Xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn leptospira interrogans gây bệnh leptospirosis tại việt nam​

TRẦN THỊ THANH HUỆXÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN THỊ THANH HUỆ

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA

XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans

GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - NĂM 2017

TRẦN THỊ THANH HUỆ

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA

XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans

GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Bích Thủy

THÁI NGUYÊN, NĂM 2017

thành và sâu sắc nhất của mình tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phòng Hệ

gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong quá trình nghiên cứu

và hoàn thành luận văn

Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trong Ban giám hiệu Trường Đạihọc Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - TrườngĐại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ trongsuốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học

Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, KS Phạm ThùyLinh và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp

đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng yêu thương và biết ơn sâu sắc đến giađình, đồng nghiệp - những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, động viên tác giảtrong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

Tác giả

Trần Thị Thanh Huệ

LỜI CAM ĐOAN

cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫnkhoa học của TS Võ Thị Bích Thủy Các tư liệu trích dẫn đều có nguồn gốc rõràng, các kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố ởbất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Huệ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira 4

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

1.2.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 6

1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 10

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

1.3.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 12

1.3.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 14

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.2 Hóa chất, thiết bị 16

2.2.1 Hóa chất 16

2.2.2 Thiết bị 17

2.3 Địa điểm nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18

2.4.2 Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số 19

2.4.3 Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 20

2.4.4 Kỹ thuật PCR 20

2.4.5 Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA 21

2.4.6 Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn 22

2.4.7 Phân tích và xây dựng sơ đồ hình cây phân loại 6 chủng Leptospira 23

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Phân loại học phân tử 6 chủng Leptospira 24

3.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số 24

3.1.2 Trình tự các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 26

3.1.3 Nhân gen với các cặp mồi của gen 16S rDNA 27

3.1.4 Tinh sạch sản phẩm PCR gen 16S rDNA 28

3.1.5 Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn 29

3.1.6 Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn khuẩn 30

3.2 Xác định sự có mặt của các gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

EMJH Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris

OMP Protein ngoài màng (outer membrane protein)

DANH MỤC HÌNH

3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số của 6 chủng Leptospira 243.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 28

3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 29

Health-Leptospira interrogans.

Leptospira interrogans là loài gây bệnh thường kí sinh ở người và động vật,

bao gồm hơn 200 typ, được chia thành 23 nhóm (trong đó Leptospira

interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất) Xoắn khuẩn này có

khả năng gây bệnh trên động vật và có thể lây sang người Bệnh do xoắn khuẩngây ra còn gọi là bệnh vàng da, nó gây ảnh hưởng đến các cơ quan và có thể gâysẩy thai ở thú nuôi Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da,mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu

mô động vật mắc bệnh Bệnh phát triển ở khắp mọi nơi trên thế giới, gây thiệthại lớn cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của conngười Do tính đa dạng về triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn đoán và

tỷ lệ tử vong cao Việc điều trị bệnh này rất khó khăn nên đòi hỏi những biệnpháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng bệnh

do xoắn khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết.

Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học đang tập trungvào các loại vắc xin có khả năng phòng chống dịch bệnh mang tính dịch tễvùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao và lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏecộng đồng và động vật Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc đượcthiết kế dựa trên cơ sở trình tự gen và các yếu tố độc lực của các tác nhân gâybệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn của các loại vắc xin Đây là một bước đột

phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền trong chế tạo vắc xin nói chung vàvắc xin Leptospirosis nói riêng.

Thực tế, nhiều protein ngoài màng của xoắn khuẩn Leptospira đã được

tìm thấy và sử dụng trong công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp Quá trình táchchiết, tái tổ hợp và tinh sạch các protein này đơn giản, hơn nữa protein tái tổhợp có giá trị tương tự như kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để phát

hiện xoắn khuẩn Leptospira Kết quả thực nghiệm cho thấy vắc xin tái tổ hợp

phòng bệnh xoắn khuẩn có miễn dịch cao hơn so với các loại vắc xin thôngthường Do đó, những nghiên cứu về các gen quyết định kháng nguyên tiềmnăng, công thức tối ưu, tá dược, liều lượng và liệu trình để phát triển các loạivắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn đạt hiệu quả cao, an toàn cho người và độngvật sử dụng là rất cần thiết Việc cải thiện chất lượng vắc xin tái tổ hợp DNA

và vắc xin protein thực sự quan trọng đối với các ứng dụng thực tế Hơn nữa,việc nghiên cứu các protein màng sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyềnhọc, có ý nghĩa thiết thực đối với các nhà khoa học và sản xuất liên quan đến

vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira.

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn

Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam” nhằm tạo cơ

sở cho việc nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn

Leptospira interrogans tại Việt Nam.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Định danh được 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh

Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam

- Xác định được một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giátrị ứng dụng trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn

Leptospira interrogans tại Việt Nam.

3 Nội dung nghiên cứu

- Giải trình tự gen 16S rDNA và xây dựng sơ đồ phân loại hình cây của 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin

vô hoạt ở Việt Nam

- Xác định sự có mặt của một số gen mã hóa kháng nguyên trên 6 chủng

xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt

ở Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira

Đặc điểm sinh vật học: Xoắn khuẩn Leptospira có hình thể rất mảnh,

đường kính 0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấym, dài 5- 25μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấym Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấy

vi khuẩn di động mạnh Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạcFontana -Tribondeau mới phát hiện được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấymảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu và 2 tiêm mao quanh bào chất để

Leptospira có thể chui sâu vào mô vật chủ Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ (15 - 30 vòng), sát nhau

như một sợi chỉ lóng lánh bạc, di động nhanh theo kiểu xoáy và bật thẳng như

lò xo Xoắn khuẩn có khả năng xuyên qua da và niêm mạc, nhất là da bị xâyxước Bắt màu Gram âm, ưa khí, mọc chậm ở các môi trường nuôi cấy, pHthích hợp 7,2-7,5; không thể phát triển trong điều kiện axít; nhiệt độ 28-300C(nhưng cũng có thể nuôi cấy ở nhiệt độ tối đa là 390C và nhiệt độ tối thiểu là

13 - 150C) (http://toquoc.vn/thu-y/benh-xoan-khuan-o-gia-suc-206301.html)

Hình 1 Xoắn khuẩn Leptospira interrogans

Leptospira/35/4081/12-11-2013.htm)

(http://benh.vn/truyen-Nhiem/Benh-do-xoan-khuan-Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu hoặc các môi trường thông thường,nếu không bổ sung 5 - 10% huyết thanh thỏ, xoắn khuẩn không mọc được Ngoài

ra, giống như các loài vi khuẩn khác, xoắn khuẩn cũng cần sắt để phát triển Hiệnnay có nhiều loại môi trường bổ sung albumin huyết thanh bò (bovine serumalbumin - BSA) dùng để nuôi cấy, phân lập xoắn khuẩn, ví dụ môi trường thạchbán cố thể (0,1 - 0,2 thạch) có BSA + Tween 80 (môi trường EMJH -Ellinghausen McCullough - Johnson - Harris) hoặc môi trường có BSA + hỗnhợp Tween 80 và Tween 40 Để hạn chế tạp nhiễm cho thêm vào môi trường cácchất như 5 - fluorouracil, fosfomycin hoặc hỗn hợp gồm rifamycin, polymycin,neomycin, 5 - fluorouracil, bacitracin và actidione; tuy nhiên các loại môi trườngnày có thể gây khó khăn trong việc phân lập xoắn khuẩn nếu số lượng xoắnkhuẩn ít hoặc một số chủng xoắn khuẩn không mọc được trong môi trường cónhiều kháng sinh Có thể quan sát rõ các chủng xoắn khuẩn gây bệnh mọc saukhi nuôi cấy 5 - 7 ngày; trong khi đó các loài sống hoại sinh có thể mọc trongvòng 2 - 3 ngày Thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào thời gian mọc khác nhau của

các serovar Leptospira, ví dụ L interrogans serovar Pomona và

L interrogans serovar Grippotyphosa cho kết quả sau 7 - 10 ngày nuôi cấy nhưng các chủng khác như L interrogans serovar Hardjo và L interrogans

serovar Bratislava có thể lâu hơn, lâu nhất sau 26 tuần

Xoắn khuẩn Leptospira có sức đề kháng yếu nhưng còn cao hơn so với

các loại xoắn khuẩn khác, bị diệt ở nhiệt độ 500C/10 phút Ánh sáng và cácthuốc khử trùng thông thường như phenol, nước javen dễ diệt được

Leptospira Tuy vậy, xoắn khuẩn Leptospira chịu được lạnh và sống được lâu

ở nước tới 3 tuần; sống dai dẳng trong bùn lầy, nước đọng với pH bazơ(pH=7,7), tốt nhất là nước cống, rãnh, ruộng đồng, khe suối

( http://vinafeed.com.vn/vn/benh-xoan-khuan-o-gia-suc.html)

Về phân loại thì xoắn khuẩn Leptospira thuộc giới Monera, ngành

Spirochaetes, họ Leptospiraceae, giống Leptospira Người ta phân ra thành các

loài gây bệnh, loài không gây bệnh và loài trung gian Dựa vào cấu trúc kháng

nguyên mà phân loại thì Leptospira được chia ra làm 23 nhóm, bao gồm 230 typ

huyết thanh; mỗi typ huyết thanh có các kháng nguyên đặc hiệu Một typ huyếtthanh có thể gây nhiều bệnh cảnh khác nhau Ngược lại, một bệnh cảnh lâm sàng

có thể do bất kỳ typ nào trong nhóm gây bệnh tạo nên Các typ huyết thanh cónhiều yếu tố kháng nguyên trùng chéo, gây khó khăn cho chẩn đoán Có ít nhất 5typ huyết thanh có tầm quan trọng tại Mỹ và Canada, tất cả đều gây bệnh ở chó

(với các thuật ngữ Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona, Grippotyphosa và

Bratislava) Ở Việt Nam thường gặp 12 typ huyết thanh sau:

L interrogans serovar Australis, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Autumnalis, L interrogans serovar Grippotyphosa, L interrogans serovar Bataviae, L interrogans serovar Hebdomalis, L interrogans

serovar Icterohaemorrhagiae, L interrogans serovar Ponoma, L interrogans serovar Mitis, L interrogans serovar Saxkoebing 6, L interrogans

serovar Poi, L interrogans serovar Sejroe.Trong đó, 6 typ gây bệnh đang sử dụng làm vắc xin vô hoạt ở Việt Nam là: L interrogans serovar Pomona, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Mitis, L interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L interrogans serovar Bataviae và L interrogans serovar Grippotyphosa.

(http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/

InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240)

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.2.1 Tình hình bệnh Leptospirosis

Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra, được phát hiện đầu

tiên vào năm 1850 trên chó tại Stuttgart (Đức) Khi đó, bệnh được gọi là bệnh

vàng da truyền nhiễm Năm 1886, Adolf Weil ở Heidelberg (Đức) đã mô tảdấu hiệu lâm sàng của bệnh này là sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuấthiện đột ngột kèm theo lách to, vàng da và viêm thận Đến đầu thế kỷ 20,những thuật ngữ được sử dụng để mô tả bệnh Leptospirosis bao gồm sốt xuấthuyết Java, sốt bảy ngày, sốt mùa thu, bệnh Akiyama và sốt đầm lầy [9].

Năm 1915, Inada và cộng sự đã xác định Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae là tác nhân gây bệnh Weil ở Nhật Bản [32] và cũng đượcHiibener và Reiter xác nhận tại Đức [31] Inada và cộng sự (1918) đã phát

hiện serovar L interrogans serovar Hebdomadis gây sốt 7 ngày ở Nhật Bản

[33] Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm thấy hàng loạt các serovars khác

nhau của Leptospira như L interrogans serovar Pyrogenes (1923), L interrogans serovar Bataviae (1926), L interrogans serovar Grippotyphosa

(1928) [12] Đến nay, người ta đã phát hiện ra hơn 230 serovars khác nhau

của Leptospira interrogans ở khắp nơi trên thế giới [60].

Bệnh Leptospirosis lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc cácmàng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vậtmắc bệnh Các triệu chứng thường gặp của bệnh Leptospirosis là cơ bắp chânđau, sốt cao đột ngột, rét run, sốt liên tục hoặc kèm theo mạch nhanh, huyết ápdao động, mệt nhiều, đau đầu, nhức mắt, buồn nôn và nôn, trường hợp nặng cóbiểu hiện li bì, vật vã, mê sảng Sau khi qua da và niêm mạc, xoắn khuẩn

Leptospira vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết, giai đoạn khởi phát này kéo dài

khoảng 5-7 ngày Sau đó, xoắn khuẩn khu trú và gây bệnh ở gan, thận, màngnão, tim, phổi, thượng thận Bệnh nhân có triệu chứng vàng da do độc tố xoắnkhuẩn hủy diệt hồng cầu và gây viêm tổ chức trung diệp ở gan Gan to ra, xunghuyết, xuất huyết vi thể, các bè gan đảo lộn, có thể có ổ hoại tử và xuất huyết rảirác (có thể nhầm lẫn áp xe gan) Xoắn khuẩn cũng gây tổn thương ống thận, dẫnđến thiểu niệu và vô niệu, tăng urê và creatinin máu - nguyên nhân chính làmbệnh nhân tử vong Thận bệnh nhân to ra, đôi khi có xuất huyết, các tế bào

phình lên và hoại tử, gây bít tắc, khe thận bị phù và xâm nhiễm tế bào đơnnhân (dễ bị chẩn đoán nhầm với viêm gan virus, sốt xuất huyết dengue hoặc

nhiễm khuẩn huyết) Leptospira trong giai đoạn hoại huyết có thể đến cơ quan

sinh dục gây rối loạn sinh sản.Về mức độ nguy hiểm của nhiễm xoắn khuẩn

Leptospira, tuy ít ảnh hưởng trực tiếp đến tính mạng của người bệnh, song gây ra các tổn thương ở nhiều cơ quan, trong đó đáng chú ý đến triệu chứng

hoại tử cơ, hoại tử ống thận cấp có thể gây suy thận cấp, tổn thương các mô,gan, viêm và xuất huyết khu trú ở tim, phổi; gây tổn thương (không nguyhiểm lắm) ở não và màng não Đặc biệt trên cơ địa phụ nữ mang thai thì khi

nhiễm xoắn khuẩn Leptospira có thể gây ra sẩy thai [4].

Theo các chuyên gia nghiên cứu về Leptospira thì bệnh này có ở mọi nơi

trên thế giới, nhiều nhất ở Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Á, gây thiệt hại đáng kểcho ngành chăn nuôi và ảnh đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặcbiệt là các nước vùng nhiệt đới [8], [9], [62]

Một số gia súc nhiễm Leptospira nhưng không thể hiện triệu chứng lâm

sàng và đây là nguồn truyền lây mầm bệnh Một số loài gặm nhấm như chuột làloài vật trung gian mang trùng nguy hiểm nhất [40] Mặc dù, các loài chuột là vậtchủ chính quan trọng nhưng cũng có nhiều loại động vật có vú khác bao gồmchó, hươu, nai, thỏ, nhím, bò, cừu, gấu trúc, thú có túi, chồn và một số động vật

có vú ở biển có thể mang và truyền bệnh như là vật chủ phụ Ở châu Phi, mèoBanded Mongooses đã được xác định là ổ chứa mang mầm bệnh, ngoài ra còn cómột số vật chủ hoang dã khác ở châu Phi cũng có khả năng mang mầm bệnh.Chó có thể liếm nước tiểu của động vật bị nhiễm bệnh thải ra cỏ hoặc đất hoặcuống nước bị nhiễm bệnh Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng loài “chó nhà” nhiễmLeptospirosis do thói quen liếm nước tiểu của chuột bị nhiễm bệnh đi vào nhà.Tuy không lây lan mạnh và làm chết nhiều chó như dịch Carre, Parvo, nhưngnếu mắc nhiễm sẽ bị viêm gan, báng bụng, vàng da,

rối loạn toàn thân và tử vong Nguy cơ lây bệnh Leptospirosis cho người rất cao qua tiếp xúc với nước tiểu từ những con vật bị bệnh [61].

Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis hàng năm là khác nhau từ 0,02/100.000 dân

ở các quốc gia vùng khí hậu ôn đới và 100/100.000 dân ở vùng khí hậu nhiệtđới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm trên thế giới có từ

7 đến 10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da Do tính đa dạng của các triệu

chứng, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một số

vùng có thể lên đến 20%-25% [44] Ở các nước đang phát triển, những người mắcbệnh chủ yếu là nông dân và người nghèo ở các thành phố Ở các nước phát triển,những người thường phải làm việc ngoài trời ở những nơi ấm và ẩm thấp thường

có nguy cơ nhiễm bệnh [7] Người mắc bệnh ngẫu nhiên chứ không phải là nguồnbệnh Tuy nhiên một số tác giả cho rằng, có sự lây truyền từ người sang người dothải xoắn khuẩn qua đường nước tiểu của người bệnh hoặc lây qua đường tiêu hóa:qua thức ăn, nước uống không đun sôi, nấu chín, bị ô nhiễm Cá biệt, bệnh có thểlây qua đường hô hấp do hít phải các giọt nước nhiễm khuẩn ở dạng khí dung

Xoắn khuẩn Leptospira rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm, như

động vật ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia đình,

đồng thời xoắn khuẩn Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trường tự nhiên.

Hơn nữa, bệnh này càng khó kiểm soát ở những nước nông nghiệp phát triển (do

có đàn gia súc đông) và tình trạng vệ sinh môi trường kém (tạo điều kiện mầmbệnh phát triển) [65] Bệnh xoắn khuẩn có thể lây sang người qua tiếp xúc vớithú bệnh khi da, niêm mạc bị trầy xướt hay da nguyên lành nhưng bị ngâm nướclâu làm giãn nở các lỗ chân lông, xoắn khuẩn có thể chui qua da và gây bệnh Sựtruyền lây còn xảy ra do sự vấy nhiễm của động vật nhiễm bệnh với các nguồnnước, thực phẩm hay ngay cả chỗ nằm ô nhiễm, chó tiếp xúc với môi trường bịvấy nhiễm này cũng lây bệnh Nước tù đọng hay chảy chậm là môi trường sống

thích hợp cho xoắn khuẩn Leptospira tồn tại lâu.

Có thể chẩn đoán bệnh bằng cách tìm kháng thể chống lại vi khuẩn hoặctìm DNA của vi khuẩn trong máu hay nước tiểu bệnh nhân, động vật mangmầm bệnh [35] Chẩn đoán huyết thanh học là phương pháp phổ biến được sửdụng để chẩn đoán bệnh do xoắn khuẩn gây ra Các phương pháp chẩn đoánkhác như sử dụng kính hiển vi tụ quang nền đen, phản ứng miễn dịch huỳnhquang, PCR, phương pháp nuôi cấy, chẩn đoán biến đổi vi thể cũng được sử

dụng Tuy nhiên, kỹ thuật PCR dùng để phát hiện chuỗi DNA của Leptospira

chỉ thực hiện ở các trung tâm lớn Có nhiều cặp mồi (primer) khác nhau đã

được thiết lập, trong đó một số đặc hiệu ở mức giống Leptospira nhưng một

số loại đặc hiệu ở mức serovar

1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis

Các nỗ lực phòng bệnh bao gồm trang bị bảo vệ để không tiếp xúc với độngvật có nguy cơ nhiễm bệnh, vệ sinh sạch sẽ sau khi tiếp xúc và tiêu diệt các loàigặm nhấm ở những khu dân cư [52] Việc sử dụng kháng sinh để ngừa bệnhkhông đem lại hiệu quả rõ ràng [7] Một số vắc xin dùng cho động vật để phòngvài loại xoắn khuẩn vàng da có thể làm giảm nguy cơ lây lan sang người Từ lâu,các nhà khoa học đã mong muốn tìm được một loại vắc xin hiệu quả để ngăn

ngừa bệnh do xoắn khuẩn Leptospira thông qua tiêm chủng cho người và động

vật có nguy cơ lây nhiễm cao Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu với chi phí hàngtriệu đô la, các nhà khoa học đã tìm được một số loại vắc xin phòng bệnhLeptospirosis Tuy nhiên cho đến nay, các loại vắc xin để phòng bệnh này vẫncòn hạn chế và chưa đạt hiệu quả cao trong ứng dụng lâm sàng [64]

Một số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis như: vắc xin sống [41], [15],vắc xin lipopolysaccharide (LPS) [22], [54], vắc xin lipoprotein [16] [37], [58],vắc xin protein màng ngoài (OMPs), [25], [46] và vắc xin các yếu tố độc lựctiềm năng [55], [68] Hiện nay, ở một số nước như Nhật Bản, Cuba và TrungQuốc đã có vắc xin phòng chống bệnh Leptospirosis cho người tuy nhiên chưa

được cấp phép sử dụng rộng rãi do cần phải tiếp tục nghiên cứu về độ an toàncủa vắc xin này Vắc xin áp dụng ở động vật chỉ có một vài chủng.

Vắc xin protein tái tổ hợp là loại vắc xin có tiềm năng lớn trong phòng

bệnh do xoắn khuẩn Leptospira Vắc xin protein tái tổ hợp được xây dựng với

phương pháp công nghệ sinh học hiện đại [49], [58], [59] nhưng trong đó vắcxin OMPs tái tổ hợp, vắc xin lipoprotein và vắc xin các yếu tố độc lực tái tổhợp được quan tâm hơn cả Những đặc trưng bảo vệ của vắc xin tái tổ hợp đãđược kiểm nghiệm, bao gồm: OmpL1, LipL41 [18], [29], hemolysis-associated protein 1 (Hap1) [14], và protein miễn dịch (Lig) [48] Năm 1993,lần đầu tiên OmpL1 được báo cáo [27] Sáu năm sau đó, nghiên cứu trênchuột mô hình đã chứng minh tác dụng gây miễn dịch của 2 loại vắc xinOmpL1 và LipL41 [29] Vào năm 2002, LigA được mô tả như một globulinmiễn dịch giống protein [48], sau đó các phản ứng miễn dịch của protein

LigA, LigB cũng được xác nhận [37], [49], [59] Hơn nữa, gen Lig đã được

chứng minh là hữu ích trong việc phát hiện bệnh xoắn khuẩn [47] Một sốprotein ngoài màng khác như LAg42, Loa22 [36], Lk73.5 [10] cũng đượccông nhận là nguyên liệu trong việc tạo vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn

Leptospira, tuy nhiên chúng vẫn chưa được tiến hành thử nghiệm trong các

mô hình động vật để phát triển thành vắc xin

Lipoprotein là protein quan trọng trong Leptospira, những protein có nhiều

ở màng ngoài và chúng được gắn thông qua các axit béo Mặc dù khó khăn trongviệc sản xuất lipoprotein do hệ thống biểu hiện dị hợp, nhưng một số loạilipoprotein như LipL41 [26], LipL32 [28], LipL45 [43] và LipL21 [17] đã đượckhẳng định là nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc tạo ra vắc xin lipoprotein tái

tổ hợp Ngoài ra, glucoproteins (GPLs) cũng được dự đoán là một trong nhữnggen tiềm năng, do khả năng sản xuất ra các yếu tố hoại tử khối u, interleukin-10

và CD69 [21] Loại GPLs này xuất hiện trong cả chủng gây bệnh L interrogans hoặc chủng không gây bệnh L biflexa Trong một vài công

trình nghiên cứu trước đây đã có báo cáo về yếu tố độc lực của Leptospira,

bao gồm FlaA, FlaB [52], Hsp58 [51], SphH [38], [39] và ChpK [53] đều cóthể được coi là nguồn nguyên liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh

Leptospirosis Gen mã hóa yếu tố độc lực FlaB (gen flab) có thể được khuếch

đại từ hệ gen DNA của nhiều chủng Tuy nhiên, một số kết quả nghiên cứu đãchỉ ra hàng loạt các protein ngoài màng (LAg42, Loa22, Lk73.5), lipoprotein(LipL32, LipL45, LipL21 và GLP) và các yếu tố độc lực mới được phát hiện(Hsp58, flaA, Flab, SphH và ChpK) có thể giúp chúng ta tìm thấy vắc xin phù

hợp hơn [44], [50], [67] Bởi vì hệ gen của L interrogans chủng Icterohaemorrhagiae Lai [55] và L interrogans chủng Copenhageni [45] có

biểu hiện dị hợp của OMPs, điều này mở ra một tiềm năng mới cho việc pháttriển vắc xin [70] Do vậy, vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn nói riêng cũng nhưcác loại vắc xin khác nói chung đã, đang và sẽ được nghiên cứu xa hơn để tạomột bức tường bảo vệ con người và động vật khỏi những tác nhân gây bệnh

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.3.1 Tình hình bệnh Leptospirosis

Tại Việt Nam, bệnh được Ragiot và Souchard phát hiện lần đầu tiên trênngười năm 1931 Tiếp đó, dịch bệnh bùng phát ở Lai Châu (1964) gây thiệt hạinhiều gia súc và nhiễm cho cả người [3] Bệnh Leptospirosis trên gia súc đượcnghiên cứu từ rất sớm (1968-1978), đã có nhiều tác giả nghiên cứu về bệnh, nhưĐào Trọng Đạt (1966), Lê Đại (1972), Phạm Quân (1976), Vũ Đình Hưng(1979), Nguyễn Thị Nhân (1999) và gần đây là Vũ Đạt, Lê Huỳnh Thanh

Phương (2001) Các tác giả đã tập trung nghiên cứu tình hình nhiễm Leptospira

ở một số loài gia súc, trong đó có bệnh xảy ra ở lợn Theo một số tác giả, các

loại gia súc và người chăn nuôi nhiễm xoắn khuẩn Leptospira với tỷ lệ 21 - 56% Các serovar Leptospira interrogans thường gặp ở gia súc là Grippotyphosa,

Australis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Hebdomadis [5]

Nguồn lây là các súc vật mang xoắn khuẩn Leptospira và nước tiểu của chúng Xoắn khuẩn Leptospira bài tiết từ cơ thể gia súc ra bên ngoài cùng với

nước tiểu làm ô nhiễm môi trường xung quanh, trong đó có nguồn nước

Trong nước, xoắn khuẩn Leptospira không chỉ tồn tại mà còn sinh sản và giữ

nguyên đặc tính gây bệnh Ổ chứa mầm bệnh thường là các loài gặm nhấm

(chuột), chúng luôn đào thải xoắn khuẩn Leptospira hoặc gia súc (trâu, bò,

ngựa…) Ở nước ta, bệnh hay gặp ở những người làm việc trong rừng và gầnrừng như bộ đội (biên giới), công nhân địa chất, lâm nghiệp, hầm mỏ, côngnhân chăn nuôi và nông dân qua da bị xây xát, qua vết thương hoặc qua niêmmạc do tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nguồn lây

Bệnh xoắn khuẩn vàng da cũng lưu hành rộng rãi ở nông thôn, thành thị,miền núi, đồng bằng, ven biển Các vùng sinh thái khác nhau có tỷ lệ nhiễm

Leptospira khác nhau và dao động từ 19,45% đến 31,31% Khoảng 20 năm

trước đây, nhiều nơi có dịch xoắn khuẩn vàng da ở súc vật nuôi, nhất là lợntrong các trại chăn nuôi và lây sang người Trong những năm gần đây, nguy

cơ bùng phát dịch bệnh nhiễm xoắn khuẩn Leptospira có chiều hướng ngày

càng gia tăng do tình hình vệ sinh môi trường thấp kém, úng ngập thườngxuyên, kéo dài và hệ thống kiểm soát bệnh gia súc còn yếu kém Bệnh gâythiệt hại nặng về kinh tế, đặc biệt ở những đàn gia súc sinh sản Trên các đànsinh sản, bệnh là nguyên nhân gây giảm khả năng sinh sản, sẩy thai; lợn consau khi sinh ra chậm lớn, còi cọc

Ở người, theo bác sĩ Lê Công Tảo, Phó trưởng khoa Sốt rét, Ký sinh trùngđộng vật (Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội) cho biết, Leptospirosis vốn đượccoi là bệnh ở các vùng núi, đầm lầy, nông thôn, nhưng hiện nay đã tràn xuốngvùng địa hình dân cư đông đúc, nghèo nàn tại các thành phố lớn [4] Mỗi năm

ở Hà Nội có 10 - 15 người mắc Từ tháng 4/1999 đến 12/2002, tại thành phố có

28 ổ dịch trên người Tại các khu dân cư, bến xe, bến tàu (nơi cư ngụ lý tưởng của

chuột) nguy cơ bùng phát dịch nhiễm xoắn khuẩn Leptospira là rất lớn Do

vậy, dịch bệnh xoắn khuẩn Leptospira vẫn là một vấn đề sức khỏe cấp thiết

cần quan tâm tại Việt Nam [2]

Hiện nay, Việt Nam vẫn nằm trong vùng dịch tễ học cao của bệnh xoắnkhuẩn [6] Nghiên cứu dịch tễ học mô tả sử dụng số liệu hồi cứu cho thấy, tổng

số ca mắc xoắn khuẩn được ghi nhận tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011 là 369

ca và không có trường hợp tử vong Người mắc bệnh mang tính chất nghềnghiệp rõ: công nhân làm vệ sinh cống rãnh, công nhân chăn nuôi, cán bộ địachất, lâm nghiệp hay mắc bệnh Mặc dù bệnh này luôn tiềm ẩn nguy cơ lâynhiễm cao cho người và động vật, nhưng lâu nay ít được chú ý cả về mặt phápluật cũng như về nhận thức của nhân dân Việc mua bán gia súc bừa bãi khôngđược kiểm tra chặt chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh ở gia súc ngàymột tăng, đồng thời nguy cơ lây nhiễm sang người cũng tăng theo [1]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis

Như đã nói ở trên, việc điều trị bệnh này là rất khó khăn chính vì vậy cần cónhững biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao Do đó, sản xuất vắc xin

phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết Tại Việt Nam

hiện có một số cơ sở đã sản xuất các loại vắc xin Leptospirosis, như vắc xin

Leptospira vô hoạt của Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương (Vetvaco).

Kháng nguyên là vi khuẩn Leptospira được vô hoạt bằng methiolat bao gồm 6 chủng: L interrogans serovar Pomona, L interrogans serovar Canicola, L.

interrogans serovar Mitis, L interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L interrogans serovar Bataviae và L interrogans serovar Grippotyphosa Chúng

tương đồng về mặt kháng nguyên với đa số các chủng gây bệnh Leptospirosisđang lưu hành tại Việt Nam Với 2 lần tiêm cho gia súc, nhưng thời gian tạomiễn dịch bảo hộ chỉ trong vòng 6 tháng Hoặc vắc xin vô hoạt PALATO.VACLcủa Công ty cổ phần Nanovet, có thể phòng 3 bệnh: khô thai, sẩy thai truyềnnhiễm và Leptospirosis Tương lai của việc phát triển vắc xin

phòng bệnh Leptospirosis là tìm ra một loại có khả năng phòng bệnh cho một

số lượng lớn người khỏe mạnh và động vật để làm tăng khả năng kháng bệnh,như vậy, vắc xin phải có độ an toàn cao [19], [24] Tuy nhiên, hiện nay tạiViệt Nam chỉ đang lưu hành 2 loại vắc xin Leptospirosis vô hoạt và nhượcđộc phòng bệnh cho gia súc Trong đó, các vắc xin nhược độc được thực hiệnbằng cách tiêm truyền các xoắn khuẩn đã được giảm độc lực vào vật chủ với

hi vọng giúp vật chủ tạo kháng thể chống lại bệnh xoắn khuẩn nhưng khôngkích thích sự phát triển của các loại xoắn khuẩn này đủ để gây bệnh cho cơthể đó Vắc xin vô hoạt Leptospirosis đã được nghiên cứu rộng rãi trong thập

kỷ 70-80 của thế kỷ 20 Những năm gần đây, việc sử dụng kết hợp cả vắc xinnhược độc và vô hoạt trong phòng bệnh cho hiệu quả phòng bệnh cao hơnnhưng để đảm bảo an toàn cho vật nuôi cũng như cho con người, chúng ta cầnđầu tư nhiều hơn nữa cho lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất vắc xin Leptospirosis

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

6 chủng xoắn khuẩn đang được sử dụng chế vắc xin vô hoạt phòng bệnhxoắn khuẩn Leptospirosis tại Việt Nam được nuôi cấy trong môi trường EMJH

tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y, bao gồm: L interrogans serovar Pomona, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Mitis, L interrogans serovar Icteroheamorrhagiae, L interrogans serovar Bataviae và L interrogans serovar Grippotyphosa.

2.2 Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Hóa chất tách DNA tổng số: gồm có đệm tách (Tris HCl 1M,pH=8,NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4% H2O), đệm rửa (Tris HCl 1M , EDTA0,5M, pH=8, H2O), dung dịch phenol-chloroform-isoamyl 25:24:1, dung dịchIsopropanol,

- Hóa chất điện di: Đệm TAE 50X: 57,1 ml CH3COOH, 100ml 0,5MEDTA, 242g TRIS - BASE, đệm TAE 1X, agarose, loading dye, ethidium bromide(EtBr)

- Các hóa chất phục vụ nhân gen: Taq polymerase (Fermentas) Cặp mồiđặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế

- Bộ kit dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR GeneJETTM PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA),…và một số hóa chất khác

2.2.2 Thiết bị

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị đã sử dụng

2 Bộ điện di Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd - Anh

5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ

6 Máy lắc Vortex IKA Minishaker MS1 - Đức

8 Máy đo quang phổ định

NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹlượng

2.3 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiêncứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Lấy mẫu: 6 chủng xoắn khuẩn (L interrogans serovar Pomona, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Mitis, L interrogans serovar Icteroheamorrhagiae, L interrogans serovar Bataviae và L interrogans serovar Grippotyphosa) sẽ được nuôi cấy trong các môi trường

đặc hiệu (môi trường Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris (EMJH) củahãng Difco (Detroit, USA) có bổ sung 8% huyết thanh thỏ và 0.1% agarosetrong một ống 5ml) ở 28oC trong điều kiện hiếu khí, sau bảy ngày nuôi cấy sẽđược chuyển về Viện Nghiên cứu hệ gen để tiến hành tách chiết DNA cho cácnghiên cứu tiếp theo

Tách chiết DNA tổng số từ 6 chủng xoắn khuẩn sử dụng phương phápphenol- chloroform theo như hướng dẫn [57] Cụ thể:

- Xoắn khuẩn sau khi được nuôi cấy, đạt yêu cầu về số lượng, cho dungdịch nuôi vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở

4oC Loại bỏ dung dịch nổi ở trên, thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống

- Chuẩn bị dung dịch đệm gồm: 10% SDS, Tris (100 mM), EDTA (50mM), 3 µl của proteinase - K 20 µg/ml, 5 µl của RNase A 20 µg/ml, cho vào

ống eppendorf 1,5ml có chứa cặn xoắn khuẩn, ủ ở 37oC trong 1 giờ

- Thêm vào một lượng tương đương dung dịch

phenol-chloroform-isoamyl , trộn đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC

- Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới Kết tủaDNA với một lượng tương đương isopropanol, ủ ở - 20oC/30 phút Sau đó ly

tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm

- Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % được làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ

qua lại, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10phút ở 4oC Thu kết tủa và làm khô ởnhiệt độ phòng.

- Hòa tan hoàn toàn DNA kết tủa trong dung dịch TE (10mM Tris HCl,

pH = 8,0 và 1 mM EDTA)

- Bảo quản sản phẩm trong tủ ở nhiệt độ -20oC để phục vụ cho các

nghiên cứu tiếp theo

2.4.2 Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số

A280 là chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm

Nếu tỷ lệ A260/A280 = 1,8 - 2,0 thì sản phẩm DNA tổng số được tách chiết làtinh sạch

2.4.2.2 Phương pháp điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml,agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trongmáy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE Trộn đều1l dung dịch 6Xloading buffer với 5 l mẫu, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện mộtchiều với điện thế 110V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ rangâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra Quan sát trênmáy soi gel và chụp ảnh

Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA

trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.

2.4.3 Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32,

LipL41, LipL21, LigA, LigB

Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB dựa trên các thông tin về trình tự của các gen được công

bố trên ngân hàng gen quốc tế (Genbank)/NCBI và chương trình

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

2.4.4 Kỹ thuật PCR

Sau khi tách chiết được DNA tổng số, thực hiện khuếch đại trình tự gen

16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB bằng phản

ứng PCR

Thành phần phản ứng PCR nhân gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41,

LipL21, LigA, LigB của 6 chủng xoắn khuẩn được trình bày ở bảng sau:

Hình 2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân gen

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gelagarose 1% với sự có mặt của marker chuẩn, nhuộm bản gel trong EtBr vàchụp ảnh dưới ánh sáng cực tím

2.4.5 Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA

Trong sản phẩm PCR, ngoài đoạn gen đặc hiệu đã được nhân lên còn lẫntạp với 1 lượng primer, dNTP dư và enzyme DNA polymerase Những chấtlẫn tạp này có khả năng ảnh hưởng đến phản ứng giải trình tự Sanger (sử dụng

ddNTP) Vì vậy, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA theo hướng dẫn của bộ kít GeneJETTM PCR Purification Kit (Thermo

Fisher Scientific Inc., USA)

Quy trình làm sạch sản phẩm PCR như sau:

- Bổ sung đệm hòa tan (Binding Buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VBB = 1 : 1(quy ước 100μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl Binding Buffer tương đương 100μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl mẫu), trộn đều và quan sátmàu của dung dịch Màu vàng cho thấy độ pH tối ưu để hòa tan DNA Nếudung dịch có màu cam hoặc tím, bổ sung thêm 10μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl Natri axetat 3M, pH 5,2

và trộn đều sẽ chuyển sang màu vàng

- Thêm vào thể tích isopropanol 100% với tỷ lệ 1: 2 (Ví dụ, 100 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấylisopropanol nên được thêm vào 100 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl hỗn hợp PCR kết hợp với 100 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl BindingBuffer) Trộn kỹ

- Chuyển 800 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyL dung dịch từ bước 1 (hoặc bước 2) tới cột tinh sạch GeneJET, ly tâm 30-60 giây Loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Bổ sung 700μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl đệm rửa WB (Washing Buffer) lên cột Ly tâm 30-60 giây Loại bỏ dịch chảy qua cột và đặt cột vào ống thu

- Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB

- Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 50μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl nước cất đã khửtrùng lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm

13000 vòng/phút trong 1 phút

- Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới Bảo quản ở -20oC

- Điện di kiểm tra sản phẩm sau tinh sạch

2.4.6 Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn

Giải trình tự với máy giải trình tự AB 3500 (Applied Biosystems, USA)tại Viện Nghiên cứu hệ gen Quy trình được tóm tắt như sau:

Các sản phẩm PCR được giải trình tự theo phương pháp chuỗidideoxynucleotide Các đoạn DNA được khuếch đại trong 10 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl thể tích phảnứng (bao gồm: 2 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl BigDye Terminator v3.1, 1μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl dung dịch BigDyeSequencing, 1 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl primer (10 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyM), 2 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl DNA và 4 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl nước) Chu trình khuếchđại như sau: biến tính ở 96oC trong 1 phút, sau đó là 96oC trong 10 giây ở 25chu kỳ, ủ ở 50oC trong 5 giây, kéo dài ở 60oC trong 4 phút Tiếp theo, cácmẫu được tinh chế và ủ với 20 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyl Hi-Di, và bị làm biến tính ở 98°C trong 2phút Cuối cùng, các mẫu này được chuyển lên màng và giải trình tự bằngcách sử dụng POP6 và một mao mạch 36 cm Các điều kiện chạy giải trình tựnhư sau: 22 giây cho thời gian bơm mẫu, 1 kV cho điện áp bơm, 15 kV chođiện áp chạy, 10 μm, dài 5- 25μm Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấyAmps cho dòng chảy và 55oC cho nhiệt độ chạy

2.4.7 Phân tích và xây dựng sơ đồ hình cây phân loại 6 chủng Leptospira

- Các trình tự tham chiếu của gen 16S rDNA dùng trong nghiên cứu này

được lấy từ cơ sở dữ liệu NCBI với các công cụ tin sinh BLAST và BLAST

PSI Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại thông qua trình tự của

các gen 16S rDNA với các thuật toán ClustalW thực hiện trong MEGA 4.0 Xác

suất biến đổi và vùng bảo tồn giữa các trình tự liên quan được thực hiện bởiMEGA 4.0 và BioEdit 7.0.4.1