Xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn leptospira interrogans gây bệnh leptospirosis tại việt nam​

ĐAỊ HOCC̣ THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - NĂM 2017 ĐAỊ HOCC̣ THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Bích Thủy THÁI NGUYÊN, NĂM 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phịng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, người tận tình bảo, hướng dẫn q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu khoa học Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, KS Phạm Thùy Linh anh chị em, cán phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng yêu thương biết ơn sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp - người tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả q trình học tập hồn thành luận văn Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả Trần Thị Thanh Huệ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi trực tiếp thực với giúp đỡ cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn khoa học TS Võ Thị Bích Thủy Các tư liệu trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huệ i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira 1.2 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis 10 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.3.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 14 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.2 Hóa chất, thiết bị 16 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2 Thiết bị 17 2.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18 ii 2.4.2 Định lượng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 19 2.4.3 Thiết kế cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 20 2.4.4 Kỹ thuật PCR 20 2.4.5 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA .21 2.4.6 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 22 2.4.7 Phân tích xây dựng sơ đồ hình phân loại chủng Leptospira 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Phân loại học phân tử chủng Leptospira .24 3.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số .24 3.1.2 Trình tự cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 26 3.1.3 Nhân gen với cặp mồi gen 16S rDNA 27 3.1.4 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA 28 3.1.5 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 29 3.1.6 Phân tích xây dựng phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn .30 3.2 Xác định có mặt gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 Kết luận .41 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC K bp dH2O DNA dNTPs EDTA EMJH EtBr FRKb L MLST OMP PCR RNA SDS TAE iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục 2.2 Thành phần ph 3.1 3.2 3.3 Giá trị mật độ 280nm Trình tự cặp m Các lồi Lepto liệu GenBank v DANH MỤC HÌNH Hình Tên hìn Leptospira interrogans Chu kì nhiệt phản ứng PCR n 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số củ 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n tinh 3.4 Hình ảnh phát sinh chủng loạ 3.5.a Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n 3.5.b Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n 3.5.c Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n 3.5.d Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n 3.5.e Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n 3.5.f Hình ảnh điện di sản phẩm PCR n MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến giới, Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal HealthOIE) xếp vị trí thứ nhóm bệnh nguy hiểm bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp Việt Nam Nguyên nhân gây loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans Leptospira interrogans lồi gây bệnh thường kí sinh người động vật, bao gồm 200 typ, chia thành 23 nhóm (trong Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất) Xoắn khuẩn có khả gây bệnh động vật lây sang người Bệnh xoắn khuẩn gây gọi bệnh vàng da, gây ảnh hưởng đến quan gây sẩy thai thú ni Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu mẫu mô động vật mắc bệnh Bệnh phát triển khắp nơi giới, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Do tính đa dạng triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn đốn tỷ lệ tử vong cao Việc điều trị bệnh khó khăn nên địi hỏi biện pháp phịng ngừa bệnh có hiệu cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira yêu cầu cấp thiết Trong trình nghiên cứu ứng dụng, nhà khoa học tập trung vào loại vắc xin có khả phịng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng động vật Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc thiết kế dựa sở trình tự gen yếu tố độc lực tác nhân gây bệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn loại vắc xin Đây bước đột Emiroglu Nedret, Badur Selim, Van Damme Pierre (2005), Vaccine safety controversies and the future of vaccination programs, The Pediatric infectious disease journal, 24(11): p 953-961 25 Gebriel AM, G Subramaniam, and SD Sekaran (2006), The detection and characterization of pathogenic Leptospira and the use of OMPs as potential antigens and immunogens, Trop Biomed, 23(2): p 194-207 26 Guerreiro Hygia, Croda Júlio, Flannery Brendan, Matsunaga James Reis, Mitermayer Galvaxo (2001), Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans, Infect, Immun 27 Haake DA, Champion CI, Martinich C, Shang ES, Blance DR, Miller JN, Lovett MA (1993), "Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp" Journal of bacteriology, 175(13): p 4225-4234 28 Haake David A, Chao Garlo, Zuerner Richard L, Barnett Jeanne K, Barnett Dean, Mazel Mary, Matsunaga James, Levett Paul N, Bolin Carole A (2000), The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection, Infection and immunity, 68(4): p 2276-2285 29 Haake David A, Mazel Mary K, McCoy Adam M, Milward Frank, Chao Garlo, Matsunaga James, Wagar Elizabeth A (1999), Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection, Infection and immunity, 67(12): p 65726582 30 Hu Weilin and Yan Jie (2014), Leptospira and leptospirosis in China, Current opinion in infectious diseases, 27(5): p 432-436 31 Hübener EA and Reiter Hans (1915), Beiträge zur Aetiologie der Weilschen Krankheit, Dtsch,Med, Wochenschr., 41: p 1275-1277 32 Inada R and Ido Y (1915), A report of the discovery of the causal organism (a new species of spirocheta) of Weil’s disease, Tokyo Ijishinshi, 1908: p 351-360 33 Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune (1918), "INTRAVENOUS SEROTHERAPY OF WEIL'S DISEASE (SPIROCHỈETOSIS ICTEROHỈMORRHAGICA)", The Journal of experimental medicine, 27(2): p 283 34 Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune (2014), B-cell-specific peptides of Leptospira interrogans LigA for diagnosis of patients with acute leptospirosis, Clinical and Vaccine Immunology, 21(3): p 354-359 35 Koizumi N and Watanabe H (2005), "Leptospirosis vaccines: past, present, and future", Journal of postgraduate medicine, 51(3): p 210 36 Nobuo Koizumi and Haruo Watanabe (2003), Molecular cloning and characterization of a novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain, FEMS microbiology letters, 226(2): p 215-219 37 Koizumi Nobuo and Watanabe Haruo (2004), Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity, Vaccine, 22(11): p 1545-1552 38 Lee Seoung Hoon, Kim Kyung A, Park Yong Gun, Seong In Wha, Kim Min Ja, Lee Yong Ju (2000), Identification and partial characterization of a novel hemolysin from Leptospira interrogans serovar Lai, Gene, 254(1): p 19-28 39 Lee Seoung Hoon, Kim Sangduk, Park Seung Chul, Kim Min Ja (2002), Cytotoxic activities of Leptospira interrogans hemolysin SphH as a pore-forming protein on mammalian cells, Infection and immunity, 70(1): p 315-322 40 Levett Paul N, Branch Songee L, Whittington Carol U, Edwards Charles N, Paxton Helene (2001), Two methods for rapid serological diagnosis of acute leptospirosis, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 8(2): p 349-351 41 Li Chunhao, Motaleb A, Sal Melanie, Goldstein Stuart F, Charon Nyles W (2000), "Spirochete periplasmic flagella and motility", Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p 345354 42 Maneewatch Santi, Adisakwattana Poom, Chaisri Urai, Saengjaruk , Patcharin, Srimanote Potjanee, Thanongsaksrikul Jeeraphong, Sakolvaree Yuwaporn, Poungpan Phakkanan, Chaicumpa Wanpen (2014), Therapeutic epitopes of Leptospira LipL32 protein and their characteristics, Protein Engineering Design and Selection: p gzu006 43 Matsunaga James, Young Tracy A, Barnett Jeanne K, Barnett Dean, Bolin Carole A, Haake David A (2002), Novel 45-kilodalton leptospiral protein that is processed to a 31-kilodalton growth-phaseregulated peripheral membrane protein, Infection and immunity, 70(1): p 323-334 44 McBride AJ Athanazio DA, Reis MG, Ko AI (2005), Leptospirosis, Curr Opin Infect Dis 5(18): p 45 Nascimento Ana Lucia Tabet Oller do, Verjovski-Almeida S, Van Sluys MA, Monteiro-Vitorello CB, Camargo LEA, Digiampietri LA, Harstkeerl RA, Ho PL, Marques MV, Oliveira MC (2004), "Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni", Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 37(4): p 459477 46 Oliveira Thaís Larré, Grassmann André Alex, Schuch Rodrigo Andrade, Neto Amilton Clair Pinto Seixas, Mendonỗa Marcelo, Hartwig Daiane Drawanz, McBride Alan John Alexander, Dellagostin Odir Antonio (2015), Evaluation of the Leptospira interrogans Outer Membrane Protein OmpL37 as a Vaccine Candidate, PloS one, 10(11): p e0142821 47 Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Chang Chao-Fu, Pan MJ Yang CW, Harpending Peter, McDonough Sean P, Dubovi Edward, Divers Thomas, Qu Jiaxin (2005), Evaluation of lig-based conventional and real time PCR for the detection of pathogenic leptospires, Molecular and cellular probes, 19(2): p 111-117 48 Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Jusuf SSD, Artiushin S, Timoney John F, McDonough Sean P, Barr Steve C, Divers Thomas J, Simpson Kenneth W, McDonough Patrick L (2002), Cloning and molecular characterization of an immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans, Infection and immunity, 70(11): p 5924-5930 49 Palaniappan Raghavan UM, McDonough Sean P, Divers Thomas J, Chen Chia-Sui, Pan Ming-Jeng, Matsumoto Mitsuharu, Chang Yung-Fu (2006), Immunoprotection of recombinant leptospiral immunoglobulin-like protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection, Infection and immunity, 74(3): p 1745-1750 50 Palaniappan Raghavan UM, Ramanujam Subbupoongothai, and Chang Yung-Fu (2007), Leptospirosis: pathogenesis, immunity, and diagnosis Current opinion in infectious diseases, 20(3): p 284-292 51 Park Se-Hoon, Ahn Byung-Yoon, and Kim Min-Ja (1999), Expression and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58 of Leptospira species: a major target antigen of the humoral immune response, DNA and cell biology, 18(12): p 903-910 52 Picardeau M (2013), Diagnosis and epidemiology of leptospirosis, Médecine et maladies infectieuses, 43(1): p 1-9 53 Picardeau Mathieu, Bauby Hélène, and Saint Girons Isabelle (2003), Genetic evidence for the existence of two pathways for the biosynthesis of methionine in the Leptospira spp, FEMS microbiology letters, 225(2): p 54 257-262 Priya C Gowri, Bhavani K, Rathinam SR, Muthukkaruppan VR (2003), "Identification and evaluation of LPS antigen for serodiagnosis of uveitis associated with leptospirosis", Journal of medical microbiology, 52(8): p 55 667-673 Ren Shuang-Xi, Fu Gang, Jiang Xiu-Gao, Zeng Rong, Miao You- Gang, Xu Hai, Zhang Yi-Xuan, Xiong Hui, Lu Gang, Lu Ling-Feng (2003), Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing, Nature, 422(6934): p 888-893 56 Rettinger Anna, Krupka Inke, Grünwald Karola, Dyachenko Viktor, Fingerle Volker, Konrad Regina, Raschel Heribert, Busch Ulrich, Sing Andreas, Straubinger Reinhard K (2012), Leptospira spp strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene sequencing and multi locus sequence typing (MLST), BMC microbiology, 12(1): p 185 57 Sambrook (2011), Molecular cloning: a laboratory manual 58 Seixas Fabiana Kömmling, Fernandes Claudia Hartleben, Hartwig Daiane Drawanz, Conceicao Fabricio Rochedo, Aleixo Jose Antonio Guimaraes, Dellagostin Odir Antonio (2007), "Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against leptospirosis", Canadian journal of microbiology, 53(4): p 472-479 59 Silva Éverton F, Medeiros Marco A, McBride Alan JA, Matsunaga Jim, Esteves Gabriela S, Ramos João GR, Santos Cleiton S, Croda Júlio, Homma Akira, Dellagostin Odir A (2007), The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis, Vaccine, 25(33): p 6277-6286 60 Smythe Lee D, Smith Ina L, Smith Greg A, Dohnt Michael F, Symonds Meegan L, Barnett Leonie J, McKay David B (2002), A quantitative PCR (TaqMan) assay for pathogenic Leptospira spp, BMC infectious diseases, 2(1): p 13 61 Talwani Rohit, Gilliam Bruce L, and Howell Charles (2011), Infectious diseases and the liver, Clinics in liver disease, 15(1): p 111130 62 Vanasco Norma Bibiana, Schmeling MF, Lottersberger Javier, Costa Federico, Ko Albert Icksang, Tarabla Héctor Dante (2008), Clinical characteristics and risk factors of human leptospirosis in Argentina (1999–2005), Acta Tropica, 107(3): p 255-258 63 Vedhagiri K, Natarajaseenivasan K, Chellapandi P, Prabhakaran SG, Selvin Joseph, Sharma S, Vijayachari P (2009), Evolutionary implication of outer membrane lipoprotein-encoding genes ompL1, lipL32 and lipL41 of pathogenic Leptospira species, Genomics, proteomics & bioinformatics, 7(3): p 96-106 64 Wang Zhijun, Jin Li, and Węgrzyn Alicja (2007), Leptospirosis vaccines, Microbial Cell Factories, 6(1): p 39 65 Wasinski Bernard and Dutkiewicz Jacek (2013), Leptospirosis- current risk factors connected with human activity and the environment, Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 20(2) 66 Xiao Di, Zhang Cuicai, Zhang Huifang, Li Xiuwen, Jiang Xiugao, Zhang Jianzhong (2015), "A novel approach for differentiating pathogenic and non-pathogenic Leptospira based on molecular fingerprinting", Journal of proteomics, 119: p 1-9 67 Yanagihara Yasutake, Villanueva Sharon YAM, Yoshida Shin- ichi, Okamoto Yoshihiro, Masuzawa Toshiyuki (2007), Current status of leptospirosis in Japan and Philippines, Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 30(5): p 399-413 68 Yang Hong-Liang, Zhu Yong-Zhang, Qin Jin-Hong, He Ping, Jiang Xu-Cheng, Zhao Guo-Ping, Guo Xiao-Kui (2006), In silico and microarray-based genomic approaches to identifying potential vaccine candidates against Leptospira interrogans, BMC genomics, 7(1): p 293 69 Ye Cuilian, Yan Weiwei, McDonough Patrick L, McDonough Sean P, Mohamed Hussni, Divers Thomas J, Chang Yung-Fu, Yang Zhibang (2014), Serodiagnosis of equine leptospirosis by enzymelinked immunosorbent assay using four recombinant protein markers, Clinical and Vaccine Immunology, 21(4): p 478-483 70 Zuerner Richard, Haake David, Adler Ben, Segers Ruud (2000), "Technological advances in the molecular biology of Leptospira", Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p 455-462 PHỤ LỤC Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Bataviae GACCGGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGAA GGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCAGC AATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCAT TGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAA ACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGA GTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCG TAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCT AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAAGGTTGTCTACCAGTTGTTGG GGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGC CTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAATGAAATTTGACGG Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Mitis GGCCCAAGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGA AGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCMSGGAAAAATAAGCAG CAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCATT GGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAAA CTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGAG TTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGT AGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCTA AAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTAA ATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTTGGG GGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGCCT GGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGGA Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Pomona GGATGGCCGTCCCAGGGCGGTCTACTTAATCCGTTAGGTTCGTTAC TGAGGGTTAAAACCCCCAACAACTGGTAGACCACGTTTAGGGCGT GGATTACCGGGGTATCTAATCCCGTTCACTACCCACGCTTTCGTGC CTCAGCGTCAGTTTTAGGCCAGCAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTT CCTCCAGATATCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCCACTT GCCTCTCCCAAACTCCAGACACATAGTTTCAAGTGCAGGCTGCGA GTTGAGCCCGCAGTTTTCACACCTGACTTACATGTCCGCCTACGCA CCCTTTACGCCCAATGATTCCGAACAACGCTTGCACCATACGTATT ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTTAGGCAGGTAC CATCATCACATTGCTGCTTATTTTTCCCTGCTTACTGAACTTTACAA TCCGAAGACCTTCATCGTTCACGCGGCGTCGCTGCTTCAGGGTTCC CCCCAATATAGAATAATCCTAATCGGCCGTGCCCCATCAGCCAAG GCATTAATAACCCTGGCCAAGGGGGGGGAAACCCAAAAACCCCCC CCCCCGAGAAAGAAAAAATTTCCCCAATAGTAAAATTTTTCAAAA AGGGGGAAAAAAAAAACCCCCCGGGGAAAAAGGGTCCCCCCCCA AAGCCCCGAAAAAAGGGGGCCCCCCCGGGGAAAAAAATAAGGGG GGAAATGTTTTTAACAAAAAATTGCGGGCAAACAGGGGGGGGAG GGGGGGAAATAGATATTAGGTGGGATAAAAAACGAGACGCGCGG GGTGTTGCAAAAAAAACCTTTGCGCGTAGTGGTGAGAGAGAGAAG AGACCCCCTCTCCCGCGTGGGGCGCGGGGAAATATTATAATATTTT GGAAAGACACATCACGAGCAGACCAGCATTAAGGTATAACACTAG CTAAACTAGACTGAGCATACGA Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Canicola GGGCGTGGGGGGCAAATCTGACCACCCATGCCGCGTGAAGGATGA AGGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATAGGGGGCGAAAAAAGG GAAATCTTTCTCACTTGACCGTACCCTATGAATAACACACCGGCTA ACTCCGTGCCAGCAAACCGCGGTACATACGGAGGGTGCAAGCGTT ATCCGGATTCACTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGGCGTATAAG TCAAATGGTGAAATCCTGGAGCTTATCTCCAGAACTGCCATTGATA CTATATGTCTTGAATATGGTGGAGGTAACCGGAATATGTCATGTAG CGGTGAAATGCATAAATATGAACATAGAACACCTATTGCGAAGGC GGCTTACTACGCCTATTTTGACCCTAAGGCACGAAAGCGTGGGGA TCAAACAGGATTAGATACCCTGGTACTCCACGCCCTAAACCATGAT TACTCGACGTGTGCGATAAACGGTACGCGTCTGAGCGAAAGCATT AAGTAATCCACCTGGGAAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAT GAAATTGACGG Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Grippotyphosa TTAACCTTGGGGGCACCTGTATCAGCGCAGGCCGCGTGAACGACG AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCATTAGGCAGGGAAAAATAAGCA ACCTTGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGATAACTACCTGC CAGCAACCGCGGTAATACCTATGGGGCAAGCGTTGTTCGGAATCA TTGGGCGTAAAGGGTGCGTAAGCGGACATGTAATTCAAGTGTGAA AACTGCGGGCTCACCTCATAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGG AGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTACCGGTGAAATGC GTAAATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCACTTGCTGGCCT AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCACTTGTTGG GGGTTTTAACCCTCATTAACGAACCTAACGGATTAACTAGACCGCC TGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGG Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Icteroheamorrhagiae GCACGGAGGGGGGGCACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATG AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCA GCAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGKGCAAGCGTTGTTCGGAATC ATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGA AAACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTG GAGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCRGGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGC CTAAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGAT TAGATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTT GGGGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACC GCCTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAAATTGAC GGATAGCAAACCAAGAGTCTTGCTCACTGGGGGGAACCCTGAAGC ATTCACAACGCATGAGCCATCAACGTCGTCCAATTGTAAAAGTTCC CTAAGCAGGGAAGTATAARCAGCATGCTGAATGATTGTACCTGCC TAAAGGCACGGCTAATTACGTGCCGCRTCGGCCTAATACATTATGG GTGCAACGGGTTGTTTAGGAATCATTAGTAACGTAGAGAGGGCGA TATAGGGCGGAACATCGACAAGTCAGGATGTGAAAACTGGCGTGC TCACTACACTGCAATAGAAAAATAAACGTTATTCGAGGAGTTTCG GGAACAAGCAAATGATAATTCCCAGGATGTCACAAGGTGACAACC GTGGCTACAAAATRTCTCTCAGACAGGGA ... THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT... phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài ? ?Xác định số gen mã hóa yếu tố định kháng nguyên xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis. .. - Xác định có mặt số gen mã hóa kháng nguyên chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng chế vắc xin vô hoạt Việt Nam 4 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira