Khoá luận tốt nghiệp Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, trƣớc hết xin gửi đến cô - TS nguyễn Nhƣ Ngọc, TS Trần Thị Thu Lan lời cảm ơn sâu sắc, ngƣời giúp đỡ tận tình hƣớng dẫn theo dõi sát tơi q trình hồn thiện nghiên cứu Tơi xin gửi đến nhà trƣờng, quý thầy, cô giáo viện Cơng nghệ sinh học vàbộ mơn Vi sinh - Hóa sinh lời cảm ơn chân thành tạo cho tơi có hội đƣợc thực đề tài, thể sáng tạo nơi mà tơi u thích, để tơi có hội áp dụng kiến thức mà thầy cô giáo truyền đạt Thơng qua q trình thực để tài, tơi học hỏi đƣợc nhiều điều rút cho nhiều kinh nghiệm q báu để giúp ích cho cơng việc sau thân Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình thực hiện, hồn thiện đề tài khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp từ thầy, cô Sinh viên thực Lê Thị Huệ i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Tổng quan polysacharide 1.1.1 Cấu trúc polysaccharide 1.1.2 Ứng dụng polysaccharide 1.1.3 Các enzyme phân giải polysaccharide 1.1.4 Vi sinh vật phân giải polysaccharide 12 CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Vật liệu 15 2.3.2 Hóa chất 15 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ 16 2.3.4 Môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 17 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Phƣơng pháp thu nhận mẫu 17 2.4.2 Phân lập vi khuẩn khiết 18 2.4.3 Tuyển chọn chủng có khả phân giải polysaccharide mạnh 18 2.4.4 Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh hóa chủng tuyển chọn 25 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn có khả phân giải polysaccharide 29 3.2: Tuyển chọn chủng có khả phân giải polysaccharide mạnh 30 ii 3.2.1 Tuyển chọn dựa vào định tính 30 3.2.2 Tuyển chọn dựa vào xác định hàm lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp DNS 35 3.2.3.Tuyển chọn chủng có hoạt độ enzyme cellulase, amylase, pectinase 39 3.3 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa hai chủng vi khuẩn TA CM 39 3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 39 3.3.2 Kết nhuộm gram 40 3.4 Xác định đặc tính sinh hóa 41 3.4.1 Khả lên men loại đƣờng 41 3.4.2 Kết phản ứng MR phản ứng VP 43 3.4.3 Phản ứng catalase, khử nitrate, citrate, thử nghiệm tính di động 43 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2.Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Ký hiệu Vi sinh vật VSV Microlit µl Lỗ thạch LT Optical density - mật độ quang OD Môi trƣờng MTCB Môi trƣờng tối ƣu MTTƢ Môi trƣờng nuôi cấy MTNC 35 – dinitrosalicylic DNS Cellobiohydrolase CBH 10 Micromet µm 11 Dalton DA 12 Vịng /phút v/p 13 Mơi trƣờng thích hợp MTTH 14 Cellobiohydrolase CBH 15 Endo glucannase EG 16 Carboxyl methylcellulose CMC 17 B – glucanase BG 18 Phản ứng p/ứ 19 Aspergillus niger A.nige 20 Kilodalton KDa 21 Isoelectrics point Ip 22 Microlit µl iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Một số chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.2: Một số thuốc thử sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 16 Bảng 2.4: Danh sách môi trƣờng sử dụng thành phần 17 Bảng 2.5: Trị số OD540 nm đo đƣợc nồng độ đƣờng glucose khác phản ứng với thuốc thử DNS 21 Bảng 2.6: Trị số OD575 nm đo đƣợc nồng độ đƣờng monogalacturonan khác phản ứng với thuốc thử DNS 24 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập 29 Bảng 3.2 Đƣờng kính vịng phân giảicellulose chủng vi khuẩn 31 Bảng 3.3: Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng vi khuẩn 32 Bảng 3.4: Đƣờng kính vịng phân giải pectin chủng vi khuẩn 34 Bảng 3.5: Kết quảxác định khả phân giải CMC chủng vi khuẩn 36 Bảng 3.6: Kết xác định khả phân giải tinh bột chủng vi khuẩn 37 Bảng 3.7: Kết xác định khả phân giải pectin chủng VSV 38 Bảng 3.8: Kết tuyển chọn chủng có hoạt độ enzyme cellulase, amylase, pectinase 39 Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạccủa hai chủng vi khuẩn CM TA 40 Bảng 3.10: Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn 40 Bảng 3.11: Tổng kết đặc tính sinh hóa chủng TA CM 41 Bảng 3.12: Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis 46 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc amylose Hình 1.2: Hạt tinh bột lục lạp amylose Hình 1.3: Cấu trúc amylopectin Hình 1.4: Cấu trúc cellulose Hình 1.5: Cấu trúc pectin Hình 1.6: Sơ đồ hoạt động enzyme them gia thủy phân hồn tồn cellulose Mũi tên vị trí phân cắt enzyme Hình 1.7: Quá trình thủy phân tinh bột enzyme amylase 10 Hình 1.8: Cơ chế tác động pectinase vào phân tử pectin 11 Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn glucose 21 Hình 2.2: Đồ thị đƣờng chuẩn glacturonic 24 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy số chủng phân lập đƣợc 30 Hình3.2: Hình ảnh vịng phân giải CMC chủng C1; C8; TA; H2, CM, L4 31 Hình 3.4: Hình ảnh vịng phân giải pectin chủng có hoạt tính: H2, C8, CM, L4, TA 34 Hình 3.5: Hình ảnh thử enzyme cellulase với thuốc thử DNS 36 Hình 3.6: Hình ảnh thử enzyme amylase với thuốc thử DNS 37 Hình 3.7: Hình ảnh thử enzyme pectinase với thuốc thử DNS 38 Hình 3.8: Khả phân giải loại đƣờng chủng CM 41 Hình 3.9:Khả phân giải loại đƣờng chủng TA 42 Hình 3.10:Kết phản ứng MR phản ứng VP 43 Hình 3.11: Kết phản ứng hoạt hóa catalase 43 Hình 3.12: kết phản ứng khử nitrate 44 Hình 3.13: Kết phản ứng citrate 44 Hình 3.14: Kết thử nghiệm tính di động 45 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Carbohydrate nhóm phân tử sinh học có mặt nhiều trái đất,chiếm khoảng 80-90 % khối lƣợng khô thực vật chất dồi hợp chất hữu tự nhiên, đặc biệt cellulose, tinh bột pectin… Hàng năm thực vật tảo có khả biến - đổi 100 tỷtấn CO2 H2Othành glucose sản phẩm hữu khác nhƣ đƣờng tinh bột thức ăn chủ yếu ngƣời Các hợp chất cacbonhydrate có ý nghĩa lớn đời sống ngƣời, nhiên, với lƣợng sinh khối khổng lồ tạo hàng năm trái đất chƣa thực đƣợc tận dụng cách có hiệu để sản xuất sản phẩm có giá trị cao mà chủ yếu trình phân hủy diễn dƣới tác động hệ enzyme vi sinh vật tồn tự nhiên Vai trò hệ enzyme phân hủy polysaccharide tự nhiên chủ yếu góp phần vào việc khép kín chu trình cacbon trái đất Hệ enzyme phân giải hợp chất là: cellulase, amylase, pectinase từ hệ VSV phong phú đa dạng bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn nấm Trong đó, vi khuẩn có vai trị đáng ý q trình phân giảicác hợp chất bon hệ enzyme từ vi khuẩn thƣờng có hoạt tính mạnh phong phú Để tận dụng khối lƣợng lớn nguồn nguyên liệu từ sinh khối, nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất tối ƣu hóa q trình chuyển hóa hợp chất polysaccharide Một hƣớng chuyển hóa hợp chất hiệu thân thiện với môi trƣờng đƣờng sinh học đƣợc thực hệ enzyme từ vi sinh vật Tuy nhiên, hệ enzyme tham gia vào trình phân giải hợp chất polysaccharide hiệu nhƣ: cellulase, amylase, pectinase đƣợc sử dụng ngành công nghiệp Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập từ nƣớc với giá thành cao Ngoài ra, với điều kiện Việt Nam nƣớc nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme phong phú, việc nghiên cứu cải thiện nâng cao hiệu suất trình sản xuất enzyme từ VSV phân lập từ địa địi hỏi cấp thiết Việc tuyển chọn VSV có khả sinh tổng hợp hệ enzyme phân giải polysaccharide, đặc biệt cellulsae, pectinase, amylase giúp tận dụng nguồn gen quý có sẵn từ tự nhiên mà cịn góp phần bảo tồn nguồn gen, cải tạo chủng VSV công nghiệp sử dụng Xuất phát từ thực tế đó, tơi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme phân giải polysaccharide” với mong muốn tìm đƣợc số chủng vi khuẩn có lực sinh hệ enzyme phân giải polysaccharide cao nhằm nâng cao hiệu trình khai thác sử dụng nguồn nguyên liệu CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Tổng quan polysacharide Cacbonhydrate hợp chất cấu tạo nên hầu hết vật chất hữu tự nhiên Là hợp chất khơng có vai trị quan trọng đời sống, nhƣ: cung cấp dự trữ lƣợng,tạo cấu trúc, bảo vệ… mà cịn đóng góp khơng nhỏ vào ngành cơng nghiệp thực phẩm, công nghiệp đồ uống sản phẩm lên men…[19] Các hợp chất cacbonhydrate đa dạng phong phú, tùy vào cấu tạo đƣợc chia thành loại: polysaccharide (chứa 10 đơn phân tử, nhƣ: amylose, cellulose, pectin, agar, chitin…), oligosaccharide (chứa từ đến 10 đơn phân, nhƣ: saccharose, maltose, rafinose…) monosaccharide (là đơn phân tử, nhƣ: glucose, fructose, galactose, xylose…) Hiện nay, lƣợng cacbonhydrate trái đất ngày lớn sinh khối thực vật phế phụ phẩm ngành nông nghiệp, lâm nghiệp…trong chiếm phần lớn polysaccharide [20] 1.1.1 Cấu trúc polysaccharide Polysaccharide đƣợc tạo thành từ monosaccharide (> 10) liên kết với liên kết glucoside, nhóm – OH glucoside, khơng cịn tính khử.Các monosaccharide polysaccharide thuộc hay nhiều loại khác Trong số trƣờng hợp gốc monosaccharide có chứa nhóm khác nhau: acid sun furic, acid photphoric, acid axetic, Các liên kết gluxit phân tử polysaccharide là: anpha- gluxit hay beta- gluxit [11] Polysacchride gọi glycan, tùy thành phần monose có polysaccharide ngƣời ta chia chúng làm: homopolysaccharide (chỉ chứa loạimonosaccharide) heteropolysaccharide (có loại monosaccharide) Tùy vào kích thƣớc đặc điểm cấu trúc phân tử chúng tạo dung dịch keo tan hồn tồn nƣớc Polysaccharide đóng vai trò quan trọng đời sống động vật, thực vật Ở thực vật, polysaccharide chiếm 80-90% trọng lƣợng khô, tham gia vào thành phần mơ nâng đỡ, ví dụ cellulose, hay tích trữ dƣới dạng thực phẩm dự trữ với lƣợng lớn, ví dụ tinh bột [15] Sự phân bố phổ biến thƣờng gặp polysacchridetrong sống chủ yếu cellulose, tinh bột, pectin 1.1.1.1 Tinh bột Là polysaccharide dự trữ thực vật, quang hợp tạo thành Trong củ hạt có từ 40- 70% tinh bột, thành phần khác xanh có chiếm khoảng từ đến 20% Tinh bột khơng hịa tan nƣớc, đun nóng hạt tinh bột phồng lên nhanh tạo thành dung dịch keo gọi hồ tinh bột Tinh bột có cấu tạo gồm hai phần: amylose amylosepectin, ngồi cịn có khoảng 2% phospho dƣới dạng ester Tỷ lệ amylosepectin/amylose đối tƣợng khác không giống nhau, tỷ lệ gạo nếp lớn gạo tẻ [12] *Amylose Chiếm đến 15-20% lƣợng tinh bột, nhiều gốc α D- glucose liên kết với thông qua C1-C4 tạo thành mạch thẳng không phân nhánh Trong khơng gian cuộn lại thành hình xoắn ốc đƣợc giữ bền vững nhờ liên kết hydro Theo số liệu amylase cịn có chứa α D- glucopyranose dạng thuyền [19] Hình 1.1: Cấu trúc amylose Amylose bắt màu xanh với iodine, màu đun nóng, màu trở lại nguội Một đặc trƣng hóa lý khác cần ý bị kết tủa rƣợu butylic Hình 3.9:Khả phân giải loại đường chủng TA Kết quả: Chủng CM: + Mannitose + Glucose + Saccharose + Maltose + Xylose + Lactose Môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng có bọt khí li ti Giữ ngun màu đỏ khơng có bọt khí li ti Chủng TA: + Mannitose + Maltose + Saccharose + Lactose + Xylose + Glucose Môi trƣờng chuyển màu đỏ sang màu vàng, có bọt khí liti Mơi trƣờng giữ ngun màu đỏ khơng có bọt khí Nhận xét: Quan sát màu sắc thấy ống nghiệm chứa loại đƣờng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, tức phản ứng dƣơng tính Cịn ống nghiệm chứa môi trƣờng giữ nguyên màu đỏ phản ứng âm tính Từ kết hình 3.8 cho thấy chủng CM có khả đồng hóa loại đƣờng 42 Từ hình 3.9 cho thấy chủng TA có khả đồng hóa loại đƣờng 3.4.2 Kết phản ứng MR phản ứng VP Chủng TA CM đƣợc nuôi lắc môi trƣờng LB sau đƣợc cấy chuyển sang mơi trƣờng MR - VP Broth Thử phản ứng MR VP, ta thu đƣợc kết dƣới đây: Hình 3.10:Kết phản ứng MR phản ứng VP Nhận xét: Qua hình 3.6 cho thấy kết phản ứng MR dịch nuôi cấy chủng TA CM chuyển màu vàng , cho kết âm tính (màu vàng pH 6.0) Kết phản ứng VP, dịch nuôi cấy chủng chuyển màu đỏ phản ứng dƣơng tính Ống đối chứng khơng bổ sung vi khuẩn nên có phản ứng âm tính Vì kết luận chủng TA CM có xảy phản ứng VP, không xảy phản ứng MR 3.4.3 Phản ứng catalase, khử nitrate, citrate, thử nghiệm tính di động Phản ứng catalase Hình 3.11: Kết phản ứng hoạt hóa catalase 43 Kết quả: Chủng TA CM : phản ứng dƣơng (+): có bọt khí xuất Khử nitrate Hình 3.12: kết phản ứng khử nitrate Kết Chủng CM chuyển sang màu hồng nhẹ phản ứng âm tính, vi khuẩn khơng có khả khử nitrate Chủng TA cho Zn vào không chuyển màu phản ứng dƣơng tính, vi khuẩn có khả khử nitrate Phản ứng Citrate Hình 3.13: Kết phản ứng citrate 44 Kết quả: Chủng CM TA môi trƣờng màu xanh nƣớc biển, phản ứng dƣơng tính Thử nghiệm tính di động Hình 3.14: Kết thử nghiệm tính di động Kết quả: Chủng TA chủng CM khơng có khả di động Vi khuẩn không di động phát triển quanh đƣờng cấy, môi trƣờng không bị đục Bảng 3.11: Tổng kết đặc tính sinh hóa chủng TA CM STT 10 11 12 Phản ứng sinh hóa Catalase MR( methyl Red) VP ( Voges- Proskauer) Khử nitrate Citrate Khả di động Saccharose Glucose Lactose Maltose Mannitose Xylose Kết CM TA + + + + + + - + + + + + + + + - Qua bảng phản ứng sinh hóa chủng TA CM, thấy có nhiều đặc điểm phù hợp với Bacillus subtilis (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005) Dƣới dây bảng số phản ứng sinh hóa củaBacillus subtilis: 45 Bảng 3.12: Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis Phản ứng sinh hóa STT Kết Catalase + Sinh indol - MR( methyl Red) + VP ( Voges- Proskauer) + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + 10 Arabinose + 11 Xylose + 12 Saccharose + 13 Manitol + 14 Glucose + 15 Lactose - 16 Maltose + ( Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005) Qua bảng 3.11 3.12, thấy chủng TA chủng CM có nhiều đặc điểm phù hợp với Bacillus subtilis chủng có khả sinh đa enzyme nên có tiềm ứng dụng đa dạng Để định danh xác lồi vi khuẩn TA CM cần có nghiên cứu bổ sung đặc tính sinh hóa khác theo hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey xác định phƣơng pháp sinh học phân tử thông qua phân tích trình tự gen 46 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài, thu đƣợc kết nhƣ sau: Đã phân lập đƣợc 15 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme phân giải polysaccharide Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase, amylase, pectinase phân giải polysaccharide (CM, TA, H2, C8, L4) thơng qua tuyển chọn đƣợc chủng có hoạt tính cellulase, amylase, pectinase phân giải polysaccharide mạnh (CM, TA) Với hoạt độ CM (cellulase 16,682U/ml; amylase 176,05U/ml; pectinase 38,46U/ml), hoạt độ TA (cellulase 16,304U/ml; amylase 188,7U/ml; pectinase 43,26U/ml) Xác định đƣợc hình thái khuẩn lạc, đặc tính sinh lý sinh hóa chủng CM TA 4.2.Kiến nghị - Qua nghiên cứu ta thấy polysaccharide có ứng dụng ngành (nơng nghiệp, cơng nghiệp, y-dƣợc, … ), có số kiến nghị sau: - Nghiên cứu hoàn thành phân lập vi khuẩn có khả sinh enzyme phân giải polysaccharide - Nghiên cứu ứng dụng enzyme cellulase, amylase, pectinase thu đƣợc để tạo số sản phẩm đánh giá khả ứng dụng chúng 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1.Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,113 - 114, 2003 Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 1- Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 128 - 129, 2003 3.Lê Hồng Phú, Nghiên cứu sinh tổng hợp Enzyme Pectinase Cellulase từ Aspergillus niger ứng dụng để xử lý vỏ cà phê sản xuất phân hữu cơ, Luận văn thạc sĩ ngành sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, 2003 Trung tâm CAI Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Tài liệu cơng trình thực đối tượng vỏ cà phê, Tp.HCM, 2003 Trung Tâm Kỹ Thuật Môi Trƣờng TP HCM, 2006.Báo cáo tổng hợp “Quy hoạch môi trường tỉnh Đồng Tháp đến năm 2020”, pp 20 – 25 Lê Hồng Việt, 2000 Ngun lý quy trình xử lý nƣớc thải, Giáo trình Đại Học Cần Thơ, pp – 30 7.Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng Lê Thị Lan Chi, 2009 Các phương pháp phân tích ngành Cơng nghệ lên men Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 331 trang 8.Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hƣơng Phan Thị Huyền, 2004 Công nghệ Enzyme.Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.534 trang Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Văn Thành Bùi Thị Thúy Ngân, 2011.Tuyển chọn dòng nấm men phân lập từ nước nốt Tạp chí khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, Vol 18b, trang 117–126.Nhà xuất Đại học Cần Thơ ISSN 1859-2333 10 Hồ Thị Hảo (2011), Nghiên cứu trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít, Luận văn thạc sĩ, Khoa Công nghệ Thực phẩm đồ uống, Đại học Đà Nẵng 11 Dƣơng Thị Ngọc Hạnh, Nguyễn Minh Thủy (2014), Sử dụng enzyme amylase thủy phân tinh bột từ gạo huyết rồng, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tr 61-67 12 Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn Thuý Hƣơng (2008), Nghiên cứu trình thu phân tinh bột hạt mít enzyme Termamyl 120 M 300 để lên men rượu chưng cất, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, số (11), 43-47 13 Đỗ Trọng Hƣng, Vũ Thị Thuận, Nguyễn Hoàng Phi, Lƣơng Thị Nhƣ Hoa, Nguyễn Thùy Linh (2012), Xác định điều kiện thích hợp cho q trình thủy phân tinh bột thành nguyên liệu sản xuất Isomalto Oligosaccharides (IMO), Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tr.39-48 14 Nguyễn Thị Vân Linh (2011), Ảnh hưởng loại enzyme, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH đến trình thủy phân nếp than ứng dụng cho trình lên men, Luận văn tốt nghiệp cử nhân, Trƣờng Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh 15 Nguyen Minh Hien, Nguyen Thuy Huong (2008), "Effect of Saccharomyces cerevisiae strains on jackfruit seed fermentation", In The 1st conference on food science and technology Mekong delta, Viet Nam, p.159 – 163 16 Lê Thị Bích Phƣơng Nguyễn Minh Thủy (2014), Tối ưu hóa q trình đường hóa tinh bột bắp nếp enzyme glucoamylase, Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, số (1): 84-91002E Tài liệu tiếng anh 17 Gary J Samuels, Trichoderma a guide to identification and biology Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA, 2004 18 Okada G., The growth of Trichoderma viride on media containing cotton fibres, J Biochem., trang 591 – 607, 1963 19 Ruy D.D.Y.And Mandels M – Cellulase, Biosynthesis and applications Enzyme Microbiology Technology, 1980 20.Haseltine C., M Rolfsmeier and P Blum, 1996 The glucose effect and regulation of α- amylase synthesis in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus J Bacteriol 178: 945-950 21.Lin L.L., C.C Chyau and W.H Hsu, 1998 Production and properties of a rawstarch-degrading amylase from thermofilic and alkaliphilic Bacillus sp, TS-23.Biotech Appl Biochem 28: 61-68 22 Sasmita, M and N Behera, 2008 Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes African Journal of Biotechnol.7 (18): 3326-3331 23 Sekar Sudharhsan, Sivaprakasam Senthilkumar and Karunasena Ranjith, 2007.Physical and nutritional factors affecting the production of amylase from species of Bacillus isolated from spoiled food waste African Journal of Biotechnol (4): 430-435 24 Smitt J.P., J Rinzema, H Tramper, M Van and W Knol, 1996 Solid state fermentation of wheat bran by Trichoderma reesei QMQ414.Appl Microbial.Biotechnol 46: 489-496 25 Toye Ekunsaumi, 2008 Laboratory and assay of amylase by fungi and bacteria, www.bio link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf (truy cập ngày 01/8/2008) 26.Aranda, A and M Delolmo, 2003 Response to acetaldehyde stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae involves a strain-dependent regulation of several ALD genes and is mediated by the general stress response pathway Yeast, 20: 747-759 27.Awad, H.M., R Diaz, R.A Malek, N.Z Othman,R.A Aziz and H.A El Enshasy, 2012 Efficient production process for food grade acetic acid by Acetobacteraceti in shake flask and in bioreactor Cultures E-Journal of Chemistry,Volume (2012), Issue 4, Pages 2275-2286 28.Benito Á.G, 2005 Application of molecular techniques for identification and enumerationof acetic acid bacteria http://www.uco.es/vinegarnetwork/tesis/tesis_Gonzalez.pdf, accessed on 01/01/2014 29.Brock, T.D and M.T Madigan (1991).Biology of microorganisms th (6 Edition) Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall 30.Gullo, M and P Giudici, 2008 Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar: Phenotypic traits relevant for starter cultures selection InternationalJournal of Food Microbiology, 125 (2008) 46–53 31.Gullo, M., C Caggia, L Devero and P Giudici, 2005 Characterization of acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar Int J Food Microbiol., 106: 209-212 32.Horiuchi, J I., Kanno, T., & Kobayashi, M, 1999 New vinegar production from onions Journal of bioscience andbioengineering,88(1), 107-109 33.Horiuchi, J I., Kanno, T., & Kobayashi, M, 2000 Effective onion vinegar production by a two-step fermentation system Journal of bioscience and bioengineering,90(3), 289-293bioscience and bioengineering,90(3), 289-293 34.Kadere, T.T., T Miamoto, R.K Oniang`o, P.M Kutima and S.M Njoroge, 2008 Isolation and identification of genera Acetobacter and Gluconobacter in coconut toddy (mnazi) Afr J Biotechnol., 7: 2963-2971 35.Sossou S.K., Ameyapoh Y, Karou SD, de Souza C, 2009.Study ofpineapple peelings processing into vinegar by biotechnology Pak J Biol Sci.; 12(11): 859-65 36.Valli, M., M Sauer, P Branduardi, N Borth, D Porro and D Mattanovich, 2006 Improvement of lactic acid production in Saccharomyces cerevisiae by cell sorting for high intracellular pH Applied Environ Microbiol., 72: 54925499 37.Valli, M., M Sauer, P Branduardi, N Borth, D Porrot and D Mattanovich, 2005 Intracellular pH distribution in Saccharomyces cerevisiae cell populations, analyzed by flow cytometry Applied Environ Microbiol., 71: 15151521 38.Zahoor, T., F Siddique and U Farooq, 2006.Isolation and characterization of vinegar culture (Acetobacter aceti) from indigenous sources British FoodJournal, Vol 108 Iss: 6, pp.429 – 439 39 Guo, Y., N Zhu, S Zhu and C Deng 2007 Molecular phylogenetic diversity of bacteria and its spatial distribution in composts J of Applied Microbiology 103, 1344-1354 40 Ren, Z., T.E Ward, B.E Logan and J.M Regan 2007 Characterization of the cellulolytic and hydrogen-producing activities of six mesophilic Clostridium species J of Applied Microbiology 103, 2258-2266 41 Ryckeboer, J., J Mergaet, J Gosemans, K Deprins and J Swings 2003 Microbiological aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin J of Applied Microbiology 94, 127-137 41 Schwarz, W.H 2001 The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria Applied Microbiology and Biotechnology 56, 634-649 42 Strom, P.F 1985 Identification of Thermophilic Bacteria in Solid-Wastes Composting 43.Applied Environmental and Microbiology 50, 906-913 44 Ueno, Y., D Sasaki, H Fukui, S Harita, M Ishii and Y Igarashi 2006 Changes in bacterial community during fermentative hydrogen and aicd production from organic waste by thermophilic anaerobic microflora J of Applied Microbiology 101, 331-343 45 Vrints, M, S Bertrand and J.M Collend 2007 A bacterial population study of commercialized wastewater inoculants J of Applied Microbiology 103, 2006-2015 PHỤ LỤC Phụ biểu1 Đƣờng kính vịng phân giải cellulose chủng vi khuẩn STT Tên chủng C1 C8 TA CM L4 H2 Đƣờng kính vịng phân giải (mm) Lần 27 27 37 36 33 27 Lần 28 27 37 37 32 26 Lần 27 28 37 37 32 27 Đƣờng kính vịng phân giải trung bình (mm) 27,3±0,5 27,3±0,5 37±0 36,6±0,5 32,3±0,5 26,6±0,5 Phụ biểu Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng vi khuẩn Đƣờng kính (mm) STT Tên chủng Lần 1 C8 TA L4 CM H2 10 10 11 11 10 Lần 11 10 11 12 Lần 11 11 11 12 10 Đƣờng kính vịng phân giải trung bình (mm) 10,6±0,5 10,3±0,5 11±0 11,6±0,5 9,6±0,5 Phụ biểu Đƣờng kính vòng phân giải pectin chủng vi khuẩn Đƣờng kính (mm) STT Tên chủng Lần 1 C8 TA CM L4 H2 23 23 23 22 23 Lần 23 23 24 22 22 Lần 23 24 23 23 23 Đƣờng kính vịng phân giải trung bình (mm) 23±0 23,3±0,5 23,3±0,5 22,3±0,5 22,6±0,5 Phụ biểu Kết đo hoạt độ cellulase chủng vi khuẩn STT Kí hiệu Trị số OD540(nm) chủng Lần Lần Lƣợng đƣờng Hoạt độ pha loãng OD540(nm) khử tạo amylase mẫu mẫu (U/ml) Số lần Lần VSV Trị số trung bình (mg/ml) ĐC 0,266 0,279 0,267 0,27 ± 0,007 TA 0,827 0,925 0,954 10 0,902 ± 0,06 6,114± 0,06 16,304± 0,06 C8 0,734 0,931 0,879 10 0,848 ± 0,1 5,75± 0,1 15,33± 0,1 H2 0,858 0,928 0,978 10 0,921 ± 0,06 6,243± 0,06 16,648± 0,06 L4 0,819 0,768 0,759 10 0,782 ± 0,03 5,304± 0,03 14,144± 0,03 CM 0,862 0,903 1,005 10 0,923 ± 0,07 6,256± 0,07 16,682± 0,07 C1 0,673 0,715 0,681 10 0,689 ± 0,02 4,675± 0,02 12,46± 0,02 Phụ biểu Kết đo hoạt độ amylase chủng vi khuẩn STT Kí hiệu chủng vi khuẩn Lần Lần Lần ĐC 0,269 0,273 0,202 Số lần pha loãng mẫu CM 0,538 0,604 0,623 10 TA 0,578 0,674 0,627 C8 0,840 0,794 L4 0,471 H2 0,781 Trị số OD540nm Trị số trung bình OD540(nm) 0,248±0,03 Lƣợng đƣờng khử tạo mẫu (mg/ml) Hoạt độ amylase (U/ml) 0,588±0,04 0,124±0,03 3,293±0,04 176,05±0,04 10 0,626±0,04 3,522±0,04 188,7±0,04 0,802 0,812±0,02 3,25±0,02 121,5±0,02 0,599 0,612 10 0,560±0,07 3,12±0,07 171±0,07 0,692 0,779 0,750±0,05 3,41±0,05 146,04±0,05 Phụ biểu Kết đo hoạt độ pectinase chủng vi khuẩn Kí hiệu chủng vi khuẩn Lần Lần Lần ĐC 0,259 0,278 0,302 Số lần pha loãng mẫu CM 0,614 0,628 0,632 10 TA 0,633 0,673 0,638 C8 0,587 0,652 L4 0,594 H2 0,564 STT Trị số OD575nm Trị số trung bình OD575 (nm) Lƣợng đƣờng khử tạo mẫu (mg/ml) Hoạt độ pectinase (U/ml) 0,624±0,009 7,54±0,009 38,46±0,009 10 0,648±0,021 8,48±0,021 43,26±0,021 0,560 10 0,599±0,04 7,26±0,04 37,04±0,04 0,581 0,567 10 0,580±0,013 7,06±0,013 36,02±0,013 0,579 0,571 10 0,571±0,007 6,96±0,007 35,51±0,007 0,279±0,02 ... điểm sinh lí, sinh hóa chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 2.2 Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme phân giải polysaccharide Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng. .. apatit lồi có khả phân hủy cellulose [27, 28, 29] 14 CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu Phân lập, tuyển chọn đƣợc vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme phân giải polysaccharide... VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn có khả phân giải polysaccharide 29 3.2: Tuyển chọn chủng có khả phân giải polysaccharide mạnh 30 ii 3.2.1 Tuyển chọn dựa