(LUẬN văn THẠC sĩ) xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn leptospira interrogans gây bệnh leptospirosis tại việt nam​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - NĂM 2017 download by : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Bích Thủy THÁI NGUYÊN, NĂM 2017 download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người tận tình bảo, hướng dẫn q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu khoa học Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, KS Phạm Thùy Linh anh chị em, cán phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến q báu để tơi hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng yêu thương biết ơn sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp - người tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả trình học tập hồn thành luận văn Thái Ngun, tháng năm 2017 Tác giả Trần Thị Thanh Huệ LỜI CAM ĐOAN download by : skknchat@gmail.com Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi trực tiếp thực với giúp đỡ cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn khoa học TS Võ Thị Bích Thủy Các tư liệu trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huệ download by : skknchat@gmail.com i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira 1.2 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis 10 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.3.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 14 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.2 Hóa chất, thiết bị 16 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2 Thiết bị 17 2.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18 download by : skknchat@gmail.com ii 2.4.2 Định lượng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 19 2.4.3 Thiết kế cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 20 2.4.4 Kỹ thuật PCR 20 2.4.5 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA 21 2.4.6 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 22 2.4.7 Phân tích xây dựng sơ đồ hình phân loại chủng Leptospira 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Phân loại học phân tử chủng Leptospira 24 3.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số 24 3.1.2 Trình tự cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 26 3.1.3 Nhân gen với cặp mồi gen 16S rDNA 27 3.1.4 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA 28 3.1.5 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 29 3.1.6 Phân tích xây dựng phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn 30 3.2 Xác định có mặt gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 Kết luận 41 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC download by : skknchat@gmail.com iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EMJH Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris EtBr Ethidium Bromide F- Forward Primer : Mồi xuôi R- Reverse Primer: Mồi ngược Kb Kilobase L Leptospira MLST Multilocus Sequence Typing OMP Protein màng (outer membrane protein) PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA download by : skknchat@gmail.com iv DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng 17 2.2 Thành phần phản ứng nhân gen 21 3.1 3.2 3.3 Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ bước sóng 260nm 280nm chủng Leptospira Trình tự cặp mồi dùng để nhân đoạn gen Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ sở liệu GenBank download by : skknchat@gmail.com 25 27 30 v DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Leptospira interrogans Chu kì nhiệt phản ứng PCR nhân gen 21 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số chủng Leptospira 24 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 28 3.3 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S tinh Hình ảnh phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn 29 32 3.5.a Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA 35 3.5.b Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32 35 3.5.c Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB 36 3.5.d Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1 36 3.5.e Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21 37 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41 37 3.5.f download by : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến giới, Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal HealthOIE) xếp vị trí thứ nhóm bệnh nguy hiểm bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp Việt Nam Nguyên nhân gây loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans Leptospira interrogans lồi gây bệnh thường kí sinh người động vật, bao gồm 200 typ, chia thành 23 nhóm (trong Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất) Xoắn khuẩn có khả gây bệnh động vật lây sang người Bệnh xoắn khuẩn gây gọi bệnh vàng da, gây ảnh hưởng đến quan gây sẩy thai thú ni Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu mẫu mô động vật mắc bệnh Bệnh phát triển khắp nơi giới, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Do tính đa dạng triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn đốn tỷ lệ tử vong cao Việc điều trị bệnh khó khăn nên địi hỏi biện pháp phịng ngừa bệnh có hiệu cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phịng bệnh xoắn khuẩn Leptospira yêu cầu cấp thiết Trong trình nghiên cứu ứng dụng, nhà khoa học tập trung vào loại vắc xin có khả phịng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng động vật Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc thiết kế dựa sở trình tự gen yếu tố độc lực tác nhân gây bệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn loại vắc xin Đây bước đột download by : skknchat@gmail.com 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn kết xây dựng sơ đồ phân loại cho thấy mẫu chủng sử dụng nghiên cứu chủng Leptospira interrogans mà khơng bị nhầm lẫn q trình thực nghiệm Các chủng Leptospira interrogans Việt Nam có khác biệt so với số chủng Leptospira gây bệnh khác giới (mức độ gần gũi mặt di truyền từ 62 - 99 %, khoảng cách di truyền 0,00 - 0,82), dịch tễ học địa lý khác dẫn đến đa dạng di truyền - Ở chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng chế vắc xin vơ hoạt Việt Nam có mặt số gen mã hóa kháng nguyên, bao gồm: gen LipL32, LipL21 gen LigA xuất tất chủng kiểm tra, riêng gen OmpL1 xuất chủng (gồm L interrogans serovar Bataviae, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Mitis L interrogans serovar Pomona), gen LipL41 khơng xuất chủng Leptospira Chúng tơi bước đầu dự đốn 3/ gen sử dụng gen tiềm cho nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh xoắn khuẩn Việt Nam Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu sinh học phân tử sâu để chứng minh giả thuyết Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu: - Giải trình tự gen định kháng nguyên tiềm (gen LigA, LigB, gen OmpL1, gen LipL32, gen LipL41 gen LipL21) - Phân tích protein tái tổ hợp tiềm để tạo sở cho việc sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis Việt Nam download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu Tiếng Việt Trần Quang Bính (2010), "Nhân số trường hợp nhiễm Leptospira khó chẩn đốn", Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, Phụ Số 2,14: p 603-607 Báo Lao động (2003), "Hà Nội có nguy bùng phát dịch Leptospirosis", Báo Lao động Trần Thanh Phong ( 1996), Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo, Tủ sách ĐHNL TP.HCM Huỳnh Hồng Quang (2009), Bệnh Leptospirose dấu hiệu lâm sàng cần phân biệt với sốt rét ác tính thể gan mật,Viện Sốt Rét Ký Sinh Trùng Côn Trùng Quy Nhơn Nguyễn Thị Nội, Vũ Đình Hưng (1980), Bệnh Leptospirosis gia súc người, Kết nghiên cứu KH&KT thú y 1968 – 1978: p 226-232 Lê Thị Thanh Xuân (2015), "Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh xoắn trùng Leptospira Việt Nam giai đoạn 2002-2011", Tạp chí y học dự phịng, 6(15): p 358 B Tài liệu Tiếng Anh A Slack (2010), Leptospirosis, Aust Fam Physician, 7(39): p 495 - 498 Alston JM (1963), The Leptospiroses,The Practitioner, 191: p 594-598 Alston JM and Brown HC (1937), The epidemiology of Weil's disease,Journal of the Royal Society of Medicine, 30(6): p 741-756 10 Artiushin S, Timoney JF, Nally J, Verma A (2004), Host-inducible immunogenic sphingomyelinase-like protein, Lk73 5, of Leptospira interrogans,Infection and immunity, 72(2): p 742-749 11 Bacelo Katia L, Hartwig Daiane D, Seixas Fabiana K, Schuch Rodrigo, Moreira Angelita da S, Amaral Marta, Collares Tiago, Vendrusculo Claire T, McBride Alan JA, Dellagostin Odir A (2014), Xanthan gum as download by : skknchat@gmail.com an adjuvant in a subunit vaccine preparation against leptospirosis, BioMed research international 12 Baranton Guy and Postic Danièle (2006), "Trends in leptospirosis epidemiology in France Sixty-six years of passive serological surveillance from 1920 to 2003", International journal of infectious diseases, 10(2): p 162-170 13 Bourhy Pascale, Collet Louis, Brisse Sylvain, Picardeau Mathieu (2014), "Leptospira mayottensis sp nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans", International journal of systematic and evolutionary microbiology, 64(12): p 4061-4067 14 Branger C, Sonrier C, Chatrenet B, Klonjkowski B, Ruvoen-Clouet N, Aubert A, Andre-Fontaine G, Eloit M (2001), Identification of the hemolysis-associated protein as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination, Infection and immunity, 69(11): p 6831-6838 15 Charon Nyles W and Goldstein Stuart F (2002), Genetics of motility and chemotaxis of a fascinating group of bacteria: the spirochetes, Annual review of genetics, 36(1): p 47-73 16 Coutinho ML, Vasconcellos FA, Fernandes CPH, Seyffert N, Seixa K, Ko AI, Dellagostin OA, Aleixo JAG (2007), "Evaluation of the Anti‐ LipL32 Monoclonal Antibodies Potential for Use in Leptospirosis Immunodiagnostic Tests", Journal of immunoassay & immunochemistry, 28(3): p 279-288 17 Cullen Paul A, Cordwell Stuart J, Bulach Dieter M, Haake David A Adler Ben (2003), LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species, Infection and immunity, 71(5): p 24142421 download by : skknchat@gmail.com 18 Dai B, Chen Z, Haake DA, You Z, Fang Z (1999), Alignment of DNA sequences of ompL1 genes of insert fragment of recombinant plasmid, pDC38 of L interrogans serovar lai and L kirschneri, Hua xi yi ke da xue xue bao= Journal of West China University of Medical Sciences= Huaxi yike daxue xuebao/[bian ji zhe, Hua xi yi ke da xue xue bao bian wei hui], 30(3): p 236-240 19 Day MJ (2006), Vaccine side effects: fact and fiction, Veterinary microbiology, 117(1): p 51-58 20 Dezhbord Mehrangiz, Esmaelizad Majid, Khaki Pejvak, Fotohi Fariba, Moghaddam Athena Zarehparvar (2014), "Molecular identification of the ompL1 gene within Leptospira interrogans standard serovars", The Journal of Infection in Developing Countries, 8(06): p 688-693 21 Diament Decio, Brunialti Milena Karina Colo, Romero Eliete Calo, Kallas Esper Georges, Salomao Reinaldo (2002), Peripheral blood mononuclear cell activation induced by Leptospira interrogans glycolipoprotein, Infection and immunity, 70(4): p 1677-1683 22 Erridge Clett, Pridmore Alison, Eley Adrian, Stewart John, Poxton Ian R (2004),"Lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis, Chlamydia trachomatis and Pseudomonas aeruginosa signal via toll-like receptor 2", Journal of Medical Microbiology, 53(8): p 735-740 23 Forster Karine M, Hartwig Daiane D, Oliveira Thaís L, Bacelo Kátia L, Schuch Rodrigo, Amaral Marta G, Dellagostin Odir A (2015), DNA prime-protein boost based vaccination with a conserved region of leptospiral immunoglobulin-like A and B proteins enhances protection against leptospirosis, Memórias Instituto Oswaldo Cruz, (AHEAD) 24 Franỗois Guido, Duclos Philippe, Margolis Harold, Lavanchy Daniel, Siegrist Claire-Anne, Meheus André, Lambert Paul-Henri, Emiroglu Nedret, Badur Selim, Van Damme Pierre (2005), Vaccine safety download by : skknchat@gmail.com controversies and the future of vaccination programs, The Pediatric infectious disease journal, 24(11): p 953-961 25 Gebriel AM, G Subramaniam, and SD Sekaran (2006), The detection and characterization of pathogenic Leptospira and the use of OMPs as potential antigens and immunogens, Trop Biomed, 23(2): p 194-207 26 Guerreiro Hygia, Croda Júlio, Flannery Brendan, Matsunaga James Reis, Mitermayer Galvaxo (2001), Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans, Infect, Immun 27 Haake DA, Champion CI, Martinich C, Shang ES, Blance DR, Miller JN, Lovett MA (1993), "Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp" Journal of bacteriology, 175(13): p 42254234 28 Haake David A, Chao Garlo, Zuerner Richard L, Barnett Jeanne K, Barnett Dean, Mazel Mary, Matsunaga James, Levett Paul N, Bolin Carole A (2000), The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection, Infection and immunity, 68(4): p 2276-2285 29 Haake David A, Mazel Mary K, McCoy Adam M, Milward Frank, Chao Garlo, Matsunaga James, Wagar Elizabeth A (1999), Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection, Infection and immunity, 67(12): p 6572-6582 30 Hu Weilin and Yan Jie (2014), Leptospira and leptospirosis in China, Current opinion in infectious diseases, 27(5): p 432-436 31 Hübener EA and Reiter Hans (1915), Beiträge zur Aetiologie der Weilschen Krankheit, Dtsch,Med, Wochenschr., 41: p 1275-1277 download by : skknchat@gmail.com 32 Inada R and Ido Y (1915), A report of the discovery of the causal organism (a new species of spirocheta) of Weil’s disease, Tokyo Ijishinshi, 1908: p 351-360 33 Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune (1918), "INTRAVENOUS SEROTHERAPY OF WEIL'S DISEASE (SPIROCHỈETOSIS ICTEROHỈMORRHAGICA)", The Journal of experimental medicine, 27(2): p 283 34 Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune (2014), B-cell-specific peptides of Leptospira interrogans LigA for diagnosis of patients with acute leptospirosis, Clinical and Vaccine Immunology, 21(3): p 354-359 35 Koizumi N and Watanabe H (2005), "Leptospirosis vaccines: past, present, and future", Journal of postgraduate medicine, 51(3): p 210 36 Nobuo Koizumi and Haruo Watanabe (2003), Molecular cloning and characterization of a novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain, FEMS microbiology letters, 226(2): p 215-219 37 Koizumi Nobuo and Watanabe Haruo (2004), Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity, Vaccine, 22(11): p 1545-1552 38 Lee Seoung Hoon, Kim Kyung A, Park Yong Gun, Seong In Wha, Kim Min Ja, Lee Yong Ju (2000), Identification and partial characterization of a novel hemolysin from Leptospira interrogans serovar Lai, Gene, 254(1): p 19-28 39 Lee Seoung Hoon, Kim Sangduk, Park Seung Chul, Kim Min Ja (2002), Cytotoxic activities of Leptospira interrogans hemolysin SphH as a poreforming protein on mammalian cells, Infection and immunity, 70(1): p 315-322 download by : skknchat@gmail.com 40 Levett Paul N, Branch Songee L, Whittington Carol U, Edwards Charles N, Paxton Helene (2001), Two methods for rapid serological diagnosis of acute leptospirosis, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 8(2): p 349-351 41 Li Chunhao, Motaleb A, Sal Melanie, Goldstein Stuart F, Charon Nyles W (2000), "Spirochete periplasmic flagella and motility", Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p 345-354 42 Maneewatch Santi, Adisakwattana Poom, Chaisri Urai, Saengjaruk , Patcharin, Srimanote Potjanee, Thanongsaksrikul Jeeraphong, Sakolvaree Yuwaporn, Poungpan Phakkanan, Chaicumpa Wanpen (2014), Therapeutic epitopes of Leptospira LipL32 protein and their characteristics, Protein Engineering Design and Selection: p gzu006 43 Matsunaga James, Young Tracy A, Barnett Jeanne K, Barnett Dean, Bolin Carole A, Haake David A (2002), Novel 45-kilodalton leptospiral protein that is processed to a 31-kilodalton growth-phase-regulated peripheral membrane protein, Infection and immunity, 70(1): p 323334 44 McBride AJ Athanazio DA, Reis MG, Ko AI (2005), Leptospirosis, Curr Opin Infect Dis 5(18): p 45 Nascimento Ana Lucia Tabet Oller do, Verjovski-Almeida S, Van Sluys MA, Monteiro-Vitorello CB, Camargo LEA, Digiampietri LA, Harstkeerl RA, Ho PL, Marques MV, Oliveira MC (2004), "Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni", Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 37(4): p 459-477 46 Oliveira Thaís Larré, Grassmann André Alex, Schuch Rodrigo Andrade, Neto Amilton Clair Pinto Seixas, Mendonỗa Marcelo, Hartwig Daiane Drawanz, McBride Alan John Alexander, Dellagostin Odir Antonio (2015), Evaluation of the Leptospira interrogans Outer Membrane download by : skknchat@gmail.com Protein OmpL37 as a Vaccine Candidate, PloS one, 10(11): p e0142821 47 Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Chang Chao-Fu, Pan MJ Yang CW, Harpending Peter, McDonough Sean P, Dubovi Edward, Divers Thomas, Qu Jiaxin (2005), Evaluation of lig-based conventional and real time PCR for the detection of pathogenic leptospires, Molecular and cellular probes, 19(2): p 111-117 48 Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Jusuf SSD, Artiushin S, Timoney John F, McDonough Sean P, Barr Steve C, Divers Thomas J, Simpson Kenneth W, McDonough Patrick L (2002), Cloning and molecular characterization of an immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans, Infection and immunity, 70(11): p 5924-5930 49 Palaniappan Raghavan UM, McDonough Sean P, Divers Thomas J, Chen Chia-Sui, Pan Ming-Jeng, Matsumoto Mitsuharu, Chang Yung-Fu (2006), Immunoprotection of recombinant leptospiral immunoglobulinlike protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection, Infection and immunity, 74(3): p 1745-1750 50 Palaniappan Raghavan UM, Ramanujam Subbupoongothai, and Chang Yung-Fu (2007), Leptospirosis: pathogenesis, immunity, and diagnosis Current opinion in infectious diseases, 20(3): p 284-292 51 Park Se-Hoon, Ahn Byung-Yoon, and Kim Min-Ja (1999), Expression and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58 of Leptospira species: a major target antigen of the humoral immune response, DNA and cell biology, 18(12): p 903-910 52 Picardeau M (2013), Diagnosis and epidemiology of leptospirosis, Médecine et maladies infectieuses, 43(1): p 1-9 53 Picardeau Mathieu, Bauby Hélène, and Saint Girons Isabelle (2003), Genetic evidence for the existence of two pathways for the biosynthesis download by : skknchat@gmail.com of methionine in the Leptospira spp, FEMS microbiology letters, 225(2): p 257-262 54 Priya C Gowri, Bhavani K, Rathinam SR, Muthukkaruppan VR (2003), "Identification and evaluation of LPS antigen for serodiagnosis of uveitis associated with leptospirosis", Journal of medical microbiology, 52(8): p 667-673 55 Ren Shuang-Xi, Fu Gang, Jiang Xiu-Gao, Zeng Rong, Miao You-Gang, Xu Hai, Zhang Yi-Xuan, Xiong Hui, Lu Gang, Lu Ling-Feng (2003), Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing, Nature, 422(6934): p 888-893 56 Rettinger Anna, Krupka Inke, Grünwald Karola, Dyachenko Viktor, Fingerle Volker, Konrad Regina, Raschel Heribert, Busch Ulrich, Sing Andreas, Straubinger Reinhard K (2012), Leptospira spp strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene sequencing and multi locus sequence typing (MLST), BMC microbiology, 12(1): p 185 57 Sambrook (2011), Molecular cloning: a laboratory manual 58 Seixas Fabiana Kömmling, Fernandes Claudia Hartleben, Hartwig Daiane Drawanz, Conceicao Fabricio Rochedo, Aleixo Jose Antonio Guimaraes, Dellagostin Odir Antonio (2007), "Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against leptospirosis", Canadian journal of microbiology, 53(4): p 472-479 59 Silva Éverton F, Medeiros Marco A, McBride Alan JA, Matsunaga Jim, Esteves Gabriela S, Ramos João GR, Santos Cleiton S, Croda Júlio, Homma Akira, Dellagostin Odir A (2007), The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective download by : skknchat@gmail.com immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis, Vaccine, 25(33): p 6277-6286 60 Smythe Lee D, Smith Ina L, Smith Greg A, Dohnt Michael F, Symonds Meegan L, Barnett Leonie J, McKay David B (2002), A quantitative PCR (TaqMan) assay for pathogenic Leptospira spp, BMC infectious diseases, 2(1): p 13 61 Talwani Rohit, Gilliam Bruce L, and Howell Charles (2011), Infectious diseases and the liver, Clinics in liver disease, 15(1): p 111-130 62 Vanasco Norma Bibiana, Schmeling MF, Lottersberger Javier, Costa Federico, Ko Albert Icksang, Tarabla Héctor Dante (2008), Clinical characteristics and risk factors of human leptospirosis in Argentina (1999–2005), Acta Tropica, 107(3): p 255-258 63 Vedhagiri K, Natarajaseenivasan K, Chellapandi P, Prabhakaran SG, Selvin Joseph, Sharma S, Vijayachari P (2009), Evolutionary implication of outer membrane lipoprotein-encoding genes ompL1, lipL32 and lipL41 of pathogenic Leptospira species, Genomics, proteomics & bioinformatics, 7(3): p 96-106 64 Wang Zhijun, Jin Li, and Węgrzyn Alicja (2007), Leptospirosis vaccines, Microbial Cell Factories, 6(1): p 39 65 Wasinski Bernard and Dutkiewicz Jacek (2013), Leptospirosis-current risk factors connected with human activity and the environment, Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 20(2) 66 Xiao Di, Zhang Cuicai, Zhang Huifang, Li Xiuwen, Jiang Xiugao, Zhang Jianzhong (2015), "A novel approach for differentiating pathogenic and non-pathogenic Leptospira based on molecular fingerprinting", Journal of proteomics, 119: p 1-9 67 Yanagihara Yasutake, Villanueva Sharon YAM, Yoshida Shin-ichi, Okamoto Yoshihiro, Masuzawa Toshiyuki (2007), Current status of download by : skknchat@gmail.com leptospirosis in Japan and Philippines, Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 30(5): p 399-413 68 Yang Hong-Liang, Zhu Yong-Zhang, Qin Jin-Hong, He Ping, Jiang XuCheng, Zhao Guo-Ping, Guo Xiao-Kui (2006), In silico and microarraybased genomic approaches to identifying potential vaccine candidates against Leptospira interrogans, BMC genomics, 7(1): p 293 69 Ye Cuilian, Yan Weiwei, McDonough Patrick L, McDonough Sean P, Mohamed Hussni, Divers Thomas J, Chang Yung-Fu, Yang Zhibang (2014), Serodiagnosis of equine leptospirosis by enzyme-linked immunosorbent assay using four recombinant protein markers, Clinical and Vaccine Immunology, 21(4): p 478-483 70 Zuerner Richard, Haake David, Adler Ben, Segers Ruud (2000), "Technological advances in the molecular biology of Leptospira", Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p 455-462 PHỤ LỤC Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Bataviae download by : skknchat@gmail.com GACCGGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGAA GGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCAGC AATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCAT TGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAA ACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGA GTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCG TAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCT AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAAGGTTGTCTACCAGTTGTTGG GGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGC CTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAATGAAATTTGACGG Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Mitis GGCCCAAGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGA AGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCMSGGAAAAATAAGCAG CAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCATT GGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAAA CTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGAG TTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGT AGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCTA AAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTAA ATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTTGGG GGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGCCT GGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGGA Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Pomona download by : skknchat@gmail.com GGATGGCCGTCCCAGGGCGGTCTACTTAATCCGTTAGGTTCGTTAC TGAGGGTTAAAACCCCCAACAACTGGTAGACCACGTTTAGGGCGT GGATTACCGGGGTATCTAATCCCGTTCACTACCCACGCTTTCGTGC CTCAGCGTCAGTTTTAGGCCAGCAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTT CCTCCAGATATCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCCACTT GCCTCTCCCAAACTCCAGACACATAGTTTCAAGTGCAGGCTGCGA GTTGAGCCCGCAGTTTTCACACCTGACTTACATGTCCGCCTACGCA CCCTTTACGCCCAATGATTCCGAACAACGCTTGCACCATACGTATT ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTTAGGCAGGTAC CATCATCACATTGCTGCTTATTTTTCCCTGCTTACTGAACTTTACAA TCCGAAGACCTTCATCGTTCACGCGGCGTCGCTGCTTCAGGGTTCC CCCCAATATAGAATAATCCTAATCGGCCGTGCCCCATCAGCCAAG GCATTAATAACCCTGGCCAAGGGGGGGGAAACCCAAAAACCCCCC CCCCCGAGAAAGAAAAAATTTCCCCAATAGTAAAATTTTTCAAAA AGGGGGAAAAAAAAAACCCCCCGGGGAAAAAGGGTCCCCCCCCA AAGCCCCGAAAAAAGGGGGCCCCCCCGGGGAAAAAAATAAGGGG GGAAATGTTTTTAACAAAAAATTGCGGGCAAACAGGGGGGGGAG GGGGGGAAATAGATATTAGGTGGGATAAAAAACGAGACGCGCGG GGTGTTGCAAAAAAAACCTTTGCGCGTAGTGGTGAGAGAGAGAAG AGACCCCCTCTCCCGCGTGGGGCGCGGGGAAATATTATAATATTTT GGAAAGACACATCACGAGCAGACCAGCATTAAGGTATAACACTAG CTAAACTAGACTGAGCATACGA Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Canicola GGGCGTGGGGGGCAAATCTGACCACCCATGCCGCGTGAAGGATGA AGGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATAGGGGGCGAAAAAAGG GAAATCTTTCTCACTTGACCGTACCCTATGAATAACACACCGGCTA ACTCCGTGCCAGCAAACCGCGGTACATACGGAGGGTGCAAGCGTT ATCCGGATTCACTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGGCGTATAAG download by : skknchat@gmail.com TCAAATGGTGAAATCCTGGAGCTTATCTCCAGAACTGCCATTGATA CTATATGTCTTGAATATGGTGGAGGTAACCGGAATATGTCATGTAG CGGTGAAATGCATAAATATGAACATAGAACACCTATTGCGAAGGC GGCTTACTACGCCTATTTTGACCCTAAGGCACGAAAGCGTGGGGA TCAAACAGGATTAGATACCCTGGTACTCCACGCCCTAAACCATGAT TACTCGACGTGTGCGATAAACGGTACGCGTCTGAGCGAAAGCATT AAGTAATCCACCTGGGAAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAT GAAATTGACGG Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Grippotyphosa TTAACCTTGGGGGCACCTGTATCAGCGCAGGCCGCGTGAACGACG AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCATTAGGCAGGGAAAAATAAGCA ACCTTGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGATAACTACCTGC CAGCAACCGCGGTAATACCTATGGGGCAAGCGTTGTTCGGAATCA TTGGGCGTAAAGGGTGCGTAAGCGGACATGTAATTCAAGTGTGAA AACTGCGGGCTCACCTCATAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGG AGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTACCGGTGAAATGC GTAAATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCACTTGCTGGCCT AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCACTTGTTGG GGGTTTTAACCCTCATTAACGAACCTAACGGATTAACTAGACCGCC TGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGG Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Icteroheamorrhagiae GCACGGAGGGGGGGCACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATG AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCA GCAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGKGCAAGCGTTGTTCGGAATC ATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGA download by : skknchat@gmail.com AAACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTG GAGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCRGGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGC CTAAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGAT TAGATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTT GGGGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACC GCCTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAAATTGAC GGATAGCAAACCAAGAGTCTTGCTCACTGGGGGGAACCCTGAAGC ATTCACAACGCATGAGCCATCAACGTCGTCCAATTGTAAAAGTTCC CTAAGCAGGGAAGTATAARCAGCATGCTGAATGATTGTACCTGCC TAAAGGCACGGCTAATTACGTGCCGCRTCGGCCTAATACATTATGG GTGCAACGGGTTGTTTAGGAATCATTAGTAACGTAGAGAGGGCGA TATAGGGCGGAACATCGACAAGTCAGGATGTGAAAACTGGCGTGC TCACTACACTGCAATAGAAAAATAAACGTTATTCGAGGAGTTTCG GGAACAAGCAAATGATAATTCCCAGGATGTCACAAGGTGACAACC GTGGCTACAAAATRTCTCTCAGACAGGGA download by : skknchat@gmail.com ... HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM... phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira Xuất phát từ thực tiễn đó, tiến hành thực đề tài ? ?Xác định số gen mã hóa yếu tố định kháng nguyên xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis Việt. .. tự gen 16S rDNA xây dựng sơ đồ phân loại hình chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng chế vắc xin vô hoạt Việt Nam - Xác định có mặt số gen mã hóa kháng nguyên chủng xoắn khuẩn