Error! Bookmark not de Bảng 3.9 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện nhiệt độ lên men khác nhau.Error! Bookmark not defined Bảng 3.10 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella giá trị pH khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.11 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện lắc khác Error! Bookmark not defined SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var suavedens nuôi cấy đĩa thạch Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Hình ảnh bào tử nấm men Moniliela quan sát kính hiển vi.Error! Bookmark not defined Hình 1.3 Hình ảnh sinh sản nảy chồi nấm men đen[3].Error! Bookmark not defined Hình 1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tốc độ sinh trưởng vi sinh vật (Theo sách Prescott, Harley Klein) Error! Bookmark not defined Hình 1.5 Tốc độ sinh trưởng nấm men phụ thuộc vào thời gian lên men.Error! Bookmark not Hình 1.6 Hình ảnh tinh thể đường Erythritol Error! Bookmark not defined Hình 1.7 Độ lấy Sucrose làm chuẩn Error! Bookmark not defined Hình 1.8 Quá trình sinh tổng hợp erythritol vi khuẩn nấm men [20].Error! Bookmark not def Hình 1.9 Sự tạo thành Erythritol sản phẩm khác đường Pentose phosphate[19] 20 Hình 2.1 Máy đo độ hấp thụ quang loại ống Error! Bookmark not defined Hình 2.2 Hình ảnh chạy sác kí mỏng TLC [17].Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Hình ảnh chủng nấm men Moniliella TBY 2038.1 lưu trữ ngắn hạn nuôi cấy đĩa thạch Error! Bookmark not defined Hình 3.2 Hình ảnh tế bào số chủng nấm men đen Moniliella soi kính hiển vi độ phóng đại 40X Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Bản phân tích TLC sản phẩm dịch lên men chủng nấm men Moniliella sau ngày Error! Bookmark not defined Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nguồn cacbon.Error! Bookmark not Hình 3.5 Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ đường Glucose Error! Bookmark not defined Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào tỉ lệ giống.Error! Bookmark not defin Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ yeast extract… Error! Bookmark not defined Hình 3.8 Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nhiệt độ.Error! Bookmark not defined Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào pH.Error! Bookmark not defined Hình 3.10 Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào thời gian lên men.Error! Bookmark n SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển không ngừng khoa học – công nghệ, đời sống người ngày nâng cao, mối quan hệ thực phẩm sức khỏe ngày quan tâm Yêu cầu người tiêu dùng thực phẩm có nhiều thay đổi Nếu lúc trước đặt vấn đề hàng đầu hàm lượng dinh dưỡng cao, khả cung cấp nhiều lượng u cầu với thực phẩm có nhiều thay đổi, thay đổi đa dạng nhóm đối tượng đa dạng nhu cầu chức với nhóm thực phẩm Đã có nhiều người chuyển hướng tìm cho loại thực phẩm khơng có có dinh dưỡng, loại thực phẩm thấp lượng Một số khác lại có nhu cầu sử dụng thực phẩm để phòng chữa bệnh Thực phẩm chức đời từ Thực phẩm chức định nghĩa loại thực phẩm có chứa hoạt tính sinh học có khả phòng chống bệnh tật, tăng cường sức khỏe dựa sở trình dinh dưỡng Đường chức phận quan trọng nhóm thực phẩm chức năng, tập trung nghiên cứu nhiều năm gần có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như: chống béo phì, tiểu đường, sâu răng, kích thích tiêu hóa… Trong Erythritol nhà nghiên cứu ý sản xuất phương pháp lên men từ vi sinh vật, sản phẩm có nhiều đặc tính ưu việt, có hương vị thơm ngon đường kính saccarose, mát, lại có nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe đặc biệt thấp lượng loại đường khác [10] Đường Erythritol tích lũy nhiều nhóm vi sinh vật khác thực vật, vi khuẩn, nấm men… Với đặc tính phù hợp khả sinh sản nhanh điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, phát triển dạng đơn bào mơi trường lỏng, kích thước lớn, thuận lợi cho cơng nghệ thu hồi sản phẩm…nấm men đen Moniliella đối tượng ý khai thác trình sản xuất đường Erythritol Trong lên men yếu tố định đến hiệu suất trình tối ưu hóa kiện len men làm tăng khả sinh trưởng nấm men nhiệm vụ quan trọng hàng đầu Xuất phát từ thực tế trên, đề tài tốt SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH nghiệp với tên gọi “Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển chủng nấm men Moniliella có khả sinh tổng hợp đường Erythritol ” đời SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Nấm men đen Moniliella 1.1.1 Giới thiệu chung nấm men đen Moniliella Con người biết đến nấm men đen vào khoảng cuối kỉ XIX Là nhóm phân loại khơng đồng nhất, thành tế bào có melanine sinh sản phương thức nảy chồi Tuy nhiên, nấm men đen loại nấm khó để nhận dạng Vì hiểu biết chúng cịn chưa hồn chỉnh Nấm men đen Moniliella chi đặc biệt mặt phân loại tiến hóa giới nấm có ý nghĩa quan trọng mặt kinh tế Moniliella nhóm đối tượng đặc biệt quan tâm hiệu suất chuyển hóa đường để tạo Erythritol tương đối cao, nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm có lợi sử dụng quy mô công nghiệp Nổi bật chi Moniliella loài Moniliella pollinis, sử dụng nhiều nước giới Mỹ, Đức, Nga để sản xuất Erythritol quy mô công nghiệp Chi Moniliella lần miêu tả năm 1996 với loài M.acetoabutens M.tomentosa (Stolk Dakin, 1996) [2] 1.1.2 Lịch sử tìm kiếm phân loại Chi Moniliella lần miêu tả năm 1966 với hai loài M.acetoabutens M.tomentosa (Stolk & Dakin, 1966) Tiếp theo hai loài M.suaveolens M.mellis, miêu tả von Arx(1972) Rao & de Hoog(1975) Sau tổ hợp Moniliella pollinis đề nghị cho M.tomentosa var pollinis dựa khác biệt đáng kể thành phần G+C (De Hoog & Gueho, 1984).Năm 2009, Rosa cộng cho Moniliella Trichosporonoides (Haskins & Spencer, 1967) xếp vào chi bốn tổ hợp loài M.megachiliensis, M.nigrescens, M oedocephalis, M.spathulata loài M.fonsecae đề nghị (Rosa et al, 2009).Gần đây, ba lồi cơng bố M.carnis, M.dehoogii (Thanh et al, 2012) M.byzovii (Thanh et al,2013).Tới chi Moniliella chứa 12 loài sau: - Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin - Moniliella byzovii Thanh,Hien & Thom - Moniliella carnis Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance - Moniliella dehoogii Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH - Moniliella fonsecae Rosa, Nakase, Jindamorakot, Limtong, Lachance, FidalgoJimenz, Daniel, Pagnocca, Inacio & Morais - Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance - Moniliella mellis Rao & dehoog - Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance - Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance - Moniliella pollinis De Hoog & Gueho - Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance - Moniliella suaveolens von Arx Moniliella bao gồm nhiều loài với hình dáng kích thước đa dạng Vì vậy, q trình phân loại thường gặp khó khăn Trong năm gần nhóm nghiên cứu mơn vi sinh Viện công nghệ thưc phẩm nghiên cứu phân lập nấm men từ hoa, ong, thực phẩm dụng cụ chế biến thực phẩm Trong nhiệm vụ này, nhóm tác giả kiểm tra khả sinh polyol, đặc biệt Erythritol chủng thu thập được[2],[3],[18] Bảng 1.1 Một số chủng nấm men đen Moniliella phân lập trung tâm vi sinh – Viện Công nghiệp thực phẩm năm 2010 [1] STT Kí hiệu mẫu Địa điểm thu thập TBY 211-2 Chợ Trường Yên, Ninh Bình TBY 325 Mỗ Lao, Hà Đơng TBY 217 Chợ Trường Yên, Ninh Bình TBY 372 Viện CNSH XTY 108 Trường Yên, Ninh Bình TBY121 Viện công nghiệp thực phẩm TBY30-1 Cù lao Chàm, Quảng Nam TBY 368-2 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn TBY342 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn 10 TBY 78 Trường Yên, Ninh Bình 11 TBY 76 Trường Yên, Ninh Bình 12 TBY 83 Trường Yên, Ninh Bình SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH 13 TBY38-8 Trường Yên, Ninh Bình 14 TBY388-3 Chợ n Phúc, Hà Đơng 15 TBY 367 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn 16 TBY 384-2 Chợ Vạn Phúc, Hà Đông 17 TBY 385-3 ChợVạn Phúc, Hà Đông 18 TBY370-1 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn 19 TBY202-2 Chợ Đông Kinh, Lạng Sơn 20 TBY 201-2 Trường Yên, Ninh Bình 21 TBY 388-2 Trường Yên, Ninh Bình 22 TBY 368-1 Chợ Trường Yên, Ninh Bình 23 TBY 365-2 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn 24 TBY 38-4 Chợ Vạn Phúc, Hà Đơng 25 TBY237-1 Trường n, Ninh Bình 1.1.3 Đặc điểm hình thái sinh sản Moniliella Moniliella nấm men đen có khuẩn lạc hình trịn hầu hết cịn non có màu trắng cịn già chuyển sang màu xám đen, đen oliu màu xám hay xanh xám Tế bào có hình elip trụ, có lỗ vách Khuẩn ty phân nhánh, đường kính 2-6μm, đứt gãy nhiều tạo thành đoạn ngắn[16] Hình 1.1 Hình ảnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var suavedens nuôi cấy đĩa thạch SV: Bùi Thị Thương K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào tỉ lệ cấp giống Giá trị OD TBY 2038.1 TBY 3425 0 0.5 1.5 2.5 3.5 Tỉ lệ cấp giống (%) Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào tỉ lệ giống Thông qua bảng số liệu 3.5 nhận thấy chủng TBY 2038.1 TBY 3425 phát triển tốt lên men ta cung cấp tỉ lệ giống 1% Nhiều hay dẫn đến việc cân nguồn dinh dưỡng lượng chủng giống khoảng thời gian lên men Điều phù hợp với nghiên cứu công bố Erin, Conner Cox, J.Burschapers,… 3.4.4 Ảnh hưởng nồng độ yeast extract Yeast extract nguồn dinh dưỡng phổ biến vi sinh vật Nó cung cấp axit amin, vitamin (vitamin B, Glutathione), 50-75% protein, 4-13% carbon hydrate, muối cho nấm men phát triển Tuy nhiên việc bổ sung với liều lượng khác mang lại hiệu khác kích thích hay ức chế q trình sinh tổng hơp, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa nồng độ yeast extract lên men chủng lựa chọn Kết thúc trình lên men ta tiến hành xác định thơng số liên quan pH, OD Kết thể bảng 3.6 SV: Bùi Thị Thương 39 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Bảng 3.6 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella nồng độ yeast extract khác Nồng Giá trị pH Giá trị OD độ (%) Ban đầu TBY 2038.1 TBY 3425 TBY 2038.1 TBY 3425 0.5 6.1 5.4 5.5 3.7 3.38 1.0 6.4 5.3 5.6 4.57 3.98 1.5 5.9 4.7 4.9 4.46 3.84 Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ yeast extract Giá trị OD TBY 2038.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 Nồng độ yeast extract (%) Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ yeast extract Nhìn vào bảng số liệu đồ thị ta thấy nồng độ yeast extract 1% phù hợp cho phát triển chủng tiềm nghiên cứu Tại điều kiện mật độ tế bào đạt giá trị cao Khi tế bào phát triển mạnh trình trao đổi chất sản sinh chất trình lên men làm tăng nồng độ axid môi trường Môi trường vi sinh vật phát triển mạnh pH giảm mạnh Điều phù hợp với kết nghiên cứu chúng tơi Ví dụ TBY 2038.1 mơi trường lên men có nồng độ yeast extract 1%, pH giảm 1.1 giá trị OD đạt 4.57 nồng độ yeast extract 0.5%, pH giảm 0.7 giá trị OD đạt 3.7 3.4.5 Ảnh hưởng muối vô Muối khống ngun tố vi lượng có vai trị quan trọng trình lên men vi sinh vật Mặc dù chi phí cho nguồn khống cho lên men vi sinh vật nhỏ SV: Bùi Thị Thương 40 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH loại muối thường rẻ lượng dùng lại ít, lợi ích mà chúng mang lại lớn, đặc biệt trình sinh tổng hợp enzyme Theo tài liệu công bố cho thấy, loại muối như: MgSO4, KH2PO4, CaCl2, ZnSO4, NaCl,…hay sử dụng Để lựa chọn loại muối cần thiết thích hợp cho q trình lên men chúng tơi làm thí nghiệm xét ảnh hưởng loại muối MgSO4, KH2PO4, CaCl2, ZnSO4 đến phát triển nấm men đen Moniliella Kết thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết thông số liên quan chủng nấm men đen mơi trường GYU 20 có bổ sung số loại muối khoáng khác Giá trị pH Thành phần muối vô Giá trị OD Ban TBY TBY TBY TBY đầu 2038.1 3425 2038.1 3425 MgSO4.7H2O (0,1%) 6.4 5.1 5.2 2.94 3.56 KH2PO4 (0,1%) 6.1 4.8 4.7 4.04 2.71 CaCl2 2H2O (0,1%) 6.3 5.3 5.2 3.55 3.28 ZnSO4.7H2O (0,1%) 6.2 5.6 5.4 1.42 2.27 6.4 5.5 5.3 3.06 2.26 Không bổ sung muối Các loại muối vô lựa chọn bổ sung vào môi trường muối trung tính có tính axit nhẹ nên khơng làm thay đổi nhiều độ pH ban đầu môi trường, pH ban đầu môi trường khảo sát nằm khoảng từ 5,9 đến 6.4 Sau kkhi lên men pH dịch lên men có giảm nhẹ khơng đáng kể nằm khoảng từ 4,7 đến 5,6 khoảng pH phù hợp với sinh trưởng phát triển nấm men Moniliella theo nghiên cứu Sang Yong Kim, Deok Kun Oh, Bong Soo Noh, Soo Ryun Jung, Kyung Ah Kim,… Nhìn vào bảng số liệu ta thấy nguồn muối vô không làm ảnh hưởng lớn tới trình phát triển nấm men KH2PO4 CaCl2.2H2O muối nấm men phát triển tốt nhiên chênh lệch không lớn nên việc bổ sung SV: Bùi Thị Thương 41 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH nguồn muối vô cho chủng tiềm TBY 2038.1 TBY 3425 không cần thiết 3.4.6 Ảnh hưởng loại vitamin Mỗi lồi vi sinh vật nói chung nấm men nói riêng có nhu cầu nguồn vitamin khác Có loại sử dụng vitamin loại chất kích thích sinh trưởng, có loại lại chất kìm hãm sinh trưởng Trong trình nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men chủng TBY 2038.1 TBY 3425 bổ sung số loại vitamin vào tài nghiên cứu Makoto Mtsubishi Chem để đánh giá khả sinh trưởng Kết chúng tơi tóm tắt bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện lên men có bổ sung loại vitamin khác Giá trị OD Các loại vitamin TBY 2038.1 TBY 3425 B1 50mg/l 2.78 3,98 B2 50mg/l 4.26 4.66 Biotin 20mg/l 2.64 4.14 Không bổ sung vitamin 4.06 3.72 Từ bảng số liệu cho thấy, bổ sung số loại vitamin B1, B2, Biotin kích thích TBY 3425 phát triển vượt bậc Cịn chủng TBY 2038.1 thích nghi với mơi trường có bổ sung nguồn vitamin 3.5 Ảnh hưởng yếu tố môi trường khác 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả thu dịch lên men Nhiệt độ ảnh hưởng lớn tới trình lên men Mỗi vi sinh vật lại có khoảng nhiệt độ mà phát triển đạt mạnh Dựa tài liệu liên quan cơng bố nấm men đen thường phát triển tốt từ 28-30oC, chúng tơi tiến hành thí nghệm kiểm tra ảnh hưởng nhiệt độ đến chủng TBY 2038.1 TBY 2425 ngưỡng xung quanh 25oC, 28oC, 30oC, 35oC, 40oC Đánh giá khả sinh trưởng thông qua mật độ tế bào cách tiến SV: Bùi Thị Thương 42 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH hành đo độ hấp thụ quang bước sóng 610nm Kết thể bảng 3.9 hình 3.8 Bảng 3.9 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện nhiệt độ lên men khác Nhiệt độ (oC) Giá trị OD TBY 2038.1 TBY 3425 25 1.77 1.54 28 3.51 3.38 30 4.33 3.36 35 2.61 2.07 40 0.87 0.96 Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nhiệt độ Giá trị OD 25 28 30 35 40 Tên chủng ( 1.TBY 2038.1 2.TBY 3425 ) Hình 3.8 Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nhiệt độ Nhìn vào bảng số liệu 3.9, ta thấy: Chủng TBY 2038.1 lên men 30oC hiệu suất đạt cao gấp 4.98 lần 40oC 2.45 lần 25oC, TBY 3425 lên men 30oC hiệu suất đạt cao gấp 3.5 lần 40oC 2.18 lần 25oC Kết phân tích cho thấy chủng lựa chọn TBY 2038.1 TBY 3425 giống nấm men khác phát triển tốt ngưỡng nhiệt từ 28-30oC Ngoài khoảng nấm men chậm phát triển sinh khối giảm dần Khoảng nhiệt SV: Bùi Thị Thương 43 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH 3.5.2 Ảnh hưởng pH tới q trình lên men Trong thực tế pH mơi trường quan trọng với trình độ hấp thụ chất dinh dưỡng tế bào, hoạt động hệ thống Enzyme tham gia vào tổng hợp protein, tạo vitamin Vì loại vi sinh vật có khả sinh trưởng khoảng pH mơi trường thích hợp nên để lựa chọn mơi trường pH tối thích tiến hành khảo sát giá trị pH môi trường ban đầu khác từ 3-8 hai chủng lựa chọn TBY 2038.1 TBY 3425 Kết đánh giá thông qua mật độ tế bào cách kết thúc trình lên men ta đo độ hấp thụ quang bước sóng 610nm thể bảng 3.10 Giá trị pH ban đầu ta đo 6.5 Bảng 3.10 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella giá trị pH khác Giá trị pH pH Giá trị OD TBY 2038.1 TBY 3425 TBY 2038.1 TBY 3425 3.0 2.6 2.8 1.85 1.51 4.0 3.9 3.3 2.7 2.28 4.5 5.1 5.4 2.89 2.4 5.0 5.1 5.5 3.02 2.52 5.5 4.1 5.4 3.78 2.49 6.0 4.2 5.3 4.26 3.37 6.5 4.9 5.0 4.33 3.36 7.0 5.4 5.4 3.1 2.63 8.0 5.3 5.5 1.86 1.32 Dựa vào bảng số liệu 3.10 tiếp tục thể giá trị OD thông qua dạng biểu đồ SV: Bùi Thị Thương 44 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào pH Giá trị OD TBY 2038.1 TBY 3425 0 10 Giá trị pH Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào pH Nhìn vào bảng số liệu đồ thị ta nhận thấy điều kiện pH thấp ( pH 3) chủng lựa chọn phát triển kém, giá trị OD đo với chủng TBY 2038.1 đạt 1.85, TBY 3425 1.51 Khi pH mơi trường tăng lên nấm men thích nghi tốt hơn, đến giới hạn pH đạt 6.5 Ngồi ngưỡng này, tức mơi trường kiềm trung tính q trình phát triển dần chậm lại Cũng giống loại nấm men khác chủng nấm men đen Moniliella TBY 2038.1 TBY 3425 phát triển tốt khoảng pH 5.5-6.5 Giá trị pH gần pH môi trường ban đầu điều kiện thuận lợi giúp hạn chế khâu điều chỉnh pH lên men 3.5.3 Ảnh hưởng thời gian lên men Đối với loại vi sinh vật khác thời gian ni cấy có ảnh hưởng khác đến đường tăng sinh trưởng chúng Với loại vi sinh vật thu nhận sinh khối chất tiết ngoại bào canh trường việc khảo sát thời gian lên men quan trọng việc thu nhận sản phẩm cụ thể Chính đề tài sâu khảo sát khả sinh trưởng hai chủng nấm lựa chọn để xác định thời gian nuôi cấy phù hợp Các chủng nấm sau cấy vào môi trường dinh dưỡng gồm 20% glucose, 1% cao nấm men, 0,1% urê cho lên men điều kiện nhiệt độ 30oC, lắc 150 vòng/phút với khoảng thời gian khác sau ngày, ngày, ngày, ngày, ngày, ngày Canh trường sau lên men mang đo OD để xác định mật SV: Bùi Thị Thương 45 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH độ tế bào sinh khối thu nhận Tốc độ sinh trưởng chủng giống trình lên men xác định cách đo mật độ quang bước sóng 610nm Kết thu thể bảng 3.11 hình 3.10 Bảng 3.11 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện thời gian lên men khác Đường glucosecịn sót Thời Giá trị pH gian Giá trị OD (%) TBY TBY TBY TBY TBY 2038.1 2425 2038.1 2425 2038.1 5.8 5.9 1.81 1.31 16.07 18.75 5.6 5.7 3.52 2.81 14.06 15.07 5.6 5.6 4.12 3.57 11.25 12.5 5.2 5.4 4.7 4.06 10.23 11.54 5.3 5.5 4.43 3.84 9.38 10.23 5.4 5.6 4.0 3.41 8.82 9.78 (ngày) TBY 2425 Từ bảng số liệu thể giá trị OD dạng đồ thị Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào thời gian Giá trị OD TBY 2038.1 TBY 3425 0 Thời gian (ngày) Hình 3.10 Biểu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào thời gian lên men SV: Bùi Thị Thương 46 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH Nhìn vào đồ thị kết thống kê bảng ta thấy thời gian phát triển chủng TBY 2038.1 TBY 2425 dài khoảng tuần Bắt đầu sang ngày thứ sinh khối tăng dần đạt cực đại ngày thứ chu kì lên men (TBY 2038.1 giá trị OD đạt 4.7, TBY 3425 đạt 4.06) sau lại giảm dần Lượng đường Glucose cịn sót thể mức độ chuyển hóa đường Glucose q trình lên men Thời gian lên men dài lượng đường chuyển hóa lớn có nghĩa đường glucose sót lại Kết phân tích phù hợp với thực tế (được thể bảng 3.11 hình 3.10) 3.5.4 Ảnh hưởng điều kiện lắc Trong trình lên men vi sinh vật cần nguồn dinh dưỡng lớn để sinh trưởng Đặc biệt với nấm men đen, trình lên men hiếu khí tạo nhiều lợi cho việc sinh tổng hợp đường Chính việc lắc trộn làm cho vi sinh vật tiếp xúc môi trường dinh dưỡng tốt hơn, tăng lượng oxi hịa tan dịch mơi trường giúp nâng cao hiệu suất trình Để kiểm chứng chúng tơi tiến hành thí nghiệm với mơi trường lên men giống nhau, thí nghiệm lên men khơng có lắc thí nghiệm có lắc 150 vịng/phút Kết chúng tơi thể bảng 3.12 Bảng 3.12 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện lắc khác Giá trị OD Lắc (vịng/phút) Glucose cịn sót (%) TBY 2038.1 TBY 3425 TBY 2038.1 TBY 3425 3.18 2.83 12.5 13.23 150 4.8 4.2 10.23 10.89 Thông qua bảng số liệu ta thấy có lắc trộn mật độ tế bào tăng lên rõ rệt, với lượng đường Glucose cịn sót lại giảm theo Cụ thể là: chủng TBY 2038.1 giá trị OD tăng từ 3.18 lên 4.8, lượng đường sót giảm 2.27% TBY 3425 giá trị OD tăng từ 2.83 lên 4.2, lượng đường sót giảm 2.34% So sánh với tài liệu cơng bố kết hồn tồn phù hợp Vì q trình lên men việc lắc trộn cần thiết SV: Bùi Thị Thương 47 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH SV: Bùi Thị Thương 48 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau kết thúc thí nghiệm, vào kết trình bày phần III, chúng tơi rút kết luận sau: • Thơng qua trình lên men ta xác định yếu tố mơi trường ảnh hưởng tối ưu hóa chúng + Nhìn chung nấm men đen Moniliella chuyển hóa đường Glucose thành Erythritol tốt tốt nồng độ đường 40% + Môi trường lên men tối thích GYU40 + Tỉ lệ cấp giống phù hợp q trình lên men 1% • Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng mơi trường bên ngồi đến hiệu suất q trình lên men + Nhiệt độ: 28-30oC + pH: 5.5-6.5 + Thời gian lên men: ngày + Trong trình lên men có khuấy lắc hiệu suất đạt cao • Lựa chọn Moniliella byzovii TBY 2038.1 cho hiệu suất lên men chuyển hóa tạo đường Erythritol cao để tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu để hoàn thành đề tài Kiến nghị Do đề tài mở nhiều hướng nghiên cứu Việt Nam điều kiện thời gian nghiên cứu chưa tuyển chọn thêm chủng giống men đen cho hiệu suất lên men tạo đường Erythritol cao việc xây dựng quy trình lên men khóa luận cịn chưa hồn thiện Đặc biệt q trình lọc dịch lên men, chúng tơi tiến hành lọc thơ than hoạt tính bột trợ lọc nên độ tinh chưa cao, nhiều tap chất chạy TLC chưa thật rõ ràng Do điều kiện trang thiết bị chưa tốt nên chúng tơi khơng tiến hành định lượng xác lượng đường Erythritol tạo thành phương pháp HPLC mà tiến hành chạy TLC xác định lượng đường Glucose cịn sót Vì tơi xin đưa số đề xuất sau: SV: Bùi Thị Thương 49 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH • Tiếp tục tuyển chọn tìm chủng nấm men có khả lên men tạo đường Erythritol cho hiệu suất cao • Kết thúc trình lên men tiến hành định lượng đường Erythritol phương pháp HPLC • Tiến hành xây dựng quy trình lên men quy mô công nghiệp SV: Bùi Thị Thương 50 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: 1.Vũ Nguyên Thành Bảo tồn lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm, 12/ 2010 Bảng Trang 34 Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương.Tuyển tập vi sinh vật học.11/07/2006 Nguyễn Lân Dũng Phân loại nấm men Nguyễn Thị Thu Huyền Đồ án công nghệ thực phẩm Nguyễn Đức Lương Công nghệ vi sinh vật tập NXB Đại học Quốc gia TP HCM, 2000 Lương Đức Phẩm Nấm men công nghiệp NXB KHKT Hà Nội, 2005 Vũ Thị Hoa Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất đường chức Xylooligosacarit từ lõi ngô quy mô xưởng thực nghiệm Khóa luận tốt nghiệp, Viện Đại Học Mở Hà Nội, 2010 Nguyễn Văn Lực, Nguyễn Văn Công, Nguyễn Trung Dũng, Thin-Layer chromatography gas chromatography Nguyễn La Anh Nghiên cứu công nghệ sản xuất chất bảo quản sinh học Bacterioxin phương pháp vi sinh có ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm Viện Cơng nghiệp thực phẩm, Hà Nội, 2010 10.Trịnh Thị Kim Vân Đường fructooligosaccarit-đặc tính chức ứng dụng 11.Trần Thị Châu Hồn thiện cơng nghệ xử lý nước phương pháp công nghệ sinh học dung cho sản xuất rượu vang chất lượng cao 2005 12 Đinh Thị Kim Nhung Ảnh hưởng số yếu tố đến trình lên men Táo mèo (Docynia indica) Tạp chí khoa học công nghệ, tập 45, số 2, 2007 Tr 8792 13 Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương Thí nghiệm xác định nhu cầu vitamin cho sinh trưởng nấm men 11/07/2006 14 Hoàng Khánh Hồng Định lượng vi sinh vật phương pháp đo mật độ quang 18/6/2011 15.Trần Thị Thúy Liễu, Trần Thị Thu Hà Đồ án môn học công nghệ thực phẩm SV: Bùi Thị Thương 51 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH 16 Nguyễn Thị Hà, Trần Thị Hồng, Nguyễn Thị Thanh Nhàn, Đỗ Thị Cẩm Vân, Lê Thị Thu Yến Nghiên cứu khả hấp thụ số kim loại nặng (Cu2+, Pb2+ , Zn2+ ) nước nấm men Saccharomyces cerevisiae Tạp chí Khoa học ĐH Quốc Gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23 2007 Tr 99-106 Tài liệu nước ngoài: 17 Gholam Ghezelbash ; Iraj Nahvi 1, * ; And Mohammad Rabbani Study of polyols production by Yarrowia lipolytica in batch culture and optimization of growth condition for maximum production 18 Dooms L, Hennebert G.L, Verachtert H (1971) Polyol synthesis and taxonomic characters in the genus Miniliella, Antoni van Leeuwenhoek, 37 Trang 107-118 19 J Burschapers, D Schustolla, K Schugerl, H Roper J.C.Troostembergh Engineering aspects of the production of sugar alcohols with the osmophilic yeast Moniliella tomentosa var pollinis Part I Batch and fed-batch operation in stirred tank,tháng 2/2002 Trang 498 20 Hee- Jung Moon, MarimuthuJeya In- Won Kim Biotechnological production of erythritol and its applications.Tháng 2/ 2010 Trang 1019 21 Erin, Connor Cox, Ingledew Elleviation of the effects of nitrogen limitiation in high gravity worts through increased inoculation 1999 22 Kurtzman C P., Fell J W “The Yeasts a Taxonomic Study”, Elsvier Science Publishers 1998 23 B1 0,005%.Patent: US 005902739A, Method of producing Erythritol (Table 4) 24 Sang Yong Kim, Deok Kun Oh, Bong Soo Noh, Soo Ryun Jung, Kyung Ah Kim Fermentation process for preparing erythritol using mother liquor produced from purification process of palatinose US 6270815 B1 2001 25 Лысах В.В Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов / Лысах В.В., Желадкова Р.А // Мн.: БГУ, 2002 – 100 с 26 Laxman S S., Ramchandra V G., Bhalchandra K V., Narayanan K Strain improvement and statistical media optimization for enhanced erythritol production with minimal by-products from Canida magnoliae mutant R23”, Biochemical Engineering Journal Vol55 2011 SV: Bùi Thị Thương 52 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH 27.Mhairi Workman, Philippe Holt, Jette Thykaer Comparing cellular performance of Yarrowia lipolytica during growth on glucose and glycerol in submerged cultivations 2013 Nguồn internet 28 http://vietnamese.alibaba.com/product-gs/erythritol-99 1004418155.html 29 http://quoctenamgiang.blogspot.com/2010/01/disodium-succinate.html 30.http://www.caysua.com/qua-trinh-pentozophotphat-pentose-phosphate-pathway/ 31 http://ijs.sgmjournals.org/content/59/2/425.full 32.http://vietnamese.alibaba.com/product-gs/erythritol-99 1004418155.html 33 http://www.erythritol-erythritol.com/erythritol-specs.html SV: Bùi Thị Thương 53 K18-Lớp 11.03-KS.CNSH