Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nguyệt quế (murraya paniculata (l ) jack) và loài tràm bông đỏ (callistemon citrinus (curtis) skeels) ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHẠM NGỌC KHANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI NGUYỆT QUẾ (Murraya paniculata (L.) JACK) VÀ LỒI TRÀM BƠNG ĐỎ (Callistemon citrinus (CURTIS) SKEELS) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHẠM NGỌC KHANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI NGUYỆT QUẾ (Murraya paniculata (L.) JACK) VÀ LỒI TRÀM BƠNG ĐỎ (Callistemon citrinus (CURTIS) SKEELS) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số chuyên ngành: 62.44.01.17 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường GS.TS Young Ho Kim Hà Nội, 2015 ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ HỌ CAM CHANH RUTACEAE VÀ CHI MURRAYA 1.1.1 Giới thiệu tổng quan họ Cam chanh Rutaceae chi Murraya 1.1.2 Tình hình nghiên cứu hóa học chi Murraya giới 1.1.2.1 Các hợp chất coumarin từ chi Murraya 1.1.2.2 Các hợp chất alkaloid 11 1.1.2.3 Các hợp chất flavonoid 14 1.1.2.4 Tinh dầu 15 1.1.2.5 Các hợp chất khác 15 1.1.3 Hoạt tính sinh học dịch chiết hợp chất phân lập từ chi Murraya 1.2 KHÁI QUÁT VỀ HỌ SIM MYRTACEAE VÀ CHI CALLISTEMON 15 1.2.1 Giới thiệu tổng quan họ Sim Myrtaceae chi Callistemon 20 1.2.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Callistemon giới 1.2.2.1 Tinh dầu 20 1.2.2.2 Các hợp chất flavonoid 23 1.2.2.3 Các hợp chất triterpenoid 23 1.2.2.4 Các hợp chất polyphenol 24 1.2.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Callistemon giới 25 1.3 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG LUẬN ÁN iii 20 22 27 1.3.1 Phương pháp thử độc tế bào 27 1.3.2 Phương pháp thử nghiệm tác dụng giãn mạch 28 1.3.3 Phương pháp ức chế enzyme epoxide hydrolase hòa tan (sEH) 29 1.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm qua yếu tố NO 30 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 32 2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học phương pháp xử lý mẫu 33 2.1.2 Phương pháp phân lập hợp chất từ dịch chiết 33 2.1.3 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 33 2.2 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 33 2.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 34 2.2.2 Phương pháp thử tác dụng giãn mạch 35 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme thủy phân epoxide hịa tan 36 2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm 37 2.3 Xử lý mẫu thực vật chiết tách 38 2.3.1 Cây Nguyệt quế Murraya paniculata 38 2.3.1.1 Phân lập chất từ cặn dịch chiết chloroform 39 2.3.1.2 Phân lập chất từ cặn dịch chiết n-hexane 40 2.3.2 Cây Tràm đỏ Callistemon citrinus 40 2.3.2.1 Phân lập chất từ cặn dịch chiết DCM 41 2.3.2.2 Phân lập chất từ cặn dịch chiết EtOAc 43 2.3.2.3 Phân lập chất từ cặn dịch chiết n-hexane 44 2.4 THƠNG SỐ HĨA LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CÁC CHẤT 45 2.4.1 Từ loài Nguyệt quế Murraya paniculata 45 2.4.2 Từ lồi Tràm bơng đỏ Callistemon citrinus 46 iv C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 THÀNH PHẦN HĨA HỌC LỒi NGUYỆT QUẾ Murraya paniculata 50 3.2 THÀNH PHẦN HĨA HỌC LỒI TRÀM BÔNG ĐỎ Callistemon 67 citrinus 3.3 KẾT LUẬN VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 140 3.4 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC 142 3.4.1 Khảo sát hoạt tính độc tế bào dịch chiết dòng tế bào 142 ung thư gan HepG2 3.4.2 Tác dụng giãn mạch hợp chất coumarin 143 3.4.3 Tác dụng ức chế enzyme sEH hợp chất coumarin từ loài Nguyệt 147 quế Murraya paniculata 3.4.4 Tác dụng ức chế enzyme sEH hợp chất chiết tách từ lồi Tràm 149 bơng đỏ Callistemon citrinus 3.4.5 Tác dụng kháng viêm hợp chất phân lập từ lồi Tràm bơng đỏ 150 Callistemon citrinus KẾT LUẬN 153 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 155 TÀI LIỆU THAM KHẢO 157 PHỤ LỤC 160 v Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết thu luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Phạm Ngọc Khanh vi Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an LỜI CẢM ƠN Luận án hồn thành Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Với kính trọng, lịng biết ơn chân thành sâu sắc nhất, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường GS.TS Young Ho Kim người thầy hướng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi thời gian thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ Ban lãnh đạo Viện Hóa học Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên giúp đỡ tơi nhiệt tình suốt thời gian thực luận án Tôi xin gửi lời cám ơn đặc biệt tới Th.S Hồ Việt Đức cho giúp đỡ quý báu Thạc sỹ trình thực luận án Tôi cám ơn đề tài nghiên cứu số 104.01-2010.25 quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài Hợp tác Nghị định thư Việt Nam – Hàn Quốc số 52/2011/NĐT Bộ Khoa học Công nghệ (MOST) tài trợ cho nghiên cứu luận án Tôi xin chân thành cảm ơn đến đồng nghiệp, bạn bè gần xa cổ vũ, động viên tơi hồn thành tốt luận án Cuối cùng, tơi xin gửi lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến gia đình tơi, đến bố mẹ đẻ bố mẹ chồng tôi, đến chồng gái tơi, người khơng ngại khó khăn, vất vả, giúp đỡ tôi, tạo điều kiện cho thực tốt luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Phạm Ngọc Khanh vii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton H-1H-COSY H -1H - Correlation Spectroscopy Phổ tương tác proton Carbon -13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 13 C- NMR s Singlet d Doublet t Triplet q Quartet dd doublet doublet dt doublet triplet b (br) Broad m Multiplet J (Hz) Hằng số tương tác tính Hz δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính ppm (phần triệu) AUDA 12-[[(tricyclo[3.3.1.13,7]dec1-ylamino)carbonyl]amino]dodecanoic acid chất chuẩn dương cho thử nghiệm ức chế enzyme sEH BuOH CC Butanol Column Chromatography Sắc ký cột CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc CH3COOCH2CH3 Etyl axetat ESI-MS Electron Spray IonizationMass Spectroscopy Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị nhân qua nhiều viii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an liên kết (HMBC) Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị nhân qua liên Coherence kết (HSQC) Hiệu suất so với mẫu khô HS (%) HR-ESI-MS High Resolution Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử Hoạt tính sinh học HTSH IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại KLPT Khối lượng phân tử KST Ký sinh trùng LPS Lipopolysaccharide (LPS), also known as lipoglycans and endotoxin Lipopolysaccharide hay lipoglycans endotoxin Mp Melting point Điểm chảy MeOH Methanol Metanol MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide thuốc nhuộm dạng muối tetrazolium thử hoạt tính độc tế bào NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY OD Optical density Mật độ quang học PHOME Chất phát huỳnh quang 3-phenyl-cyano(6-methoxy-2naphthalenyl)methyl ester-2oxiraneacetic acid SRB Sulforhodamine B TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký mỏng TMS (CH3)4Si Tetrametyl Silan TLTK Tài liệu tham khảo TPHH Thành phần hóa học ix Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Danh mục loài thuộc chi Murraya thức cơng nhận danh pháp khoa học trang web http://theplantlist.org (đến thời điểm tháng 1.2015) Bảng 1.2: Một số hợp chất coumarin chiết tách từ M.exotica Bảng 1.3:Các alkaloids chiết tách từ loài thực vật chi Murraya 11 Bảng 1.4: Các PMFs chiết tách từ Murraya paniculata 14 Bảng 1.5:Hoạt tính sinh học dịch chiết hoạt chất chiết tách 15 thuộc chi Murraya Bảng 1.6: Hoạt tính sinh học coumarin chiết tách từ M paniculata 17 Bảng 1.7: Hoạt tính sinh học alkaloid chiết tách từ chi Murraya 18 Bảng 1.8: Danh mục lồi thuộc chi Callistemon thức cơng 21 nhận danh pháp khoa học trang web http://theplantlist.org (đến thời điểm tháng 1.2015) Bảng 1.9: Các triterpenoids chiết tách từ loài thực vật chi Callistemon 24 Bảng 1.10: Hoạt tính sinh học dịch chiết thuộc chi Callistemon 25 Bảng 3.1: Dữ kiện phổ 1D- 2D-NMR MP.01 54 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR MP.02 so sánh với TLTK 56 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMRcủa MP.03 so sánh với TLTK 58 13 Bảng 3.4: Dữ kiện phổ H- C-NMR MP.04 so sánh với TLTK 62 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1D- 2D-NMR chất MP.05và so với TLTK 64 Bảng 3.6: Thông số phổ NMR hợp chất MP.06 TLTK 66 Bảng 3.7: Phổ NMR hợp chất CC.01 so sánh với TLTK 69 Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR hợp chất CC.02 72 Bảng 3.9.Các thông số phổ NMR hợp chất CC.03 so sánh với TLTK 75 Bảng 3.10: Thông số phổ hợp chất CC.04 so sánh với TLTK 78 Bảng 3.11: Số liệu phổ NMR hợp chất CC.05 so sánh với TLTK 81 Bảng 3.12: Số liệu phổ NMR hợp chất CC.06 so sánh với TLTK 84 Bảng 3.13: Số liệu phổ NMR hợp chất CC.07 so sánh với TLTK 86 x Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an dịch nuôi cấy so với đối chứng nồng độ thử xác định chất nghiên cứu; OD giá trị hấp thụ bước sóng mẫu thực mẫu chứng tương ứng đo 2.2.1.3 Xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu xử lý tính tốn phần mềm Microsoft Excel 2.2.2 Phương pháp thử tác dụng giãn mạch Phép thử giãn mạch thực khoa Thần kinh học, trường đại học Sienna, Italia 2.2.2.1 Động vật thí nghiệm Tất động vật thí nghiệm chăm sóc thực nghiệm theo qui định quốc tế (NIH Publication No 85–23, revised 1996) phù hợp với Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học trường Đại học Sienna, Italy Chuột đực Sprague-Dawley (300-400g) bị gây mê qua màng bụng, bị cắt đầu cho chảy hết máu Lấy động mạch đuôi chuột cách cắt đuôi chuột khỏi thân, loại bỏ da bảo dưỡng dung dịch muối sinh lý pH 7.35 Tiếp theo, cắt mạch thành vịng nhỏ có độ dày 1.5-3-4mm Đoạn mạch bảo trì dung dịch sinh hóa Krebs-Henseleit nhiệt độ 37oC oxy hóa khí hỗn hợp O2/CO2 95/5(%) 2.2.2.3 Thử nghiệm giãn mạch Các dịch chiết thí nghiệm vịng động mạch chuột Vịng mạch để cân ngồi 60 phút sức nặng vòng dây tungsten 40μm 1.5g cho vào bên mặt kính lumen, dùng thủy tinh Plexi nối với máy cảm biến (2B Biological Instruments, Varese, Italy) nối với thiết bị ghi bút (Ugo Basile, Comerio, Varese, Italy) - Thí nghiệm với vòng động mạch loại bỏ lớp nội bào (-ER): Lớp nội bào loại cách luồn sợ dây thép khơng gỉ vào bên vịng lăn nhẹ bề mặt bên thành mạch Rửa với dung dịch muối sinh lý, gây co vòng động mạch dung dịch 60mM K+ tới bão hòa cho chất thử vào - Thí nghiệm với vịng động mạch giữ lớp nội bào (+ER): Thực tương tự với gây co vòng động mạch dung dịch 60mM K+ tới bão hòa cho chất thử vào 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme thủy phân epoxide hòa tan (soluble epoxide hydrolase (sEH) inhibition assay) Tác dụng ức chế enzyme sEH thực theo phương pháp đo huỳnh quang, đo hoạt độ enzyme sEH xúc tác phản ứng thủy phân chất phát huỳnh quang 35 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an có mặt / vắng mặt chất nghiên cứu [102] Thử nghiệm thực Khoa Dược, trường đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc 2.2.3.1 Hóa chất – Nguyên liệu Chất phát huỳnh quang 3-phenyl-cyano(6-methoxy-2naphthalenyl)methyl ester-2-oxiraneacetic acid (PHOME), [[(tricyclo[3.3.1.13,7]dec-1-ylamino)carbonyl]amino]-dodecanoic chất acid chuẩn 12- (AUDA), enzyme sEH tinh khiết 6-methoxy-2-naphtaldehyde (chất nội chuẩn cho fluorometric assays) mua hãng Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) Enzyme chuẩn bị ống nhỏ, bảo quản lạnh nhiệt độ -10 oC làm rã đông trước sử dụng Các phản ứng thực khí khí N2 khơ kiểm tra sắc ký mỏng (TLC) Merck F254 silica gel 60 đế nhôm, điểm chất phản ứng nhận biết nhờ ánh sáng tử ngoại UV bước sóng 254 365 nm Thể tích phản ứng 200 μL, bao gồm 80 μL dung dịch đệm Bis-Tris buffer 25 mM (chứa 0.1% huyết bò (bovine serum albumin), pH 7.0), 20 μL mẫu nồng độ khác nhau, 50 L dung dịch PHOME 40 M, 50 L sEH enzyme Dịch chuẩn AUDA (hòa tan MeOH, 15 nM) làm chứng dương Ống phản ứng điều nhiệt 37°C h, đo huỳnh quang phút / lần (trong vòng 1h) thiết bị Genios microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland) bước sóng kích thích / phát xạ (excitation/emission wavelengths) 320 465 nm Hoạt độ ức chế enzyme sEH cho mẫu tính tốn theo phương trình: Hoạt độ enzyme sEH (%) =[(S-So)/(C-Co)] x 100 C cường độ huỳnh quang mẫu chứng (enzyme, dung dịch đệm, MeOH chất) sau ủ 60 phút, Co cường độ huỳnh quang mẫu chứng thời điểm bắt đầu phản ứng; S là cường độ huỳnh quang mẫu đo (enzyme, dung dịch đệm, dung dịch mẫu chất) sau ủ 60 phút, So cường độ huỳnh quang mẫu chứng thời điểm bắt đầu phản ứng Giá trị IC50 nồng độ chất thử hoạt độ enzyme sEH bị ức chế 50% hoạt độ, xác định độ tuyến tính – điểm liệu đường cong độ hấp thụ huỳnh quang tìm Các thơng số động học enzyme Km (nồng độ chất tốc độ thủy phân cao nhất) Vmax (tốc độ thủy phân chất cao nhất) tính tốn theo phương trình Michaelis-Menten 36 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.2.3.3 Xử lý số liệu thống kê Các số liệu trình bày dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) Trong phép so sánh, P