Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn leptospira interrogans gây ra

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM BỘGIÁODỤCVÀ ĐÀOTẠO HỌCVIỆN KHOAHỌCVÀCÔNGNGHỆ - NguyễnTuấnHùng NGHIÊNCỨUCHẾTẠOVẮC XINTÁITỔHỢPPHÒNGBỆNH DOXOẮN KHUẨN LeptospirainterrogansGÂYRA LUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC Hà Nội-2022 NguyễnTuấnHùng NGHIÊNCỨUCHẾTẠOVẮC XINTÁITỔHỢPPHỊNGBỆNH DOXOẮN KHUẨN LeptospirainterrogansGÂYRA Chun ngành: Cơng nghệ Sinh họcMãsố:9420201 LUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC NGƢỜIHƢỚNGDẪNKHOAHỌC: PGS.TS.Võ ThịBíchThủy GS.TS.NghiêmNgọcMinh Hà Nội–2022 LỜICÁM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS.Nghiêm Ngọc Minh - Nguyên Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen PGS.TS.Võ Thị Bích Thủy–Trưởng Phịng Hệ genhọc vi sinh, Viện Nghiên cứuh ệ g e n , Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong suốt q trình học tập vànghiên cứu, tơi nhận hướng dẫn tận tình khích lệ động viên cácthầy hướngdẫn, làđộng lực lớn lao giúpt ô i k h ô n g n g n g p h ấ n đ ấ u v cốgắngvượt quanhiều khó khăn để có thểhồn thànhLuậnán Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp Phịng Hệ gen học vi sinh,Phịng R&D Cơng ty Vetvaco tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành giúp đỡtôit r o n g s u ố t q u t r ì n h h ọ c t ậ p v n g h i ê n c ứ u t i đ n v ị B ằ n g n h ữ n g t ì n h c ả m chânthànhnhất,tơi xin trântrọng cảm ơnsựgiúpđỡ qbáuđó Trong q trình nghiên cứu học tập, nhận ý kiến đónggóp quý báu nhà khoa học, cán nghiên cứu Viện Nghiên cứu hệ gen,Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Những nhận xét góp ý chunmơn sâu sắc buổi báo cáo, hội thảo giúp tơi hồn thiện tốt Luậnáncủamình Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, tập thể cán bộHọc viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Namđãtạođiều k iệ n thuận lợ i chotôi tr o n g q uá trình h ọc tậpvà ng hi ê n c ứutạiđây Saucùng, t ôi xingử il ời cảmơn sâusắc n h ấ t đếngiađình, ngư ời t hâ n bạnbèđãlnđồnghànhvàlànguồnđộngviêntinhthầnlớnlaođốivớitơitrongsuốtqtrìnhhọctập,nghiêncứu vàhồnthànhLuậnán HàNội,ngày tháng năm2022 NguyễnTuấnHùng LỜICAMĐOAN Tơi là: Nguyễn Tuấn Hùng, nghiênc ứ u s i n h H ọ c v i ệ n K h o a học v Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, chuyên ngành Côngnghệsinhhọcxincamđoan: 1- Đây Luận án thân trực tiếp thực dƣới sựh ƣ n g d ẫ n c ủ a Thầy:PGS.TSVõThịBíchThủyvàGS.TSNghiêmNgọcMinh 2- Cơng trình khơng trùng lặp với nghiêncứunàokhácđãđƣợccôngbốtạiViệt Nam 3- Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực vàkháchquan, đãđƣợcxácnhậnvàchấpnhậncủacơsởnơinghiêncứu Tơixinhồntồnchịu tráchnhiệmvềnhữngcamkếtnày HàNội,ngày tháng năm2022 NguyễnTuấnHùng DANHMỤCCHỮVIẾTTẮT Tênđầyđủ Từviếttắt TêntiếngViệt µl Microliter MicroLít APS Ammoniumpersulphate Ammoniumpersulphate bp Basepair Cặpbazơ BSA Bovineserumalbumin Huyếtthanhbò CBB Coomasie BrilliantBlue ThuốcnhuộmgelSDS cs et.al Cộngsự dH2O Distilledwater Nƣớckhửion DNA Deoxyribonucleicacid AxitDeoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzymenuclease Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotit Triphosphate Triphosphate Escherichiacoli VikhuẩnEscherichiacoli dNTP E.coli EthyleneDiamineTetraacetace EDTA IPTG Acid Isopropyl β-D-1- Axitaminopolycarboxylic Chấtcảmứngbiểuhiệngen Kb thiogalactopyranosid Kilobase Kilobasơ kDa KiloDalton KiloDalton LB Luria-Bertani MôitrƣờngLB LD50 LethalDose,50% Liềugâychết50% L.interrogans Leptospirainterrogans ml Milliliter MilliLit OD Opticaldensity Mậtđộquanghọc PBS Phosphatebuffersaline Nƣớc muối đệm phốt phátPCR Polymerase ChainReaction Xoắn Phảnứ n g c h u ỗ i Polimeraza khuẩn Leptospira interrogans Tênđầy đủ Từviếttắt TêntiếngViệt Sodiumdodecylsulfate SDS-PAGE polyacrylamidegel Điệnditrênpolyacrylamide electrophoresis TAEbuffer Tris-acetate-EDTA DungdịchđệmTAE EnzymeDNApolymerasechịu Taq Taqpolymerase TE TrisEDTA ĐệmTEchứaTris N,N,N,N- Hóachấtđƣợcsửdụngtrongđúcgelp Tetramethylethylenediamine olyacrylamide TEMED nhiệt DANHMỤCCÁCBẢNG SốTT TênBảng Trang Bảng1.1 Nhómhuyếtthanh mộtsốserovarcủaL.interrogans Bảng2.1 Thiếtkếcáccặp mồi chophảnứng PCRtrongnghiêncứu 32 Bảng2.2 Hỗnhợp phảnứngPCR(10µl) 33 Bảng2.3 Thànhphần phảnứngcắtvector 37 Bảng2.4 Thànhphần phảnứng nốigenvàovector 38 Bảng2.5 Thànhphẩn gelacrylamide 40 Bảng2.6 Côngthứcchia nhómvàdungdịch tiêmmẫmcảm 46 Bảng2.7 Chuẩnbịcácốngnghiệmvàthêmvàocácchất 48 Bảng3.1 SốlƣợngvàtrìnhtựcácvùnggiàuepitopcủagenLipL21đƣợc 66 dựđốnbằngcáccơngcụtinsinh Bảng3.2 Trìnhtựmồiđặchiệu nhândịng đoạngenLipL21 69 Bảng3.3 Kếtquảkiểmtrangƣngkếtvớichấtbổtrợnhũdầu 86 Bảng3.4 Kếtquảkiểmtravơ trùngvắcxin 87 Bảng3.5 Kếtquảkiểmtraantồnvắcxintrênđộngvậtthínghiệm 87 Bảng3.6 Kếtquảkiểmtrahiệulựcvắcxinbằngphảnứngvingƣngkết 88 Bảng3.7 Kếtquảkiểmtratạp nhiễmvikhuẩn,nấmmốc 95 Bảng3.8 KếtquảkiểmtratạpnhiễmMycoplasma 96 Bảng3.9 Kếtquảkiểmtratạp nhiễmSalmonella 97 Bảng3.10 Kếtquảkiểmtraan tồnvắcxintrênđộng vật thínghiệm 98 Bảng3.11 Kếtquảkiểmtrahiệulựcvắcxinbằngphảnứngvingƣngkết 99 Bảng3.12 Kếtquảtiêmthửnghiệmvắcxintrênbản độngvậttạithựcđịa 100 DANHMỤCCÁCHÌNH SốTT TênHình Trang Hình1.1 HìnhdạngLeptospirainterrogansdƣớikínhhiểnviđiệntửqt Hình1.2 LeptospirainterrogansdƣớiKHVnềnđen(x400) Hình1.3 SơđồlâytruyềnLeptospira 13 Hình1.4 TỷlệnhiễmLeptospirosishàngnăm 16 Hình2.1 ChukỳnhiệttrongphảnứngPCRnhângen 33 Hình2.2 MơtảqtrìnhtiêmvắcxinrLipL21vàđánh giáhiệuquả tạo 54 miễndịchtrênchuộtthínghiệm Hình3.1 Hìnhảnhsau khilytâmthuxoắn khuẩn 55 Hình3.2 HìnhảnhđiệndiDNAtổngsố 56 Hình3.3 HìnhảnhđiệndisảnphẩmPCR mồi16SrRNA 56 Hình3.4 ĐiệndiđồsảnphẩmPCRmồi16SrRNAsautinhsạch 57 Hình3.5 Hìnhảnhtrìnhtựmộtphầnđoạn gen16S rRNAcủa5chủng 58 Leptospira Hình3.6 Câyphátsinhchủng loạicácchủngxoắnkhuẩnnghiêncứu 59 Hình3.7A Điệndiđồ sảnphẩmPCRvớimồiOmpL1ở Tm55oC 61 Hình3.7B Điệndiđồ sảnphẩmPCRvớimồiLigAởTm 55oC 61 Hình3.7C Điệndiđồ sảnphẩmPCRvớimồiLigBởTm 55oC 61 Hình3.7D Điệndiđồ sảnphẩmPCRvới mồiLipL21ở Tm50oC 61 Hình3.7E Điệndiđồ sảnphẩmPCRvới mồiLipL32ở Tm50oC 62 Hình3.7F Điệndiđồ sảnphẩmPCRvớimồiLipL41ở Tm50oC 62 Hình3.8A Điệndiđồ sảnphẩmnhânbảntồnbộgenLipL21 63 Hình3.8B ĐiệndiđồsảnphẩmPCRnhânbảngenLipL21 63 Hình3.9 TrìnhtựnucleotitcủagenLipL21 64 Hình3.10 TrìnhtựaxitamincủagenLipL21 65 Hình3.11 Cấutrúc3DgenLipL21của5chủng xoắn khuẩn 65 Hình3.12 Tạo,sànglọcvàkiểmtradịngtáitổhợp pJET1.2-LipL21ởtế 71 bàoE.coliDH10b Hình3.13 KếtquảsosánhtrìnhtựgenLipL21của05chủngLeptospiravà trìnhtự genLipL21trongplasmid 72 SốTT Hình3.14 TênHình Trang Tạo,sànglọcvàkiểmtradịngtái tổhợppET32a-LipL21 ởtế 75 bàoE.coliBL21 Hình3.15 KếtquảsosánhtrìnhtựgenLipL21củaLeptospirainterogenvà 76 trìnhtự genLipL21trongplasmid Hình3.16 Điệndiđồ sảnphẩmproteintáitổ hợpLipL21ởE.coliBL21 77 Hình3.17 Điệndiđồsảnphẩmproteinđƣợcbiểuhiệntrongcácđiềukiện 78 nhiệtđộnicấycảmứngkhácnhau Hình3.18 Điệndiđồsảnphẩmproteinđƣợcbiểuhiệntrongcácđiềukiện 79 nồngđộcảmứngIPTG khácnhau Hình3.19 Điệndiđồsảnphẩmproteinđƣợcbiểuhiệntrongcácđiềukiện 80 thờigiancảmứngIPTGkhácnhau Hình3.20 ĐịnhlƣợngbằngBradfordcácphânđoạntinhsạch 81 Hình3.21 Điệndiđồ sảnphẩmbiểuhiệncủapET32a-LipL21 81 ởE.coliBL2đãtinhsạch Hình3.22 Kếtq u ả n g ƣ n g k ế t g i ữ a k h n g n g u y ê n l p r o t e i n t i t ổ hợp 82 LipL21vớinồngđộkhácnhau100µg,250µg,500µgvàkháng thểthuđƣợctừthỏ Hình3.23 Hình3.24 Kếtq u ả c ủ a p h ả n ứ n g M A T g i ữ a c h ủ n g L e p t o s p i r a s ố n gvà huyếtthanhthuđƣợc PhảnứngvingƣngkếtcủaproteintáitổhợpLipL21đƣợcphối 83 86 trộnvớinhũdầuvớiliềutiêmlà1mlvà2ml Hình3.25 TỷlệchuộttiêmvắcxintáitổhợprLipL21sống/chếtsaucơng 89 cƣờngđộcxoắnkhuẩnLeptospira Hình3.26 Hìnhảnhchụpcácthayđổi mơbệnhhọccủathậnvàganở 89 chuộtthínghiệm Hình3.27 Kếtquảphảnứng Westernblotgiữakhángnguntáitổ hợp 91 rLipL21và khángthểđặchiệu Hình3.28 MáytạonhũL4RT(HãngSilverson-AnhQuốc) 94 MỤCLỤC Trang SốTT LỜICẢM ƠN TênHình Trang LỜICAMĐOAN DANHMỤCCÁCBẢNG DANHMỤCCÁCHÌNH MỤCLỤC MỞĐẦU 1.Tínhcấpthiết củaluậnán 2.Mụctiêunghiêncứucủaluậnán 3.Cácnộidungnghiêncứuchínhcủaluậnán 4.Những đónggópmớicủaluận án 5.Ýnghĩakhoahọcthựctiễncủaluậnán 6.Bốcụccủaluậnán CHƢƠNG1.TỔNGQUAN 1.1 ĐặcđiểmxoắnkhuẩnLeptospiravàbệnhLeptospirosis 1.1.1 ĐặcđiểmsinhhọccủaxoắnkhuẩnLeptospira 1.1.1.1 Phânloạihọc 1.1.1.2 Cấutrúc hìnhthái 1.1.1.3 Đặctính ni cấyxoắnkhuẩnLeptospira 1.1.1.4 Sứcđềkhángcủamầmbệnh 1.1.1.5 Tínhsinhmiễndịch 10 1.1.2 Đặcđiểmdịchtễhọc 11 1.1.2.1 Nguồnbệnh 11 1.1.2.2 Đườngxâmnhậpcủa mầm bệnh 12 1.1.2.3 Đặctính gâybệnh củaxoắnkhuẩnLeptospira 13 1.1.3 Tìnhhìnhnghiêncứu bệnh Leptospirosis 14 1.1.3.1 TìnhhìnhnghiêncứubệnhLeptospirosis trênthếgiới 14 1.1.3.2 Tìnhhình nghiên cứubệnhLeptospirosis giasúcvàngườiở 16 ViệtNam 1.2 NghiêncứuhệgenxoắnkhuẩnLeptospira 18