NGHIÊN cứu CHẾ tạo vắc XIN tái tổ hợp PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN leptospira interrogans gây RA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Tuấn Hùng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY RA LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Tuấn Hùng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY RA Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy GS.TS Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội – 2022 LỜI CÁM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS Nghiêm Ngọc Minh - Nguyên Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen PGS.TS Võ Thị Bích Thủy – Trưởng Phịng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Trong suốt q trình học tập nghiên cứu, nhận hướng dẫn tận tình khích lệ động viên thầy hướng dẫn, động lực lớn lao giúp không ngừng phấn đấu cố gắng vượt qua nhiều khó khăn để hồn thành Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp Phịng Hệ gen học vi sinh, Phịng R&D Cơng ty Vetvaco tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu đơn vị Bằng tình cảm chân thành nhất, xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ q báu Trong q trình nghiên cứu học tập, nhận ý kiến đóng góp quý báu nhà khoa học, cán nghiên cứu Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Những nhận xét góp ý chun mơn sâu sắc buổi báo cáo, hội thảo giúp hồn thiện tốt Luận án Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, tập thể cán Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè đồng hành nguồn động viên tinh thần lớn lao tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành Luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nguyễn Tuấn Hùng LỜI CAM ĐOAN Tôi là: Nguyễn Tuấn Hùng, nghiên cứu sinh Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, chuyên ngành Công nghệ sinh học xin cam đoan: 1- Đây Luận án thân trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn Thầy: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy GS.TS Nghiêm Ngọc Minh 2- Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác đƣợc công bố Việt Nam 3- Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, đƣợc xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nguyễn Tuấn Hùng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Từ viết tắt Tên tiếng Việt µl Microliter Micro Lít APS Ammonium persulphate Ammonium persulphate bp Base pair Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết bò CBB Coomasie Brilliant Blue Thuốc nhuộm gel SDS cs et.al Cộng dH2O Distilled water Nƣớc khử ion DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme nuclease Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotit Triphosphate Triphosphate Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli dNTP E.coli Ethylene Diamine Tetraacetace EDTA IPTG Acid Isopropyl β-D-1thiogalactopyranosid Axit aminopolycarboxylic Chất cảm ứng biểu gen Kb Kilobase Kilobasơ kDa Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria - Bertani Môi trƣờng LB LD50 Lethal Dose, 50% Liều gây chết 50% L interrogans Leptospira interrogans ml Milliliter Milli Lit OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate buffer saline Nƣớc muối đệm phốt phát PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polimeraza Xoắn khuẩn Leptospira interrogans Tên đầy đủ Từ viết tắt Tên tiếng Việt Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE polyacrylamide gel Điện di polyacrylamide electrophoresis Dung dịch đệm TAE TAE buffer Tris-acetate-EDTA Taq Taq polymerase TE Tris EDTA Đệm TE chứa Tris N,N,N,N- Hóa chất đƣợc sử dụng Tetramethylethylenediamine đúc gel polyacrylamide Enzyme DNA polymerase chịu TEMED nhiệt DANH MỤC CÁC BẢNG Số TT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Nhóm huyết số serovar L.interrogans Bảng 2.1 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR nghiên cứu 32 Bảng 2.2 Hỗn hợp phản ứng PCR (10 µl) 33 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt vector 37 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nối gen vào vector 38 Bảng 2.5 Thành phẩn gel acrylamide 40 Bảng 2.6 Công thức chia nhóm dung dịch tiêm mẫm cảm 46 Bảng 2.7 Chuẩn bị ống nghiệm thêm vào chất 48 Bảng 3.1 Số lƣợng trình tự vùng giàu epitop gen LipL21 đƣợc 66 dự đoán cơng cụ tin sinh Bảng 3.2 Trình tự mồi đặc hiệu nhân dòng đoạn gen LipL21 69 Bảng 3.3 Kết kiểm tra ngƣng kết với chất bổ trợ nhũ dầu 86 Bảng 3.4 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin 87 Bảng 3.5 Kết kiểm tra an tồn vắc xin động vật thí nghiệm 87 Bảng 3.6 Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin phản ứng vi ngƣng kết 88 Bảng 3.7 Kết kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc 95 Bảng 3.8 Kết kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma 96 Bảng 3.9 Kết kiểm tra tạp nhiễm Salmonella 97 Bảng 3.10 Kết kiểm tra an toàn vắc xin động vật thí nghiệm 98 Bảng 3.11 Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin phản ứng vi ngƣng kết 99 Bảng 3.12 Kết tiêm thử nghiệm vắc xin động vật thực địa 100 DANH MỤC CÁC HÌNH Số TT Tên Hình Trang Hình 1.1 Hình dạng Leptospira interrogans dƣới kính hiển vi điện tử quét Hình 1.2 Leptospira interrogans dƣới KHV đen (x400) Hình 1.3 Sơ đồ lây truyền Leptospira 13 Hình 1.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospirosis hàng năm 16 Hình 2.1 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR nhân gen 33 Hình 2.2 Mơ tả q trình tiêm vắc xin rLipL21 đánh giá hiệu tạo 54 miễn dịch chuột thí nghiệm Hình 3.1 Hình ảnh sau ly tâm thu xoắn khuẩn 55 Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số 56 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mồi 16S rRNA 56 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR mồi 16S rRNA sau tinh 57 Hình 3.5 Hình ảnh trình tự phần đoạn gen 16S rRNA chủng 58 Leptospira Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn nghiên cứu o Hình 3.7 A Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi OmpL1 Tm 55 C 59 61 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigA Tm 55 oC 61 o Hình 3.7 C Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigB Tm 55 C 61 o Hình 3.7 D Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL21 Tm 50 C 61 Hình 3.7 E Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL32 Tm 50 oC 62 Hình 3.7 F Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL41 Tm50 oC 62 Hình 3.8A Điện di đồ sản phẩm nhân toàn gen LipL21 63 Hình 3.8B Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen LipL21 63 Hình 3.9 Trình tự nucleotit gen LipL21 64 Hình 3.10 Trình tự axit amin gen LipL21 65 Hình 3.11 Cấu trúc 3D gen LipL21 chủng xoắn khuẩn 65 Hình 3.12 Tạo, sàng lọc kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 tế 71 Hình 3.7 B bào E.coli DH10b Hình 3.13 Kết so sánh trình tự gen LipL21 05 chủng Leptospira trình tự gen LipL21 plasmid 72 Số TT Hình 3.14 Tên Hình Tạo, sàng lọc kiểm tra dòng tái tổ hợp pET32a-LipL21 tế Trang 75 bào E.coli BL21 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự gen LipL21 Leptospira interogen 76 trình tự gen LipL21 plasmid Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm protein tái tổ hợp LipL21 E coli BL21 77 Hình 3.17 Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu điều kiện 78 nhiệt độ ni cấy cảm ứng khác Hình 3.18 Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu điều kiện 79 nồng độ cảm ứng IPTG khác Hình 3.19 Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu điều kiện 80 thời gian cảm ứng IPTG khác Hình 3.20 Định lƣợng Bradford phân đoạn tinh 81 Hình 3.21 Điện di đồ sản phẩm biểu pET32a-LipL21 81 E coli BL2 tinh Hình 3.22 Kết ngƣng kết kháng nguyên protein tái tổ hợp 82 LipL21 với nồng độ khác 100µg, 250µg, 500µg kháng thể thu đƣợc từ thỏ Hình 3.23 Kết phản ứng MAT chủng Leptospira sống 83 huyết thu đƣợc Hình 3.24 Phản ứng vi ngƣng kết protein tái tổ hợp LipL21 đƣợc phối 86 trộn với nhũ dầu với liều tiêm 1ml 2ml Hình 3.25 Tỷ lệ chuột tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 sống/ chết sau công 89 cƣờng độc xoắn khuẩn Leptospira Hình 3.26 Hình ảnh chụp thay đổi mô bệnh học thận gan 89 chuột thí nghiệm Hình 3.27 Kết phản ứng Western blot kháng nguyên tái tổ hợp 91 rLipL21 kháng thể đặc hiệu Hình 3.28 Máy tạo nhũ L4RT (Hãng Silverson - Anh Quốc) 94 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án Mục tiêu nghiên cứu luận án Các nội dung nghiên cứu luận án Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Bố cục luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira bệnh Leptospirosis 1.1.1 Đặc điểm sinh học xoắn khuẩn Leptospira 1.1.1.1 Phân loại học 1.1.1.2 Cấu trúc hình thái 1.1.1.3 Đặc tính ni cấy xoắn khuẩn Leptospira 1.1.1.4 Sức đề kháng mầm bệnh 1.1.1.5 Tính sinh miễn dịch 10 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ học 11 1.1.2.1 Nguồn bệnh 11 1.1.2.2 Đường xâm nhập mầm bệnh 12 1.1.2.3 Đặc tính gây bệnh xoắn khuẩn Leptospira 13 1.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis 14 1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis giới 14 1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis gia súc người 16 Việt Nam 1.2 Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira 18 108 29 World Organisation for Animal Health, 2008, Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees), Office International Des Epizooties, 30 TLĐLĐVN, 1991, Bổ sung số bệnh nghề nghiệp Thông tư liên Bộ Y tế, Bộ Lao động- Thương binh xã hội, Tổng Liên đoàn lao động Việt Nam, 31 Alston J.M., Brown H.C., 1937, The Epidemiology of Weil's Disease: (Section of Epidemiology and State Medicine), Proceedings of The Royal Society of Medicine, 30(6), pp 741-56 32 Vanasco N.B., Schmeling M.F., Lottersberger J., Costa F., Ko A.I., Tarabla H.D., 2008, Clinical characteristics and risk factors of human leptospirosis in Argentina (1999-2005), Acta Tropica, 107(3), pp 255-8 33 Schneider M.C., Tirado M.C., Rereddy S., Dugas R., Borda M.I., Alvarez P.E., Aldighieri S., Cosivi O., 2012, Natural disasters and communicable diseases in the Americas: Contribution of Veterinary Public Health, Vet Ital, 48(pp 193-218 34 Costa F., Martinez-Silveira M.S., Hagan J.E., Hartskeerl R.A., Reis M.G.D., Ko A.I., 2012, Surveillance for leptospirosis in the Americas, 1996–2005: A review of data from ministries of health, Rev Panam Salud Publica, 32(pp 169–177 35 Lê Huỳnh Thanh Phƣơng, 2001, Tình hình nhiễm Leptospira chó số địa phương phía Bắc Việt Nam biện pháp phòng trị bệnh, Luận án Tiến sĩ Khoa học Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội 36 Hoàng Mạnh Lâm, Đậu Ngọc Hào, Đào Xuân Vinh, 2002, Xác định số chủng huyết Leptospira chó, chuột ngƣời Đăk Lăk, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, IX(1), pp 13-18 37 Wagenaar J., Zuerner R.L., Alt D., Bolin C.A., 2000, Comparison of polymerase chain reaction assays with bacteriologic culture, immunofluorescence, and nucleic acid hybridization for detection of Leptospira borgpetersenii serovar hardjo in urine of cattle, American Journal of Veterinary Research 61(3), pp 316-20 109 38 Lý Thị Liên Khai, 2012, Điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn Leptospira đàn bị sữa, chó chuột cơng ty Cổ phần Thủy sản sơng Hậu, Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 21(pp 87-96 39 Hoàng Kim Loan, Đậu Thị Việt Liên, Vũ Thị Quế Hƣơng, Lạc Ngọc Thêm, Phan Ngọc Thảo, Lê Nhi, Bùi Chí Tâm, Phan Cơng Trung, Lê Thanh Tùng, Bùi Xuân Bảng, Vũ Đình Luân, Nguyễn Viết Chánh, Lê Thị Thanh Hà, Cao Thị Bảo Vân, 2013, Leptospira: 10 năm (2004 – 2013) khảo sát tình hình nhiễm ngƣời động vật gặm nhấm miền Nam Việt Nam, Tạp chí Y học Dự phòng, 10(pp 41-46 40 Felt S.A., Wasfy M.O., Tras E.l., WF e.a., 2011, Cross-species surveillance of Leptospira in domestic and peri-domestic animals in Mahalla City, Gharbeya Governorate, Egypt, Am J Trop Med Hyg 84(3), pp 420−442 41 Phuong L.H.T., 2001, Leptospira infection in dogs in some Northern provinces in Vietnam and prevention measures, 2001, Vietnam National University of Agricultural, 42 Khai L.T.L., 2012, The survey of Leptospira on dairy cow, dog and rat at dairy farm in Song Hau food processing joint stock corporation, Sci J Cantho Univ 21b(pp 10 43 Lee H.S., Thanh T.L., Ly N.K., al e., 2019, Seroprevalence of leptospirosis and Japanese encephalitis in swine in ten provinces of Vietnam, PLoS One, 14(8), pp e0214701 44 Nascimento A.L., Verjovski-Almeida S., Van Sluys M.A., Monteiro-Vitorello C.B., Camargo L.E., Digiampietri L.A., Harstkeerl R.A., Ho P.L., Marques M.V., Oliveira M.C., Setubal J.C., Haake D.A., Martins E.A., 2004, Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 37(4), pp 459-77 45 Ren S.X., Fu G., Jiang X.G., Zeng R., Miao Y.G., Xu H., Zhang Y.X., Xiong H., Lu G., Lu L.F., Jiang H.Q., Jia J., Tu Y.F., Jiang J.X., Gu W.Y., Zhang Y.Q., Cai Z., Sheng H.H., Yin H.F., Zhang Y., Zhu G.F., Wan M., Huang H.L., Qian Z., Wang S.Y., Ma W., Yao Z.J., Shen Y., Qiang B.Q., Xia Q.C., Guo X.K., Danchin A., Saint Girons I., Somerville R.L., Wen Y.M., Shi 110 M.H., Chen Z., Xu J.G., Zhao G.P., 2003, Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing, Nature, 422(6934), pp 888-93 46 Bulach D.M., Zuerner R.L., Wilson P., Seemann T., McGrath A., Cullen P.A., Davis J., Johnson M., Kuczek E., Alt D.P., Peterson-Burch B., Coppel R.L., Rood J.I., Davies J.K., Adler B., 2006, Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(39), pp 14560-5 47 Picardeau M., Bulach D.M., Bouchier C., Zuerner R.L., Zidane N., Wilson P.J., Creno S., Kuczek E.S., Bommezzadri S., Davis J.C., McGrath A., Johnson M.J., Boursaux-Eude C., Seemann T., Rouy Z., Coppel R.L., Rood J.I., Lajus A., Davies J.K., Medigue C., Adler B., 2008, Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis, PLoS One, 3(2), pp e1607 48 Xu Y., Zhu Y., Wang Y., Chang Y.F., Zhang Y., Jiang X., Zhuang X., Zhu Y., Zhang J., Zeng L., Yang M., Li S., Wang S., Ye Q., Xin X., Zhao G., Zheng H., Guo X., Wang J., 2016, Whole genome sequencing revealed host adaptation-focused genomic plasticity of pathogenic Leptospira, Scientific Reports, 6(pp 20020 49 Jorge S., Kremer F.S., Oliveira N.R., Navarro G., Guimaraes A.M., Sanchez C.D., Woloski R., Ridieri K.F., Campos V.F., Pinto L.D.S., Dellagostin O.A., 2018, Whole-genome sequencing of Leptospira interrogans from southern Brazil: genetic features of a highly virulent strain, Memorias Instituto Oswaldo Cruz, 113(2), pp 80-86 50 Vijayachari P., Sugunan A.P., Shriram A.N., 2008, Leptospirosis: an emerging global public health problem, Journal of Biosciences, 33(4), pp 557-69 51 Cullen P.A., Haake D.A., Bulach D.M., Zuerner R.L., Adler B., 2003, LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species, Infection and Immunity, 71(5), pp 2414-21 111 52 Luo D.-j., Hu Y., Dennin R.H., Yan J., 2007, Reconstruction of Leptospira interrogans lipL21 gene and characteristics of its expression product, Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 36(5), pp 458-64 53 Kumari A., Premlatha M.M., Raja V., Mercy C.S.A., Sumathi K., Shariff M., Natarajaseenivasan K., 2018, Protective immunity of recombinant LipL21 and I-LipL21 against Leptospira interrogans serovar Autumnalis N2 infection, Journal of Infection in Developing Countries, 12(01), pp 022-030 54 Haake D.A., Matsunaga J., 2002, Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins, Infection and Immunity, 70(9), pp 4936-45 55 Torgerson P.R., Hagan J.E., Costa F., Calcagno J., Kane M., Martinez-Silveira M.S., Goris M.G., Stein C., Ko A.I., Abela-Ridder B., 2015, Global burden of leptospirosis: Estimated in terms of disability adjusted life years, PLoS Negl Trop Dis., 9:e0004122(pp 56 Da Cunha C.E., Felix S.R., Neto A.C., Campello-Felix A., Kremer F.S., Monte L.G., Amaral M.G., de Oliveira Nobre M., da Silva E.F., Hartleben C.P., 2016, Infection with Leptospira kirschneri serovar mozdok: First report from the southern hemisphere, Am J Trop Med Hyg , 94(pp 519–521 57 Odir A.D., André A.G., Caroline R., Rodrigo A.S., Sérgio J., Thais L.O., Alan J.A.M., Daiane D.H., 2017, Reverse Vaccinology: An Approach for Identifying Leptospiral Vaccine Candidates, Int J Mol Sci , 18(1), pp 158 58 Slack A., 2010, Leptospirosis, Australian Family Physician, 39(7), pp 495-8 59 Charon N.W., Goldstein S.F., 2002, Genetics of motility and chemotaxis of a fascinating group of bacteria: the spirochetes, Annual Review of Genetics, 36(pp 47-73 60 Li C., Motaleb A., Sal M., Goldstein S.F., Charon N.W., 2000, Spirochete periplasmic flagella and motility, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 2(4), pp 345-54 61 Boutilier P., Carr A., Schulman R.L., 2003, Leptospirosis in dogs: a serologic survey and case series 1996 to 2001, Veterinary Therapeutics, 4(2), pp 17887 112 62 Zuerner R.L., 2015, Host response to leptospira infection, Current Topics in Microbiology and Immunology, 387(pp 223-50 63 Priya C.G., Bhavani K., Rathinam S.R., Muthukkaruppan V.R., 2003, Identification and evaluation of LPS antigen for serodiagnosis of uveitis associated with leptospirosis, Journal of Medical Microbiology, 52(Pt 8), pp 667-73 64 Erridge C., Pridmore A., Eley A., Stewart J., Poxton I.R., 2004, Lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis, Chlamydia trachomatis and Pseudomonas aeruginosa signal via toll-like receptor 2, Journal of Medical Microbiology, 53(Pt 8), pp 735-40 65 Yang C.W., Wu M.S., Pan M.J., Hsieh W.J., Vandewalle A., Huang C.C., 2002, The Leptospira outer membrane protein LipL32 induces tubulointerstitial nephritis-mediated gene expression in mouse proximal tubule cells, Journal of the American Society of Nephrology, 13(8), pp 2037-45 66 Koizumi N., Watanabe H., 2003, Identification of a novel antigen of pathogenic Leptospira spp that reacted with convalescent mice sera, Journal of Medical Microbiology, 52(Pt 7), pp 585-9 67 Koizumi N., Watanabe H., 2004, Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity, Vaccine, 22(11-12), pp 1545-52 68 Seixas F.K., Fernandes C.H., Hartwig D.D., Conceicao F.R., Aleixo J.A., Dellagostin O.A., 2007, Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against leptospirosis, Canadian Journal of Microbiology, 53(4), pp 472-9 69 Cullen P.A., Haake D.A., Adler B.J.F.m.r., 2004, Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes, FEMS Microbiology Reviews, 28(3), pp 291-318 70 Yan W., Faisal S.M., McDonough S.P., Chang C.F., Pan M.J., Akey B., Chang Y.F., 2010, Identification and characterization of OmpA-like proteins as novel vaccine candidates for Leptospirosis, Vaccine, 28(11), pp 2277-83 71 Gamberini M., Gomez R.M., Atzingen M.V., Martins E.A., Vasconcellos S.A., Romero E.C., Leite L.C., Ho P.L., Nascimento A.L., 2005, Whole-genome 113 analysis of Leptospira interrogans to identify potential vaccine candidates against leptospirosis, FEMS Microbiology Letters, 244(2), pp 305-13 72 Oliveira T.L., Grassmann A.A., Schuch R.A., Seixas Neto A.C., Mendonca M., Hartwig D.D., McBride A.J., Dellagostin O.A., 2015, Evaluation of the Leptospira interrogans Outer Membrane Protein OmpL37 as a Vaccine Candidate, PLoS One, 10(11), pp e0142821 73 Matsunaga T., Arakaki A., Takahoko M., 2002, Preparation of luciferasebacterial magnetic particle complex by artificial integration of MagAluciferase fusion protein into the bacterial magnetic particle membrane, Biotechnology and Bioengineering, 77(6), pp 614-8 74 Yang H.L., Zhu Y.Z., Qin J.H., He P., Jiang X.C., Zhao G.P., Guo X.K., 2006, In silico and microarray-based genomic approaches to identifying potential vaccine candidates against Leptospira interrogans, BMC Genomics, 7(pp 293 75 Dai B., Chen Z., Haake D.A., You Z., Fang Z., 1999, [Alignment of DNA sequences of ompL1 genes of insert fragment of recombinant plasmid, pDC38 of L interrogans serovar lai and L kirschneri], Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao, 30(3), pp 236-40 76 Haake D.A., Mazel M.K., McCoy A.M., Milward F., Chao G., Matsunaga J., Wagar E.A., 1999, Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection, Infection and Immunity, 67(12), pp 6572-6582 77 Branger C., Sonrier C., Chatrenet B., Klonjkowski B., Ruvoen-Clouet N., Aubert A., Andre-Fontaine G., Eloit M., 2001, Identification of the hemolysis-associated protein as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination, Infection and Immunity, 69(11), pp 6831-8 78 Palaniappan R.U., McDonough S.P., Divers T.J., Chen C.S., Pan M.J., Matsumoto M., Chang Y.F., 2006, Immunoprotection of recombinant leptospiral immunoglobulin-like protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection, Infection and Immunity, 74(3), pp 1745-50 114 79 Haake D.A., Champion C.I., Martinich C., Shang E.S., Blanco D.R., Miller J.N., Lovett M.A., 1993, Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp, Journal of Bacteriology, 175(13), pp 4225-34 80 Haake D.A., Chao G., Zuerner R.L., Barnett J.K., Barnett D., Mazel M., Matsunaga J., Levett P.N., Bolin C.A., 2000, The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection, Infection and Immunity, 68(4), pp 2276-85 81 Palaniappan R.U., Chang Y.F., Jusuf S.S., Artiushin S., Timoney J.F., McDonough S.P., Barr S.C., Divers T.J., Simpson K.W., McDonough P.L., Mohammed H.O., 2002, Cloning and molecular characterization of an immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans, Infection and Immunity, 70(11), pp 5924-30 82 Silva E.F., Medeiros M.A., McBride A.J., Matsunaga J., Esteves G.S., Ramos J.G., Santos C.S., Croda J., Homma A., Dellagostin O.A., Haake D.A., Reis M.G., Ko A.I., 2007, The terminal portion of leptospiral immunoglobulinlike protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis, Vaccine, 25(33), pp 6277-86 83 Palaniappan R.U., Chang Y.F., Chang C.F., Pan M.J., Yang C.W., Harpending P., McDonough S.P., Dubovi E., Divers T., Qu J., Roe B., 2005, Evaluation of lig-based conventional and real time PCR for the detection of pathogenic leptospires, Molecular and Cellular Probes, 19(2), pp 111-7 84 Koizumi N., Watanabe H., 2003, Molecular cloning and characterization of a novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain, FEMS Microbiology Letters, 226(2), pp 215-9 85 Artiushin S., Timoney J.F., Nally J., Verma A., 2004, Host-inducible immunogenic sphingomyelinase-like protein, Lk73.5, of Leptospira interrogans, Infection and Immunity, 72(2), pp 742-9 86 Guerreiro H., Croda J., Flannery B., Mazel M., Matsunaga J., Galvao Reis M., Levett P.N., Ko A.I., Haake D.A., 2001, Leptospiral proteins recognized 115 during the humoral immune response to leptospirosis in humans, Infection and Immunity, 69(8), pp 4958-68 87 Diament D., Brunialti M.K., Romero E.C., Kallas E.G., Salomao R., 2002, Peripheral blood mononuclear cell activation induced by Leptospira interrogans glycolipoprotein, Infection and Immunity, 70(4), pp 1677-83 88 Picardeau M., Brenot A., Saint Girons I., 2001, First evidence for gene replacement in Leptospira spp Inactivation of L biflexa flaB results in nonmotile mutants deficient in endoflagella, Molecular Microbiology, 40(1), pp 189-99 89 Park S.H., Ahn B.Y., Kim M.J., 1999, Expression and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58 of Leptospira species: a major target antigen of the humoral immune response, DNA and Cell Biology, 18(12), pp 903-10 90 Lee S.H., Kim S., Park S.C., Kim M.J., 2002, Cytotoxic activities of Leptospira interrogans hemolysin SphH as a pore-forming protein on mammalian cells, Infection and Immunity, 70(1), pp 315-22 91 Picardeau M., Bauby H., Saint Girons I., 2003, Genetic evidence for the existence of two pathways for the biosynthesis of methionine in the Leptospira spp, FEMS Microbiology Letters, 225(2), pp 257-62 92 Bharti A.R., Nally J.E., Ricaldi J.N., Matthias M.A., Diaz M.M., Lovett M.A., Levett P.N., Gilman R.H., Willig M.R., Gotuzzo E.J.T.L.i.d., 2003, Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance, Lancet Infectious Diseases, 3(12), pp 757-771 93 Yanagihara Y., Villanueva S.Y., Yoshida S., Okamoto Y., Masuzawa T., 2007, Current status of leptospirosis in Japan and Philippines, Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 30(5-6), pp 399-413 94 Vinetz J.M., 2001, Leptospirosis, Current Opinion in Infectious Diseases, 14(5), pp 527-38 95 McBride A.J., Cerqueira G.M., Suchard M.A., Moreira A.N., Zuerner R.L., Reis M.G., Haake D.A., Ko A.I., Dellagostin O.A., 2009, Genetic diversity of the 116 Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp, Infection, Genetics and Evolution, 9(2), pp 196-205 96 Zuerner R., Haake D., Adler B., Segers R., 2000, Technological advances in the molecular biology of Leptospira, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 2(4), pp 455-62 97 Wang Z., Jin L., Wegrzyn A., 2007, Leptospirosis vaccines, Microbial Cell Factories, 6(pp 39 98 Franỗois G., Duclos P., Margolis H., Lavanchy D., Siegrist C.-A., Meheus A., Lambert P.-H., Emiroglu N., Badur S., Van Damme P., 2005, Vaccine safety controversies and the future of vaccination programs, The Pediatric infectious disease journal, 24(11), pp 953-961 99 Day M.J., 2006, Vaccine side effects: fact and fiction, Veterinary Microbiology, 117(1), pp 51-8 100 Wang Z., Jin L., Węgrzyn A., 2007, Leptospirosis vaccines, Microbial cell factories, 6(1), pp 39 101 Wang Z., Yuan Z., Hengge U.R., 2004, Processing of plasmid DNA with ColE1-like replication origin, Plasmid, 51(3), pp 149-61 102 Wang Z., Xiang L., Shao J., Wegrzyn A., Wegrzyn G., 2006, Effects of the presence of ColE1 plasmid DNA in Escherichia coli on the host cell metabolism, Microbial Cell Factories, 5(pp 34 103 Villaverde A., Mattanovich D., 2007, Recombinant protein production in the new Millennium, Microbial Cell Factories, 6(pp 33 104 Sorensen H.P., Mortensen K.K., 2005, Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli, Journal of Biotechnology, 115(2), pp 113-28 105 Kumar K., Cowley M., Davis R., 2019, Next-Generation Sequencing and Emerging Technologies, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 45(7), pp 661–673 106 Sơn P.H., 2006, Giáo trình Kỹ thuật Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Huế, 117 107 Shukra A.M., Sridevi N.V., Dev C., Kapil M., 2014, Production of recombinant antibodies using bacteriophages, AK Journals, 4(2), pp 91–98 108 Christoph H.M., John R.S., 2014, Antibody Phage Display: Technique and Applications, J Invest Dermatol , 134(2), pp e17 109 Clem A.S., 2011, Fundamentals of Vaccine Immunology, J Glob Infect Dis., 3(1), pp 73–78 110 Hermanson G., 2008, Bioconjugate techniques, Academic Press, 111 Oliva H., Moltedo B., De Ioannes P., Faunes F., De Ioannes A.E., Becker M.I., 2002, Monoclonal antibodies to molluskan hemocyanin fromConcholepas concholepas demonstrate common and specific epitopes among subunits, Hybridoma and Hybridomics, 21(pp 365–373 112 Armstrong B., 2008, Antigen–antibody reactions, ISBT Science Series, 3(2), pp 113 Armstrong B., 2020, Section 3: Antigen-antibody reactions, ISBT Science Series, Wiley, 114 Matsunaga J., Young T.A., Barnett J.K., Barnett D., Bolin C.A., Haake D.A., 2002, Novel 45-kilodalton leptospiral protein that is processed to a 31kilodalton growth-phase-regulated peripheral membrane protein, Infection and Immunity, 70(1), pp 323-34 115 Fernandes C.P., Seixas F.K., Coutinho M.L., Vasconcellos F.A., Seyffert N., Croda J., McBride A.J., Ko A.I., Dellagostin O.A., Aleixo J.A., 2007, Monoclonal antibodies against LipL32, the major outer membrane protein of pathogenic Leptospira: production, characterization, and testing in diagnostic applications, Hybridoma (Larchmt), 26(1), pp 35-41 116 Sánchez R.M., Sierra A.P., Obregón F.A.M., González I.R., Gil A.B., Suárez M.B., Silveira J.R., Gastón B.D., 2002, Reactogenecity and immunogenecity of Cuban trivalent inactivated vaccine against human leptospirosis in different vaccination schedules, Revista Cubana de Medicina Tropical, 54(1), pp 37-43 117 Rodríguez I., Martínez R., Zamora Y., Rodríguez J.E., Fernández C., Obregón A.M., 2005, Response of antileptospira IgG antibodies in individuals 118 immunized with vax-SPIRAL, Revista Cubana de Medicina Tropical, 57(1), pp 32-37 118 Lin Y.P., McDonough S.P., Sharma Y., Chang Y.F., 2010, The terminal immunoglobulin-like repeats of LigA and LigB of Leptospira enhance their binding to gelatin binding domain of fibronectin and host cells, PLoS One, 5(6), pp e11301 119 Lin Y.P., McDonough S.P., Sharma Y., Chang Y.F., 2011, Leptospira immunoglobulin-like protein B (LigB) binding to the C-terminal fibrinogen alphaC domain inhibits fibrin clot formation, platelet adhesion and aggregation, Mol Microbiol, 79(4), pp 1063-76 120 Lin X., Xiao G., Luo D., Kong L., Chen X., Sun D., Yan J., 2016, Chimeric epitope vaccine against Leptospira interrogans infection and induced specific immunity in guinea pigs, BMC Microbiol, 16(1), pp 241 121 Karande S., Bhatt M., Kelkar A., Kulkarni M., De A., Varaiya A., 2003, An observational study to detect leptospirosis in Mumbai, India, 2000, Archives of Disease in Childhood, 88(pp 1070-1075 122 Raghavan R.K., Brenner K.M., Higgins J.J., Hutchinson J.M., Harkin K.R., 2012, Evaluations of hydrologic risk factors for canine leptospirosis: 94 cases (2002-2009), Preventive Veterinary Medicine, 107(1-2), pp 105-9 123 Satheeshkumar P.K., Anu P.V., Junaida M.I., Madanan M.G., Jebasingh T., Nair A.J., Nair G.A., Nair G.P.M., Sudhakaran P.R., 2018, Expression of Leptospira membrane proteins Signal Peptidase (SP) and Leptospira Endostatin like A (Len A) in BL-21(DE3) is toxic to the host cells, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 16(2), pp 393-398 124 Ariane L.L., Júlia F.M.Q.N., Gabriela d.S.E., Daniel T.V., Almeida F.V.R.d., Reis M.G.d., Ricardo G., Marco A.M., 2014, Evaluation of pre-induction temperature, cell growth at induction and IPTG concentration on the expression of a leptospiral protein in E coli using shaking flasks and microbioreactor, BMC Research Notes, 7(671), pp 125 Faisal S.M., Yan W., McDonough S.P., Chang Y.F., 2009, Leptospira immunoglobulin-like protein A variable region (LigAvar) incorporated in 119 liposomes and PLGA microspheres produces a robust immune response correlating to protective immunity, Vaccine, 27(3), pp 378-87 126 Oliveira T.L., Schuch R.A., Inda G.R., Roloff B.C., Neto A., Amaral M., Dellagostin O.A., Hartwig D.D., 2018, LemA and Erp Y-like recombinant proteins from Leptospira interrogans protect hamsters from challenge using AddaVax as adjuvant, Vaccine, 36(19), pp 2574-2580 127 Đỗ Ngọc Liên, 2004, Miễn dịch học sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 128 Phạm V.T., 2004, Miễn dịch học phân tử, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 129 Koizumi N., Watanabe H., 2005, Leptospirosis vaccines: past, present, and future, Journal of Postgraduate Medicine, 51(3), pp 210-4 130 Garba B., Bahaman A.R., Khairani-Bejo S., Zakaria Z., Mutalib A.R., 2017, Retrospective Study of Leptospirosis in Malaysia, Ecohealth, 14(2), pp 389398 131 Vilaysane A., Chun J., Seamone M.E., Wang W., Chin R., Hirota S., Li Y., Clark S.A., Tschopp J., Trpkov K., Hemmelgarn B.R., Beck P.L., Muruve D.A., 2010, The NLRP3 inflammasome promotes renal inflammation and contributes to CKD, Journal of the American Society of Nephrology, 21(10), pp 1732-44 132 Xiang M., Shi X., Li Y., Xu J., Yin L., Xiao G., Scott M.J., Billiar T.R., Wilson M.A., Fan J., 2011, Hemorrhagic shock activation of NLRP3 inflammasome in lung endothelial cells, Journal of Immunology, 187(9), pp 4809-17 133 Matsui M., Rouleau V., Bruyère-Ostells L., Goarant C.J.I., immunity, 2011, Gene expression profiles of immune mediators and histopathological findings in animal models of leptospirosis: comparison between susceptible hamsters and resistant mice, Infection and Immunity, 79(11), pp 4480-4492 134 Verma A.K., Kumar A., Dhama K., Deb R., Rahal A., Mahima, Chakraborty S., 2012, Leptospirosis-persistence of a dilemma: an overview with particular emphasis on trends and recent advances in vaccines and vaccination strategies, Pakistan Journal of Biological Sciences, 15(20), pp 954-63 120 135 Midwinter A., Faine S., Adler B., 1990, Vaccination of mice with lipopolysaccharide (LPS) and LPS-derived immuno-conjugates from Leptospira interrogans, Journal of Medical Microbiology, 33(3), pp 199204 136 Bolin C.A., Alt D.P., 2001, Use of a monovalent leptospiral vaccine to prevent renal colonization and urinary shedding in cattle exposed to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo, American Journal of Veterinary Research 62(7), pp 995-1000 137 Naiman B.M., Alt D., Bolin C.A., Zuerner R., Baldwin C.L., 2001, Protective killed Leptospira borgpetersenii vaccine induces potent Th1 immunity comprising responses by CD4 and gammadelta T lymphocytes, Infect Immun, 69(12), pp 7550-8 138 Parthiban M., Kumar S.S., Balachandran C., Kumanan K., Aarthi K.S., Nireesha G., 2015, Comparison of Immunoprotection of Leptospira Recombinant Proteins with conventional vaccine in experimental animals, Indian Journal of Experimental Biology, 53(12), pp 779-785 139 Palaniappan R.U., McDonough S.P., Divers T.J., Chen C.-S., Pan M.-J., Matsumoto M., Chang Y.-F., 2006, Immunoprotection of recombinant leptospiral immunoglobulin-like protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection, Infection and immunity, 74(3), pp 1745-1750 140 Vijayachari P., Sugunan A.P., Singh S.S., Mathur P.P., 2015, Leptospirosis among the self-supporting convicts of Andaman Island during the 1920s the first report on pulmonary haemorrhage in leptospirosis?, Indian Journal of Medical Research, 142(1), pp 11-22 121 PHỤ LỤC 122 ... dụng chế vắc xin tái tổ hợp chống lại Leptospirosis Việt Nam Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng chống lại bệnh gây xoắn khuẩn Leptospira interrogans Việt Nam Các nội dung nghiên cứu luận... tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis cần thiết Vì chúng tơi thực đề tài: ? ?Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra. ” Mục tiêu nghiên cứu luận án... nguyên xoắn khuẩn 19 Leptospira 1.2.3 Cơ chế tạo kháng thể thể xoắn khuẩn Leptospira 20 1.3 Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis 22 1.3.1 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh