Phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp có khả năng sinh tổng hợp rhamnolipid

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH I DANH MỤC BẢNG I CHỮ VIẾT TẮT III MỞ ĐẦU MỤC TIÊU: 1.1.VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT 1.2 PHÂN LOẠI CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC 1.3 TỔNG QUAN VỀ RHAMNOLIPID (RL) 1.3.1 Cấu tạo RL 1.3.2 Tính chất RL 1.3.3.Nguồn thu nhận RL 1.3.4 Cơ chế sinh tổng hợp RL 1.3.5 Khả ứng dụng RL 1.3.6 Cơ chế diệt vi sinh vật RL 10 1.3.7 Các phương pháp xác định khả sinh RL vi sinh vật 12 1.4 Tổng quan vi khuẩn Pseudomonas sp 15 1.5 Kit API 20 NE 16 2.1 VẬT LIỆU 18 2.1.1 Đối tượng 18 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 18 2.1.4 Môi trường 19 2.2.1 Lấy mẫu 20 2.2.2 Phân lập chủng Pseudomonas sp 20 2.2.3 Bảo quản Pseudomonas sp 21 2.2.4 Tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh chất hoạt động bề mặt 21 2.2.5 Thu nhận RL từ dịch lên men 22 2.2.6 Định lượng RL 22 2.2.7 Xác định đặc điểm hình thái Pseudomonas sp 25 Vũ Hương Linh Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.2.8 Định danh phản ứng sinh hóa 26 3.1 Phân lập chủng Pseudomonas sp từ mẫu nước thải đất 28 3.2 Lựa chọn phương pháp định tính RL 31 3.3 Khảo sát khả sinh tổng hợp RL từ chủng Pseudomonas sp phânlập 32 3.4 Xác định hàm lượng RL từ chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 37 3.4.1 Xây dựng đường chuẩn rhamnose 37 3.4.2 Xác định hàm lượng RL chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 39 3.5 Đặc điểm chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 41 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Vũ Hương Linh Lớp: CNSH-1103 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc RL Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp RL từ Pseudomonasputida Hình 1.3.A Biểu đồ ly giải bào tử động 11 Hình 1.3.B Màng tế bào bào tử động giống thành phần phân tử màng tế bào với phân tử RL 11 Hình 1.3.C Cơ chế phân giải bào tử động RL 11 Hình 1.4 Phương pháp đổ giọt định tính định lượng RL 12 Hình 1.5 Phương pháp đẩy dầu cho định tính chủng P aeruginosa sinh chất hoạt động bề mặt (Sneha et al., 2012) 13 Hình 1.6 Xác định hoạt tính nhũ hóa chất hoạt động bề mặt từ chủng Pseudomonas sp MW2 14 Hình 1.7 Xác định khả sinh chất hoạt động bề mặt phương pháp thạch CTAB 15 Hình 1.8 Đặc điểm hình thái chủng Pseudomonas 16 Hình 2.1 Quy trình tuyển chọn Pseudomonas sp.có khả sinh tổng hợp RL 20 Hình 3.1 Giữ giống chủng Pseudomonas sp 31 Hình 3.2 Kết khảo sát khả sinh RL chủng Pseudomonas sp 36 Hình 3.3 Khả tạo RL chủng Pseudomonas sp phương pháp đẩy dầu 37 Hình 3.4 Khả nhũ hóa RL từ chủng Pseudomonas sp 37 Hình 3.5 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan OD490nm lượng rhamnose 38 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 41 Hình 3.7 Hình thành sắc tố chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 42 Hình 3.8 Kết định danh chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 kit API 20 NE 43 Hình 3.9 Kết định danh chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 kit API 20NE sau chạy phần mềm apiweb 45 DANH MỤC BẢNG Vũ Hương LinhiLớp: CNSH-1103 Bảng 1.1 Phân loại CHHBMSH Bảng 1.2 Danh mục chất Kit API 20 NE 16 Bảng 2.1 Thành phần chất pha loãng thành dải nồng độ rhamnose 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng 24 Bảng 2.3 Đọc kết phản ứng sinh hóa kit API 20 NE 26 Bảng 3.1 Kết phân lập Pseudomonas sp từ mẫu đất nước 29 Bảng 3.2 Khả sinh tổng hợp RL chủng Pseudomonas sp phân lập 33 Bảng 3.3 Tổng hợp khả sinh RL chủng Pseudomonas sp phân lập 34 Bảng 3.4 Sự phân bố củng Pseudomonas sp có khả sinh RL theo nguồn phân lập 36 Bảng 3.5 Kết OD490 theo lượng rhamnose 38 Bảng 3.6 Kết xác định hàm lượng RL từ chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 39 Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn chất chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 43 Bảng 3.8 Sự khác chủng Pseudomonas HW20 Pseudomonas HS5 44 Vũ Hương LinhiiLớp: CNSH-1103 CHỮ VIẾT TẮT MIC: minimal inhibition concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) g/l: gam/lít Vũ Hương LinhiiiLớp: CNSH-1103 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) số sản phẩm quan trọng ngành công nghiệp hóa học Hàng năm, tồn giới, sản xuất trung bình khoảng 10 triệu lợi nhuận thương mại chúng ước tính đạt 9,4 tỉđơ la Mỹ Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) ứng dụng nhiều lĩnh vực sản xuất sống Tuy nhiên, CHHBMHH lại không tự phân hủy nguy gây nhiễm mơi trường Do đó, cần có nghiên cứu để tìm chất thay CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010) Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG – Từ đến nay, CHHBMSH tập trung nghiên cứu nhiều chúng có ưu điểm khơng gây độc khả tự phân hủy cao khơng gây nhiễm môi trường Rhamnolipids (RL) CHHBMSH biết đến nhiều RL có nhiều tính chất ưu việt 1/ hoạt tính bề mặt 2/ khả nhũ hóa 3/ khả chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối lực ion biến đổi rộng 4/ khả bị phân hủy sinh học 5/ độc tính thấp 6/ khả diệt vi sinh vật Phythium, Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum Penicillium funiculosum, Klebsiella pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcusluteus (Haba et al., 2002, Luiz et al., 2012) Các vi sinh vật có khả tổng hợp RL Pseudomonas, Burkholdera, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter Trong số vi sinh vật sinh tổng hợp RL Pseudomonas sp nghiên cứu nhiều khả tạo RL với hoạt tính bề mặt tương đối cao, dễ lên men cho sản lượng cao so với vi sinh vật sinh khác Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả sinh tổng hợp rhamnolipid.” Vũ Hương Linh1Lớp: CNSH-1103 MỤC TIÊU: - Tuyển chọn 1-2 chủng Pseudomonas sp có khả sinh RL với sản lượng > 8g/l NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu thập mẫu đất nước nhiễm hydratcacbon cho phân lập chủng Pseudomonas sp - Phân lập chủng Pseudomonas sp từ mẫu thu thập - Bảo quản chủng Pseudomonas sp phân lập - Xác định phương pháp định tính chủng Pseudomonas sp sinh RL - Tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả sinh tổng hợp RL - Xây dựng đường chuẩn rhamnose - Định lượng RL từ chủng Pseudomonas sp tuyển chọn - Phân loại sơ chủng Pseudomonas sp tuyển chọn quan sát đặc điểm hình thái phân tích phản ứng sinh hóa kit API 20N PHẦN I TỔNG QUAN Vũ Hương Linh2Lớp: CNSH-1103 1.1.VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT Trong năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) số sản phẩm quan trọng ngành cơng nghiệp hóa học Hàng năm, tồn giới, sản xuất trung bình khoảng 10 triệu lợi nhuận thương mại ước tính đạt 9,4 tỉ la Mỹ Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) ứng dụng nhiều lĩnh vực sản xuất sống Người ta ước tính, thời gian thập kỷ qua, nhu cầu CHHBM tăng 300% ngành công nghiệp hóa chất Hoa Kỳ Tuy nhiên, CHHBM tổng hợp từ hóa học lại khơng tự phân hủy nguy gây nhiễm mơi trường Do đó, cần có nghiên cứu để tìm chất thay CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010) Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1 CHHBMSH hợp chất có cấu trúc đa dạng hoạt tính bề mặt tổng hợp vi sinh vật Tất CHHBMSH hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm nhóm ưa nước (thường phân tử đường amino acid) nhóm kị nước (thường acid béo) Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu hướng co cụm bề mặt mặt phân cách chất (có thể chất lỏng-chất lỏng, chất lỏng-chất rắn), kết làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng khơng khí) giảm sức căng chất (chất lỏng-chất lỏng chất lỏng-chất rắn) So với CHHBMHH CHHBMSH có nhiều ưu điểm hơn: 1/ có khả phân hủy sinh học; 2/ độc tính có độ độc thấp; 3/ có tính dung hợp sinh học tiêu hóa nên thường dùng mỹ phẩm, dược phẩm hay chí làm phụ gia thực phẩm; 4/ sản xuất có hiệu kinh tế (có thể sản xuất từ phụ phẩm cơng, nơng nghiệp); 5/ có tính đặc hiệu (các CHHBMSH dạng phức hợp chất hữu với nhóm chức đặc trưng nên thường có hoạt tính chuyên biệt); tính hiệu điều kiện cực đoan nhiệt độ, pH muối CHHBMSH thường ứng dụng xử lý môi trường (diệt vi sinh vật gây bệnh độc tố, phân hủy sinh học, giải độc, dùng xử lý ô nhiễm dầu ) (Lại Thúy Hiền, 2010) 1.2 PHÂN LOẠI CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC Không giống CHHBMHH thường phân loại theo chất nhóm phân cực, CHHBMSH phân loại dựa vào thành phần hóa học nguồn gốc vi sinh Vũ Hương Linh3Lớp: CNSH-1103 vật tạo Nhìn chung, CHHBMSH chia thành hai loại: CHHBMSH có khối lượng phân tử thấp gồm glycolipids (RL, SLs, MELs ), lipopeptid, photpholipid CHHBMSH khối lượng phân tử cao gồm chất cao phân tử CHHBM dạng hạt (thực phẩm nhũ tương biodispersan) Phần lớn CHHBMSH tích điện âm khơng tích điện, phần kỵ nước axit béo chuỗi dài dẫn xuất chúng phần ưa nước cacbohydrate, amino axit, phosphate peptide dạng vòng Bảng 1.1 Phân loại CHHBMSH CHHBMSH VI SINH VẬT TẠO RA Glycolipids Rhamnolipids Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas chlororaphis Trehalolipids Rhodococcus erthropolis Arthobacter sp Sophorolipids Candida bombicola Candida apicola Manosylerithritol lipids Candida antartica Lipopeptid Surfactin/Iturin/Fengycin Bacillus subtilis Viscosin Pseudomonas viscosa Lichenysin Bacillus licheniformis Serrawettin Serratia marcescens Phospholipid Actinobacter sp Corynebacterium lepus CHHBMSH có hoạt tính kháng sinh Brevibacterium brevis Gramicidin Bacillus polymyxa Polymixin Myxococcus xanthus Vũ Hương Linh4Lớp: CNSH-1103 Antibiotic TA Axit béo Corynomicolic axit Corynebacterium insidibaseosum CHHBMSH trùng hợp Emulsan Acinetobacter calcoaceticus Alasan Acinetobacter radioreistens Liposan Candida lipolytica Lipomanan Candida tropicalis CHHBMSH dạng hạt Vesicles Acinetobacter calcoaceeticus Whole microbial cells Cyanobacteria 1.3 TỔNG QUAN VỀ RHAMNOLIPID (RL) 1.3.1 Cấu tạo RL Rhamnolipids (RL) loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học biết đến nhiều RL có cấu trúc lưỡng cực với cực ưa nước cực kỵ nước, nhờ làm tăng khả tiếp xúc phân hủy hydrocacbon Trọng lượng phân tử RL nằm khoảng 306-704 g/mol RL thuộc nhóm glycolipids có cấu tạo từ đơn vị axit béo kỵ nước β-hydoxydecanoic liên kết với đơn vị L-rhamnose liên kết β-glycosidic hình thành nhóm ưa nước RL cấu tạo ba nguyên tố cacbon, nitơ, oxy RL có hai loại mono-rhamno-di-lipidic dirhamno-di-lipidic Cả hai loại có chứa hai đơn vị đường L-rhamnose hai đơn vị axit β-hydroxydecanoic (RL1 RL3) Mono-rhamno-di-lipidic dirhamno-di-lipidic có chứa hai đơn vị đường L-rhamnose đơn vị axit β-hydroxydecanoic (RL2 RL4) tạo điều kiện nuôi cấy xác định (Milena et al., 2012) Vũ Hương Linh5Lớp: CNSH-1103 Kết cho thấy 22/58 chủng khơng có khả sinh chất hoạt động bềmặt, chiếm 37,9%; ba mươi sáu chủng tổng số 58 chủng Pseudomonas sp thử nghiệm có khả sinh chất hoạt động bề mặt, chiếm 62,1%, đó: + Số chủng sinh RL với < ĐKVS ≤ cm 15/58 chủng, chiếm 25,9% + Số chủng sinh RL với < ĐKVS ≤ cm 16/58 chủng, chiếm 27,6% + Số chủng sinh RL với < ĐKVS ≤ cm 3/58 chủng, chiếm 5,2% + Số chủng sinh RL với ĐKVS > cm 2/58 chủng, chiếm 3,4% Khả sinh tổng hợp RL chủng khảo sát đa dạng, thể ĐKVS thay đổi từ 0,3 – cm Chủng sinh RL thấp HW1 HS20 với ĐKVS 0,3 cm Hai chủng sinh RL cao HS5 với ĐKVS 4cm HW20 với ĐKVS 3,5cm Chủng P.aeruginosa ATCC 39324 tạo RL với ĐKVS 2,8 cm, thấp so với chủng HS5 HW20 Chủng P.fluorescens VTCC B668 khơng có khả sinh RL Ba mươi sáu chủng có khả tạo vịng sáng thí nghiệm thay dầu, nhiên 27/36 chủng có phản ứng dương tính với thí nghiệm đổ giọt, 9/36 chủng có phản ứng âm tính thí nghiệm Điều lý giải thí nghiệm đẩy dầu có độ nhạy cao so với thí nghiệm đổ giọt việc định tính RL, phát RL nồng độ thấp (Noha et al., 2004; Ainon et al., 2013) Định tính RL cịn dựa khả nhũ hóa chất hoạt động bề mặt E24 Chỉ số nhũ hóa E24 cao khả tạo RL mạnh Kết cho thấy tất chủng thử nghiệm có khả nhũ hóa dầu, số E24 dao động từ 20% đến 67%, chủng HS5 HW20 có E24 cao nhất, tương ứng 67% 51% Bằng thí nghiệm đẩy dầu xác định E24, Mohammed cộng (2012) tuyển chọn 02 chủng có khả sinh RL cao P aeruginosa P.B.2 với E24 ĐKVS tương ứng 56,32% 5,733 cm; chủng P fluorescens P.V.10 với E24 ĐKVS tương ứng 56,443% 6,133cm Vũ Hương Linh35Lớp: CNSH-1103 3,4% 5,2% 37,9% khơng tạ tạo vịng sáng 27,6% < ĐKVS ≤ cm < ĐKVS ≤ cm < ĐKVS ≤ cm 25,9% ĐKVS KVS > cm Hình 3.2 Kết khảo kh sát khả sinh RL chủng Pseudomonas sp Chủng P.aeruginosa ATCC 36324 (bộ sưu tập giống Bộ môn Nghiên ccứu Công nghệ sinh họcc sau thu hoạch) ho có khả sinh RL, chủng ng P.fluorescens VTCC B668 (Bảo o tàng gi giống chuẩn, Viện Vi sinh vậtt Công ngh nghệ sinh học) không sinh tổng hợp p RL Trong số s 56 chủng Pseudomonas sp phân llập có khả sinh RL 20 chủng đư phân lập từ đất nhiễm xăng 15 chủủng phân lập từ nước thải nhà hàng ăn uố ống Bảng 3.4 Sự phân bố chủng ch Pseudomonas sp có khả ng sinh RL theo ngu nguồn phân lập Nguồn n phân lập l Số chủng Pseudomonas sp sinh RL/tổng số chủng ng phân llập Bộ sưu tập giống 1/1 Bảo tàng giống chuẩẩn 0/1 Đất nhiễm xăng 20/34 Nước thảii nhà hàng ăn ă uống 15/22 Vũ Hương Linh36Lớp: p: CNSH-1103 CNSH Hình 3.3 Khả tạo RL chủng Pseudomonas sp phương pháp đẩy dầu Hình 3.4 Khả nhũ hóa RL từ chủng Pseudomonas sp 3.4 Xác định hàm lượng RL từ chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 3.4.1 Xây dựng đường chuẩn rhamnose Đường chuẩn rhamnose thể mối quan hệ lượng rhamnose với giá trị OD490nm Đường chuẩn rhamnose xác định cách pha loãng dung dịch rhamnose với dải nồng độ từ 10 đến 50 µg/ml (bước nhảy 10 µg/ml) Hút 1ml rhamnose nồng độ pha loãng cho vào ống nghiệm, bổ sung 0,5ml dung dịch phenol 80% Ngay cho 2,5ml axit sulphuric đặc vào ống nghiệm Để ổn định 10 phút, sau lắc đặt 25oC 20 phút Đo độ hấp phụ bước sóng 490nm Kết thể bảng 3.5 Vũ Hương Linh37Lớp: CNSH-1103 Bảng 3.5 Kết OD490theo lượng rhamnose Lượng STT OD490nm rhamnose (µg/ml) 0,00 10 0,01 20 0,031 30 0,052 40 0,071 50 0,097 Từ kết OD thu lượng rhamnose, xử lý kết phần mềm Excel thu đồ thị chuẩn hàm hồi quy sau: 0.12 y = 0.028x - 0.019 R² = 0.997 OD 490 nm 0.1 0.08 0.06 OD 490 nm 0.04 0.02 10µg/ml 20µg/ml 30µg/ml 40µg/ml 50µg/ml Nồng độ Rhamnose (µg/ml) Hình 3.5 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan OD490nmvà lượng rhamnose Đường chuẩn có dạng tuyến tính, trải từ OD Đường chuẩn có phương trình y = 0,028x – 0,019; với hệ số tương quan R2> 99% Như mức độ liên kết giữ x y chặt chẽ, kết đo đáng tin cậy Trong đó, y độ hấp phụ OD bước sóng 490nm, x lượng rhamnose (µg) Vũ Hương Linh38Lớp: CNSH-1103 3.4.2 Xác định hàm lượng RL chủng Pseudomonas sp tuyển chọn Mười ba chủng Pseudomonas sp lên men môi trường mNB 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút 48 RL chiết xuất từ dịch lên men Kết xác định hàm lượng RL trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết xác định hàm lượng RL từ chủng Pseudomonas sp tuyển chọn STT Tên chủng OD490nm Lượng rhamnose Hàm lượng RL(g/l) (µg/ml) HS1 0,270 966,67 2,9 HS2 0,121 433,33 1,3 HS4 0,186 666,67 HS5 0,784 2800,00 8,4 HS6 0,233 833,33 2,5 HS8 0,289 1033,33 3,1 HS9 0,420 1500,00 4,5 HS11 0,242 866,67 2,6 HS13 0,224 800,00 2,4 10 HS14 0,261 933,33 2,8 11 HS17 0,224 800,00 2,4 12 HS20 0,121 433,33 1,3 13 HS22 0,112 400,00 1,2 14 HS23 0,158 566,67 1,7 15 HS26 0,205 733,33 2,2 16 HS28 0,242 866,67 2,6 17 HS29 0,214 766,67 2,3 18 HS30 0,177 633,33 1,9 19 HS32 0,168 600,00 1,8 20 HS34 0,270 966,67 2,9 21 HW1 0,112 400,00 1,2 22 HW3 0,149 533,33 1,6 23 HW4 0,205 733,33 2,2 Vũ Hương Linh39Lớp: CNSH-1103 24 HW6 0,168 600,00 1,8 25 HW7 0,494 1766,67 5,3 26 HW8 0,168 600,00 1,8 27 HW9 0,354 1266,67 3,8 28 HW11 0,196 700,00 2,1 29 HW12 0,205 733,33 2,2 30 HW13 0,317 1133,33 3,4 31 HW15 0,242 866,67 2,6 32 HW16 0,252 900,00 2,7 33 HW18 0,205 733,33 2,2 34 HW19 0,186 666,67 35 HW20 0,746 2666,67 36 P.aeruginosa 0,569 2033,33 6,1 ATCC 39324 Lượng RL sinh tổng hợp từ 36 chủng Pseudomonas sp dao dộng từ 1,2 – 8,4 g/l, chủng HS5 HW20 có khả sinh RL cao cả, tương ứng 8,4 8,0 g/l Theo Solali cộng (2011), chủng P.aeruginosa OCD lên men khoảng nhiệt độ 30 – 35oC đạt sản lượng RL 9,8 g/l Sinh tổng hợp RL từ chủng P.aeruginosa MTCC 424 đạt cao thời gian thu nhận RL cao sau ngày lên men chủng Pseudomonas sp sau ngày lên men cho khả tạo RL cao 7,6 g/l (Soniyamby et al., 2011) Chủng P.aeruginosa LB1 đạt 7,6 g/l (Roberta et al., 2010) Bên cạnh hướng nghiên cứu sinh tổng hợp RL từ P.aeruginosa gần nhà khoa học phát chủng P.chlororaphis, P putida, P.fluorescens có khả sinh tổng hợp RL P.chlororaphis có khả tạo RL lên tới 10 g/l (Nereus et al.,2004; 2007) Mohammed phân lập chủng P aeruginosa P.B:2 P.fluorescens P.V:10 có lượng RL dịch lên men tương ứng 101,115±0,724 mg/l 121,12±1,61 mg/l Vũ Hương Linh40Lớp: CNSH-1103 3.5 Đặc điểm chủng Pseudomonas sp tuyển chọn Khả đồng hóa nguồn chất khác vô quan trọng trình lên men chủng vi khuẩn khả tạo chất hoạt động bề mặt sở cho phép phân loại chủng vi khuẩn Do chúng tơi tiến hành định loại sơ chủng Pseudomonas sp có khả sinh tổng hợp RL cao HW20 HS5 quan sát đặc điểm hình thái phân tích phản ứng sinh hóa kit API 20 NE Kết trình bày hình 3.6, hình 3.7, hình 3.8 bảng 3.7 A Khuẩnlạc Pseudomonas HS5 A Khuẩn lạc PseudomonasHW20 B Tế bào Pseudomonas HS5 B Tế bào Pseudomonas HW20 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 Vũ Hương Linh41Lớp: CNSH-1103 A Pseudomonas HS5 môi trường King A A Pseudomonas HW20 môi trường King A A Pseudomonas HS5 môi trường King B B Pseudomonas HW20 môi trường King B Hình 3.7 Hình thành sắc tố chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 Vũ Hương Linh42Lớp: CNSH-1103 Hình 3.8 Kết định danh chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 kit API 20 NE Ghi chú: A Phản ứng sinh hóa Pseudomonas HS5 B Phản ứng sinh hóa Pseudomonas HW20 Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn chất chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 STT Phép thử Phản ứng HS5 HW20 STT Phép thử Phản ứng HS5 HW20 NO3 + - 11 MNE - + TRP - - 12 MAN + + GLU - - 13 NAG + + ADH - + 14 MAL - - URE - + 15 GNT + + ESC + - 16 CAP + + GEL + + 17 ADI + - PNG - - 18 MLT + + GLU + + 19 CIT + + 10 ARA - + 20 PAC - - 21 OX + + Quan sát đặc điểm phát triển, cấu trúc vi học phép thử sinh hóa chủng HW20 HS5 cho thấy chủng mang đặc điểm chung chi Pseudomonas khuẩn lạc trịn, nhẵn, bóng, đường kính 0,5 – 1,5 mm, tế bào hình que, khơng có bào tử, có khả di động, gram âm Cả chủng có phản ứng dương tính với thử nghiệm catalase, oxidase, GEL, GLU, MAN, NAG, GNT, CAP, MLT, CIT; phản ứng âm tính với thử nghiệm TRP, GLU, PNG, MAL PAC Tuy nhiên, chủng lại có khác điểm sau: Vũ Hương Linh43Lớp: CNSH-1103 Bảng 3.8 Sự khác chủng Pseudomonas HW20 Pseudomonas HS5 Phép thử Pseudomonas HW20 Pseudomonas HS5 Pyociamin + - Fluorescin + + 5oC - + 42oC + - NO3 + - ADH - + URE - + ESC + - ARA - + MNE - + ADI + - Sắc tố Phát triển Các kết phản ứng sinh hóa nhập lên phần mềm API web để định danh tên vi khuẩn Kết cho thấy chủng Pseudomonas HW20 có tỉ lệ tương đồng 98,9%, T = 0,79 kết luận chủng vi khuẩn có nhiều đặc điểm giống loài P.aeruginosa ký hiệu P.aeruginosa HW20 Chủng Pseudomonas HS5 có tỉ lệ tương đồng 99,9%, T = 0,64 kết luận chủng vi khuẩn có nhiều đặc điểm giống loài P fluorescens ký hiệu P.fluorescens HS5 Vũ Hương Linh44Lớp: CNSH-1103 A Chủng Pseudomonas HS5 B Chủng Pseudomonas HW20 Hình 3.9 Kết định danh chủng Pseudomonas HS5 Pseudomonas HW20 kit API 20NE sau chạy phần mềm apiweb Như vậy, khả sinh RL chủng P.aeruginosa HW20 P.fluorescens HS5 tương ứng 8,0 g/l 8,4 g/l Chủng P fluorescens HS5 lựa chọn cho nghiên cứu vì: Vũ Hương Linh45Lớp: CNSH-1103 1/ Khả sinh RL P.aeruginosa HW20 P.fluorescens HS5 khơng có khác biệt 2/ Theo nghiên cứu giới cho thấy RL tạo từ Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis hay Pseudomonas putida Trong sinh tổng hợp RL từ P.aeruginosa nghiên cứu nhiều khả tạo RL với hoạt tính bề mặt tương đối cao cho sản lượng cao so với vi sinh vật khác (Ahmad et al., 2011) Tuy nhiên, P.aeruginosa chủng gây bệnh hội người động vật nên việc sản xuất RL từ P.aeruginosa quy mô công nghiệp cần phải có biện pháp đảm bảo an tồn Để nâng cao sản lượng RL hạn chế mầm bệnh hội P.aeruginosa, có nhiều hướng nghiên cứu khác tiến hành đột biến biểu gen cho sinh tổng hợp RL P.fluorescens, P.putida P.oleovorans hay tuyển chọn vi sinh vật an tồn 3/ P.fluorescens khơng gây bệnh người, động vật hay thực vật Tuy nhiên, dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào đặc điểm sinh hóa kết trình bày chưa thể khẳng định xác tên lồi Để xác định xác kết định tên cần kết hợp với phân tích trình tự gen 16S rRNA Vũ Hương Linh46Lớp: CNSH-1103 KẾT LUẬN - Đã phân lập 56 chủng Pseudomonas sp.từ sáu mươi mẫu đất thu thập số trạm xăng thuộc khu vực Hà Nội sáu mươi mẫu nước thải lấy nhà hàng ăn uống thuộc khu vực Hà Nội Số chủng Pseudomonas sp phân lập từ đất nhiễm xăng 34/56 chủng, chiếm 60,7% (kí hiệu chủng từ HS1 đến HS34) Số chủng Pseudomonas sp phân lập từ nước thải nhà hàng ăn uống 22/56 chủng, chiếm 39,3% (kí hiệu chủng từ HW1 đến HW22) - Đã lựa chọn phương pháp thay dầu, phương pháp đổ giọt xác định số nhũ hóa E24 cho việc sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh tổng hợp RL - Số chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 58 chủng, 56 chủng Pseudomonas sp phân lập, 01 chủng Pseudomonas aeruginosa ATCC 39324 (trong sưu tập Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch) 01 chủng Pseudomonas fluorescens VTCC B668 (Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học) - Hai mươi hai tổng số 58 chủng Pseudomonas sp thử nghiệm khơng có khả sinh RL, chiếm 37,9% Ba mươi sáu chủng tổng số 58 chủng Pseudomonas sp thử nghiệm có khả sinh RL, chiếm 62,1% Lượng RL sinh tổng hợp từ 36 chủng dao động từ 1,2 – 8,4 g/l, chủng HW20 HS5 có khả sinh RL cao cả, tương ứng 8,0 8,4 g/l - Hai chủng Pseudomonas HW20 HS5 sơ định danh quan sát đặc điểm hình thái phân tích phản ứng sinh hóa kit API 20NE Chủng Pseudomonas HW20 có tỉ lệ tương đồng 98,9%, T = 0,79 kết luận chủng vi khuẩn có nhiều đặc điểm giống lồi P.aeruginosa kí hiệu P.aeruginosa HW20 Chủng Pseudomonas HS5 có tỉ lệ tương đồng 99,9%, T = 0,64 kết luận chủng vi khuẩn có nhiều đặc điểm giống lồi P.fluorescens kí hiệu P.fluorescens HS5 Chủng P.fluorescens HS5 có khả sinh RL cao lựa chọn cho nghiên cứu Vũ Hương Linh47Lớp: CNSH-1103 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lại Thúy Hiền (2010) Nghiên cứu sản xuất ứng dụng chất hoạt động bề mặt sinh học từ vi sinh vật biển số ngành công nghiệp xử lý môi trường Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ đề tài Tài liệu tiếng Anh Adria, A B., Raina, M M (1998) Application of a modified drop-collapse technique for surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microorganisms Journal of Microbiological Methods 32: 273 – 280 Amhad, M A., Rudolf, H., Francois, L., Markus, M M., Eric, D (2011) Rhamnolipids: Detection, analysis, Biosynthesis, Genetic Regulation and Bioengineering of Prodution Biosurfactants, Microbiology Monographs: 13 – 55 Ainon, H., Noramiza, S and Shahidan, R (2013) Screening and Optimization of Biosurfactant Production by the Hydrocarbon-degrading Bacteria Sains Malaysiana 42(5): 615 – 623 Andreas, W., Till, T., Torsten, T A., Pamela, W., Johannes, H., Carsten, M R W., Benjamin, K., Michaela, Z., Susanne, W., Rudolf, H., Christoph, S., Frank, R and Lars, M B (2011) Growth independent rhamnolipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440 Wittgens et al Microbial Cell Factories Aylin, K C and Hüseyin, K (2013) The use of raw cheese whey and olive oil mill wastewater for rhamnolipid production by recombinant Pseudomonas aeruginosa Enviromental and Experimental Biology 11: 125 – 130 Benincasa, M., Contiero, J., Manresa, M A., Moraes, I O (2002) Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source Journal of Food Engineering 54: 283 – 288 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 323 – 380 Deshwal, V K., Singh, S B., Chubey, A and Kumar, P (2013) Isolation and characterization of Pseudomonas strain from Potatoes Rhizosphere at Dehradun Valley, India International Journal of Basic and Applied Sciences ISSN: 2277 – 1921 2(2): 53 – 55 Vũ Hương Linh48Lớp: CNSH-1103 10 Dilsad, O and Bellma, A (2009) Biosurfactant production in sugar beet molasses by some Pseudomonas sp J Environ Biol 30(1): 161 – 163 11 Donna, J B., Marilyn, H K and John, M M (1973) Incidence and Identification of Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida in the Clinical Laboratory Applied Microbiology 107 – 110 12 Dubois, M., Gilles, K A., Hamilton, J K., Rebers, P A and Smith, F Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances 13 Haba, E., Pinozo, A., Jauregui, O., Espuny, M J., Infante, M R., Manresa, A (2002) Physico-chemical characterization and antimicrobial properties of the rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCBIM 40044 Biotechnology and Bioengineering Vol 81 (3): 316 – 322 14 Jain, D K., Collins-Thompson, D L., Lee, H and Trevors, J T (1991) A dropcollasing test for screening surfactant-producing microorgaisms Journal of Microbiolgical Methods 13: 271 – 279 15 Luiz, F D et al (2012) Characterization of rhamnolipids produced by wildtype and engineered Burkholderia kururiensis Appl Microbiol Biotechnol 16 Michael, E S et al (1997) Biosurfactants Their Identify and Potential Efficacy in the Biological Control of Zoosporic Plant Pathogens Department of Plant Pathology, University of Arizona, Tucson 17 Milena, G R., Gordana, G., Miroslav, M V and Ivanka, K (2012) Production and characterization of rhamnolipids from Pseudomonas aeruginosa san-ai J Serb Chem Soc 77 (1) 27 – 42 18 Mohammed, E B., Saad, M., Mostefa, N., Abdelkarim, T., Hadj, A B and Bouziane, A (2012) Isolation and Comparison of Rhamnolipids Production in Pseudomonas aeruginosa P.B:2 and Pseudomonas fluorescens P.V:10 Open Access Scientific Reports 1(12):1 – 19 Noha, H Y, Kathleen, E D., David, P N., Kristen, N S., Roy, M K., Michael, J M (2004) Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms Journal of Microbiolgical Methods 56: 339 – 347 20 Praveesh, B V., Soniyamby, A R., Mariappa, C., Kavithakumari, P and Palaniswamy, M (2010) Production of Biosurfactant using cashew nut shell liquid Vũ Hương Linh49Lớp: CNSH-1103