ĐAỊ HOC̣ THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐAỊ HOC̣ KHOA HOC̣ TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NA[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - NĂM 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Bích Thủy THÁI NGUYÊN, NĂM 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phịng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, người tận tình bảo, hướng dẫn q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu khoa học Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, KS Phạm Thùy Linh anh chị em, cán phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng yêu thương biết ơn sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp - người tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả q trình học tập hồn thành luận văn Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả Trần Thị Thanh Huệ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi trực tiếp thực với giúp đỡ cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn khoa học TS Võ Thị Bích Thủy Các tư liệu trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huệ i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira 1.2 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 10 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.3.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis 14 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.2 Hóa chất, thiết bị 16 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2 Thiết bị 17 2.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18 ii 2.4.2 Định lượng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 19 2.4.3 Thiết kế cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 20 2.4.4 Kỹ thuật PCR 20 2.4.5 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA 21 2.4.6 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 22 2.4.7 Phân tích xây dựng sơ đồ hình phân loại chủng Leptospira 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Phân loại học phân tử chủng Leptospira 24 3.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số 24 3.1.2 Trình tự cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 26 3.1.3 Nhân gen với cặp mồi gen 16S rDNA 27 3.1.4 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA 28 3.1.5 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 29 3.1.6 Phân tích xây dựng phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn 30 3.2 Xác định có mặt gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 Kết luận 41 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EMJH Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris EtBr Ethidium Bromide F- Forward Primer : Mồi xuôi R- Reverse Primer: Mồi ngược Kb Kilobase L Leptospira MLST Multilocus Sequence Typing OMP Protein màng (outer membrane protein) PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA iv DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng 17 2.2 Thành phần phản ứng nhân gen 21 3.1 3.2 3.3 Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ bước sóng 260nm 280nm chủng Leptospira Trình tự cặp mồi dùng để nhân đoạn gen Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ sở liệu GenBank 25 27 30 v DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Leptospira interrogans Chu kì nhiệt phản ứng PCR nhân gen 21 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số chủng Leptospira 24 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 28 3.3 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S tinh Hình ảnh phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn 29 32 3.5.a Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA 35 3.5.b Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32 35 3.5.c Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB 36 3.5.d Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1 36 3.5.e Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21 37 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41 37 3.5.f MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến giới, Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal HealthOIE) xếp vị trí thứ nhóm bệnh nguy hiểm bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp Việt Nam Nguyên nhân gây loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans Leptospira interrogans loài gây bệnh thường kí sinh người động vật, bao gồm 200 typ, chia thành 23 nhóm (trong Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất) Xoắn khuẩn có khả gây bệnh động vật lây sang người Bệnh xoắn khuẩn gây cịn gọi bệnh vàng da, gây ảnh hưởng đến quan gây sẩy thai thú nuôi Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu mẫu mô động vật mắc bệnh Bệnh phát triển khắp nơi giới, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Do tính đa dạng triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn đốn tỷ lệ tử vong cao Việc điều trị bệnh khó khăn nên địi hỏi biện pháp phịng ngừa bệnh có hiệu cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira yêu cầu cấp thiết Trong trình nghiên cứu ứng dụng, nhà khoa học tập trung vào loại vắc xin có khả phịng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an tồn, mức độ bảo hộ cao lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng động vật Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc thiết kế dựa sở trình tự gen yếu tố độc lực tác nhân gây bệnh để tối ưu hóa mức độ an tồn loại vắc xin Đây bước đột phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền chế tạo vắc xin nói chung vắc xin Leptospirosis nói riêng Thực tế, nhiều protein màng xoắn khuẩn Leptospira tìm thấy sử dụng cơng nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp Quá trình tách chiết, tái tổ hợp tinh protein đơn giản, protein tái tổ hợp có giá trị tương tự kháng nguyên xét nghiệm miễn dịch để phát xoắn khuẩn Leptospira Kết thực nghiệm cho thấy vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn có miễn dịch cao so với loại vắc xin thơng thường Do đó, nghiên cứu gen định kháng nguyên tiềm năng, công thức tối ưu, tá dược, liều lượng liệu trình để phát triển loại vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn đạt hiệu cao, an toàn cho người động vật sử dụng cần thiết Việc cải thiện chất lượng vắc xin tái tổ hợp DNA vắc xin protein thực quan trọng ứng dụng thực tế Hơn nữa, việc nghiên cứu protein màng đóng góp vào sở liệu di truyền học, có ý nghĩa thiết thực nhà khoa học sản xuất liên quan đến vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Xác định số gen mã hóa yếu tố định kháng nguyên xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis Việt Nam” nhằm tạo sở cho việc nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira interrogans Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu - Định danh chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis, sử dụng chế vắc xin vô hoạt Việt Nam - Xác định số gen định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh gây xoắn khuẩn Leptospira interrogans Việt Nam 3 Nội dung nghiên cứu - Giải trình tự gen 16S rDNA xây dựng sơ đồ phân loại hình chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng chế vắc xin vô hoạt Việt Nam - Xác định có mặt số gen mã hóa kháng nguyên chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng chế vắc xin vô hoạt Việt Nam 4 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira Đặc điểm sinh vật học: Xoắn khuẩn Leptospira có hình thể mảnh, đường kính 0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm Quan sát kính hiển vi đen thấy vi khuẩn di động mạnh Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana -Tribondeau phát vi khuẩn, vi khuẩn nhìn thấy mảnh sợi tóc, hai đầu cong móc câu tiêm mao quanh bào chất để Leptospira chui sâu vào mơ vật chủ Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần thấy vòng xoắn nhỏ (15 - 30 vịng), sát sợi lóng lánh bạc, di động nhanh theo kiểu xoáy bật thẳng lị xo Xoắn khuẩn có khả xun qua da niêm mạc, da bị xây xước Bắt màu Gram âm, ưa khí, mọc chậm mơi trường ni cấy, pH thích hợp 7,2-7,5; khơng thể phát triển điều kiện axít; nhiệt độ 28-300C (nhưng ni cấy nhiệt độ tối đa 390C nhiệt độ tối thiểu 13 - 150C) (http://toquoc.vn/thu-y/benh-xoan-khuan-o-gia-suc-206301.html) Hình Xoắn khuẩn Leptospira interrogans (http://benh.vn/truyen-Nhiem/Benh-do-xoan-khuanLeptospira/35/4081/12-11-2013.htm) Khi nuôi cấy môi trường thạch máu môi trường thông thường, không bổ sung - 10% huyết thỏ, xoắn khuẩn khơng mọc Ngồi ra, giống loài vi khuẩn khác, xoắn khuẩn cần sắt để phát triển Hiện có nhiều loại mơi trường bổ sung albumin huyết bị (bovine serum albumin - BSA) dùng để nuôi cấy, phân lập xoắn khuẩn, ví dụ mơi trường thạch bán cố thể (0,1 - 0,2 thạch) có BSA + Tween 80 (mơi trường EMJH - Ellinghausen McCullough - Johnson - Harris) mơi trường có BSA + hỗn hợp Tween 80 Tween 40 Để hạn chế tạp nhiễm cho thêm vào môi trường chất - fluorouracil, fosfomycin hỗn hợp gồm rifamycin, polymycin, neomycin, - fluorouracil, bacitracin actidione; nhiên loại mơi trường gây khó khăn việc phân lập xoắn khuẩn số lượng xoắn khuẩn số chủng xoắn khuẩn khơng mọc mơi trường có nhiều kháng sinh Có thể quan sát rõ chủng xoắn khuẩn gây bệnh mọc sau nuôi cấy - ngày; lồi sống hoại sinh mọc vịng - ngày Thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào thời gian mọc khác serovar Leptospira, ví dụ L interrogans serovar Pomona L interrogans serovar Grippotyphosa cho kết sau - 10 ngày nuôi cấy chủng khác L interrogans serovar Hardjo L interrogans serovar Bratislava lâu hơn, lâu sau 26 tuần Xoắn khuẩn Leptospira có sức đề kháng yếu cịn cao so với loại xoắn khuẩn khác, bị diệt nhiệt độ 500C/10 phút Ánh sáng thuốc khử trùng thông thường phenol, nước javen dễ diệt Leptospira Tuy vậy, xoắn khuẩn Leptospira chịu lạnh sống lâu nước tới tuần; sống dai dẳng bùn lầy, nước đọng với pH bazơ (pH=7,7), tốt nước cống, rãnh, ruộng đồng, khe suối ( http://vinafeed.com.vn/vn/benh-xoan-khuan-o-gia-suc.html) Về phân loại xoắn khuẩn Leptospira thuộc giới Monera, ngành Spirochaetes, họ Leptospiraceae, giống Leptospira Người ta phân thành loài gây bệnh, loài khơng gây bệnh lồi trung gian Dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại Leptospira chia làm 23 nhóm, bao gồm 230 typ huyết thanh; typ huyết có kháng nguyên đặc hiệu Một typ huyết gây nhiều bệnh cảnh khác Ngược lại, bệnh cảnh lâm sàng typ nhóm gây bệnh tạo nên Các typ huyết có nhiều yếu tố kháng ngun trùng chéo, gây khó khăn cho chẩn đốn Có typ huyết có tầm quan trọng Mỹ Canada, tất gây bệnh chó (với thuật ngữ Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona, Grippotyphosa Bratislava) Ở Việt Nam thường gặp 12 typ huyết sau: L interrogans serovar Australis, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Autumnalis, L interrogans serovar Grippotyphosa, L interrogans serovar Bataviae, L interrogans serovar Hebdomalis, L interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L interrogans serovar Ponoma, L interrogans serovar Mitis, L interrogans serovar Saxkoebing 6, L interrogans serovar Poi, L interrogans serovar Sejroe.Trong đó, typ gây bệnh sử dụng làm vắc xin vô hoạt Việt Nam là: L interrogans serovar Pomona, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Mitis, L interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L interrogans serovar Bataviae L interrogans serovar Grippotyphosa (http://www.impe-qn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240) 1.2 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.1 Tình hình bệnh Leptospirosis Bệnh xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra, phát vào năm 1850 chó Stuttgart (Đức) Khi đó, bệnh gọi bệnh vàng da truyền nhiễm Năm 1886, Adolf Weil Heidelberg (Đức) mô tả dấu hiệu lâm sàng bệnh sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất đột ngột kèm theo lách to, vàng da viêm thận Đến đầu kỷ 20, thuật ngữ sử dụng để mô tả bệnh Leptospirosis bao gồm sốt xuất huyết Java, sốt bảy ngày, sốt mùa thu, bệnh Akiyama sốt đầm lầy [9] Năm 1915, Inada cộng xác định Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae tác nhân gây bệnh Weil Nhật Bản [32] Hiibener Reiter xác nhận Đức [31] Inada cộng (1918) phát serovar L interrogans serovar Hebdomadis gây sốt ngày Nhật Bản [33] Những nghiên cứu tìm thấy hàng loạt serovars khác Leptospira L interrogans serovar Pyrogenes (1923), L interrogans serovar Bataviae (1926), L interrogans serovar Grippotyphosa (1928) [12] Đến nay, người ta phát 230 serovars khác Leptospira interrogans khắp nơi giới [60] Bệnh Leptospirosis lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu mẫu mô động vật mắc bệnh Các triệu chứng thường gặp bệnh Leptospirosis bắp chân đau, sốt cao đột ngột, rét run, sốt liên tục kèm theo mạch nhanh, huyết áp dao động, mệt nhiều, đau đầu, nhức mắt, buồn nôn nôn, trường hợp nặng có biểu li bì, vật vã, mê sảng Sau qua da niêm mạc, xoắn khuẩn Leptospira vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết, giai đoạn khởi phát kéo dài khoảng 5-7 ngày Sau đó, xoắn khuẩn khu trú gây bệnh gan, thận, màng não, tim, phổi, thượng thận Bệnh nhân có triệu chứng vàng da độc tố xoắn khuẩn hủy diệt hồng cầu gây viêm tổ chức trung diệp gan Gan to ra, xung huyết, xuất huyết vi thể, bè gan đảo lộn, có ổ hoại tử xuất huyết rải rác (có thể nhầm lẫn áp xe gan) Xoắn khuẩn gây tổn thương ống thận, dẫn đến thiểu niệu vô niệu, tăng urê creatinin máu - nguyên nhân làm bệnh nhân tử vong Thận bệnh nhân to ra, đơi có xuất huyết, tế bào phình lên hoại tử, gây bít tắc, khe thận bị phù xâm nhiễm tế bào đơn nhân (dễ bị chẩn đoán nhầm với viêm gan virus, sốt xuất huyết dengue nhiễm khuẩn huyết) Leptospira giai đoạn hoại huyết đến quan sinh dục gây rối loạn sinh sản.Về mức độ nguy hiểm nhiễm xoắn khuẩn Leptospira, ảnh hưởng trực tiếp đến tính mạng người bệnh, song gây tổn thương nhiều quan, đáng ý đến triệu chứng hoại tử cơ, hoại tử ống thận cấp gây suy thận cấp, tổn thương mô, gan, viêm xuất huyết khu trú tim, phổi; gây tổn thương (không nguy hiểm lắm) não màng não Đặc biệt địa phụ nữ mang thai nhiễm xoắn khuẩn Leptospira gây sẩy thai [4] Theo chuyên gia nghiên cứu Leptospira bệnh có nơi giới, nhiều Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Á, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi ảnh đến sức khỏe người nhiều quốc gia, đặc biệt nước vùng nhiệt đới [8], [9], [62] Một số gia súc nhiễm Leptospira triệu chứng lâm sàng nguồn truyền lây mầm bệnh Một số loài gặm nhấm chuột loài vật trung gian mang trùng nguy hiểm [40] Mặc dù, lồi chuột vật chủ quan trọng có nhiều loại động vật có vú khác bao gồm chó, hươu, nai, thỏ, nhím, bị, cừu, gấu trúc, thú có túi, chồn số động vật có vú biển mang truyền bệnh vật chủ phụ Ở châu Phi, mèo Banded Mongooses xác định ổ chứa mang mầm bệnh, cịn có số vật chủ hoang dã khác châu Phi có khả mang mầm bệnh Chó liếm nước tiểu động vật bị nhiễm bệnh thải cỏ đất uống nước bị nhiễm bệnh Nhiều nghiên cứu lồi “chó nhà” nhiễm Leptospirosis thói quen liếm nước tiểu chuột bị nhiễm bệnh vào nhà Tuy khơng lây lan mạnh làm chết nhiều chó dịch Carre, Parvo, mắc nhiễm bị viêm gan, báng bụng, vàng da, rối loạn toàn thân tử vong Nguy lây bệnh Leptospirosis cho người cao qua tiếp xúc với nước tiểu từ vật bị bệnh [61] Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis hàng năm khác từ 0,02/100.000 dân quốc gia vùng khí hậu ơn đới 100/100.000 dân vùng khí hậu nhiệt đới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm giới có từ đến 10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da Do tính đa dạng triệu chứng, bệnh xoắn khuẩn Leptospira khó chẩn đốn nên tỉ lệ tử vong số vùng lên đến 20%-25% [44] Ở nước phát triển, người mắc bệnh chủ yếu nông dân người nghèo thành phố Ở nước phát triển, người thường phải làm việc trời nơi ấm ẩm thấp thường có nguy nhiễm bệnh [7] Người mắc bệnh ngẫu nhiên nguồn bệnh Tuy nhiên số tác giả cho rằng, có lây truyền từ người sang người thải xoắn khuẩn qua đường nước tiểu người bệnh lây qua đường tiêu hóa: qua thức ăn, nước uống khơng đun sơi, nấu chín, bị nhiễm Cá biệt, bệnh lây qua đường hơ hấp hít phải giọt nước nhiễm khuẩn dạng khí dung Xoắn khuẩn Leptospira khó tiêu diệt đa dạng nguồn nhiễm, động vật ao hồ, động vật hoang dã đặc biệt động vật ni gia đình, đồng thời xoắn khuẩn Leptospira tồn lâu mơi trường tự nhiên Hơn nữa, bệnh khó kiểm sốt nước nơng nghiệp phát triển (do có đàn gia súc đơng) tình trạng vệ sinh mơi trường (tạo điều kiện mầm bệnh phát triển) [65] Bệnh xoắn khuẩn lây sang người qua tiếp xúc với thú bệnh da, niêm mạc bị trầy xướt hay da nguyên lành bị ngâm nước lâu làm giãn nở lỗ chân lơng, xoắn khuẩn chui qua da gây bệnh Sự truyền lây xảy vấy nhiễm động vật nhiễm bệnh với nguồn nước, thực phẩm hay chỗ nằm nhiễm, chó tiếp xúc với mơi trường bị vấy nhiễm lây bệnh Nước tù đọng hay chảy chậm mơi trường sống thích hợp cho xoắn khuẩn Leptospira tồn lâu 10 Có thể chẩn đốn bệnh cách tìm kháng thể chống lại vi khuẩn tìm DNA vi khuẩn máu hay nước tiểu bệnh nhân, động vật mang mầm bệnh [35] Chẩn đoán huyết học phương pháp phổ biến sử dụng để chẩn đoán bệnh xoắn khuẩn gây Các phương pháp chẩn đoán khác sử dụng kính hiển vi tụ quang đen, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, PCR, phương pháp nuôi cấy, chẩn đoán biến đổi vi thể sử dụng Tuy nhiên, kỹ thuật PCR dùng để phát chuỗi DNA Leptospira thực trung tâm lớn Có nhiều cặp mồi (primer) khác thiết lập, số đặc hiệu mức giống Leptospira số loại đặc hiệu mức serovar 1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis Các nỗ lực phòng bệnh bao gồm trang bị bảo vệ để khơng tiếp xúc với động vật có nguy nhiễm bệnh, vệ sinh sau tiếp xúc tiêu diệt loài gặm nhấm khu dân cư [52] Việc sử dụng kháng sinh để ngừa bệnh không đem lại hiệu rõ ràng [7] Một số vắc xin dùng cho động vật để phòng vài loại xoắn khuẩn vàng da làm giảm nguy lây lan sang người Từ lâu, nhà khoa học mong muốn tìm loại vắc xin hiệu để ngăn ngừa bệnh xoắn khuẩn Leptospira thông qua tiêm chủng cho người động vật có nguy lây nhiễm cao Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu với chi phí hàng triệu la, nhà khoa học tìm số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis Tuy nhiên nay, loại vắc xin để phòng bệnh hạn chế chưa đạt hiệu cao ứng dụng lâm sàng [64] Một số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis như: vắc xin sống [41], [15], vắc xin lipopolysaccharide (LPS) [22], [54], vắc xin lipoprotein [16] [37], [58], vắc xin protein màng (OMPs), [25], [46] vắc xin yếu tố độc lực tiềm [55], [68] Hiện nay, số nước Nhật Bản, Cuba Trung Quốc có vắc xin phịng chống bệnh Leptospirosis cho người nhiên chưa 11 cấp phép sử dụng rộng rãi cần phải tiếp tục nghiên cứu độ an toàn vắc xin Vắc xin áp dụng động vật có vài chủng Vắc xin protein tái tổ hợp loại vắc xin có tiềm lớn phịng bệnh xoắn khuẩn Leptospira Vắc xin protein tái tổ hợp xây dựng với phương pháp công nghệ sinh học đại [49], [58], [59] vắc xin OMPs tái tổ hợp, vắc xin lipoprotein vắc xin yếu tố độc lực tái tổ hợp quan tâm Những đặc trưng bảo vệ vắc xin tái tổ hợp kiểm nghiệm, bao gồm: OmpL1, LipL41 [18], [29], hemolysis-associated protein (Hap1) [14], protein miễn dịch (Lig) [48] Năm 1993, lần OmpL1 báo cáo [27] Sáu năm sau đó, nghiên cứu chuột mơ hình chứng minh tác dụng gây miễn dịch loại vắc xin OmpL1 LipL41 [29] Vào năm 2002, LigA mô tả globulin miễn dịch giống protein [48], sau phản ứng miễn dịch protein LigA, LigB xác nhận [37], [49], [59] Hơn nữa, gen Lig chứng minh hữu ích việc phát bệnh xoắn khuẩn [47] Một số protein màng khác LAg42, Loa22 [36], Lk73.5 [10] công nhận nguyên liệu việc tạo vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira, nhiên chúng chưa tiến hành thử nghiệm mơ hình động vật để phát triển thành vắc xin Lipoprotein protein quan trọng Leptospira, protein có nhiều màng ngồi chúng gắn thơng qua axit béo Mặc dù khó khăn việc sản xuất lipoprotein hệ thống biểu dị hợp, số loại lipoprotein LipL41 [26], LipL32 [28], LipL45 [43] LipL21 [17] khẳng định nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc tạo vắc xin lipoprotein tái tổ hợp Ngoài ra, glucoproteins (GPLs) dự đoán gen tiềm năng, khả sản xuất yếu tố hoại tử khối u, interleukin-10 CD69 [21] Loại GPLs xuất chủng gây bệnh L interrogans chủng không gây bệnh L biflexa Trong vài công ... THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM CHUYÊN... chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng chế vắc xin vô hoạt Việt Nam - Xác định có mặt số gen mã hóa kháng nguyên chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng. .. tài ? ?Xác định số gen mã hóa yếu tố định kháng nguyên xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis Việt Nam? ?? nhằm tạo sở cho việc nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn