NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY RA Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Tuấn Hùng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY RA Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TS Nghiêm Ngọc Minh Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 202… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến giới, Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (OIE) xếp vào nhóm thứ Bệnh nguy hiểm bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp Việt Nam Nguyên nhân gây loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans Bệnh lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt màng nhầy tiếp xúc với nước bị ô nhiễm nước tiểu động vật nhiễm bệnh Hiện nay, vắc xin dùng phòng chống bệnh Leptospirosis cho động vật chủ yếu loại nhược độc vô hoạt Trong thời đại công nghệ 4.0, sinh học công nghệ cao phát triển mạnh mẽ nên nhà khoa học tập trung nghiên cứu sinh học phân tử, hướng tới làm vacxin tái tổ hợp cho động vật, loại vắc xin an toàn, hiệu miễn dịch tốt, dễ sử dụng, giá thành hạ, phù hợp với nhu cầu nông nghiệp Cho đến thời điểm tại, Việt Nam chưa có đơn vị sản xuất vắc xin Leptospirosis tái tổ hợp dịch tễ bệnh cho thấy có serovar khác gây bệnh động vật nên việc tìm gen định kháng nguyên xuất chủng Leptospira gây bệnh để làm sở sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis cần thiết Vì chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra.” Mục tiêu nghiên cứu luận án 1) Xác định số gen định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng chế vắc xin tái tổ hợp chống lại Leptospirosis Việt Nam 2) Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng chống lại bệnh gây xoắn khuẩn Leptospira interrogans Việt Nam Các nội dung nghiên cứu luận án 1) Nuôi cấy, định danh phân tử xây dựng phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans Việt Nam 2) Xác định gen định kháng nguyên chủng vùng giàu epitope gen lựa chọn 3) Nhân dòng đoạn gen định kháng nguyên vào vector PJET1.2 hệ biểu E.coli DH10b Biểu gen đích chủng E coli BL21 4) Sản xuất tinh protein tái tổ hợp rLipL21 5) Kiểm tra khả gây miễn dịch cho thỏ kháng nguyên rLipL21 6) Sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 kiểm nghiệm vắc xin qui mơ phịng thí nghiệm 7) Sản xuất qui mô pilot 600 liều vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis 8) Đánh giá hiệu việc tiêm thử nghiệm vắc xin tái tổ hợp đàn gia súc số địa phương CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira bệnh Leptospirosis Leptospirosis bệnh truyền nhiễm chung nhiều loài động vật người (Zoonosis) xoắn khuẩn Leptospira thuộc họ Leptospiraceae gây Leptospira vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có hình móc câu, xoắn, chuyển động Leptospira đa dạng không theo qui luật nào, di chuyển thẳng, xoay trịn, theo hình sóng… Leptospira có kích thước: khoảng rộng 0,1-0,2 µm; dài 6-20 µm, khoảng cách vòng xoắn 0,5 µm [3] Hiện số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng để xác định mô tả đặc điểm Leptospira spp đến xác định 20 lồi Leptospira spp có lồi Leptospira gây bệnh [6] Việc phân loại dựa kết phân tích phát sinh lồi gen 16S rRNA xem thử nghiệm sàng lọc ban đầu để xác định Leptospira mẫu lâm sàng nghi ngờ nhiễm Leptospira [9, 10] Do tính đa dạng triệu chứng, bệnh Leptospirosis khó chẩn đốn nên tỉ lệ tử vong số vùng giới lên đến 20%-25%, chí điều trị bệnh gây tỷ lệ tử vong cao 10% Ở nước phát triển, người mắc bệnh chủ yếu nông dân người nghèo thành phố Ở nước phát triển, người thường phải làm việc trời nơi ấm ẩm thấp thường có nguy nhiễm bệnh Đến nay, Việt Nam nằm vùng dịch tễ học cao bệnh xoắn khuẩn 1.2 Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira Bộ gen Leptospira spp bao gồm hai nhiễm sắc thể trịn có chiều dài dao động từ 3,9 đến 4,6 Mb Sự thay đổi chiều dài gen khiến vi khuẩn có khả sống mơi trường khác thích nghi với nhiều loại vật chủ [47] Hàm lượng guanine cytosine (G+C) nằm khoảng từ 35% đến 41% [8] Tuy nhiên, kiến thức chi tiết hiểu biết sinh bệnh học phân tử tiến hóa độc lực Leptospira spp chưa có [48] Cơng nghệ giải trình tự DNA hệ sử dụng rộng rãi để thực số phân tích so sánh đa dạng gen Leptospires mầm bệnh gây bệnh [47] loài Leptospires gây bệnh khác [48] Giải trình tự Leptospira phân lập từ nhiều nguồn toàn cầu khác tạo liệu bổ sung tạo điều kiện hiểu rõ mầm bệnh 1.3 Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis Trong q trình nghiên cứu ứng dụng, nhà khoa học giới Việt Nam tập trung vào loại vắc xin có khả phịng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an tồn, mức độ bảo hộ cao lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng động vật Vắc xin tái tổ hợp dựa gen gây đáp ứng miễn dịch cao bảo tồn chủng Leptospires gây bệnh LipL32, LipL41, OmpL1, LigA gen yếu tố độc lực Loa22 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu dụng cụ nghiên cứu * Chủng vi sinh vật Năm chủng xoắn khuẩn gồm: Leptospira (L.) Bataviae, L Canicola, L Gryppothyphosa, L Icterohaemohagiae, L Pomona cung cấp từ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, nuôi cấy tăng sinh Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO Chủng Escherirchia coli (E coli) DH10b (Invitrogen, Mỹ) Chủng E.coli BL12 (DE3) (Invitrogen, Mỹ) * Hóa chất Các hóa chất dùng sinh học phân tử (DNA, cloning, westen blot…) tinh khiết, đạt yêu cầu kỹ thuật, đặt mua từ Invitrogen, Sigma, Thermor Fisher, Ferrmentas (Mỹ), Serva (Pháp), Biobasic (Canada), Merck (Đức) Các hóa chất ni cấy tăng sinh Xoắn khuẩn Các loại hóa chất phối trộn tạo vắc xin (Thermo Fisher, Mỹ) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang epitope Nuôi cấy, tăng sinh chủng xoắn khuẩn Leptospira Tách chiết DNA tổng số Thiết kế cặp mồi gen 16S rRNA gen định kháng nguyên: OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB Kỹ thuật PCR Giải trình tự gen kỹ thuật Sanger Định danh xác chủng Leptospira mặt phân tử Xác định mức độ tương đồng trình tự nucleotit trình tự axit amin, vùng giàu epitop đoạn gen định kháng nguyên Gắn đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu vector biểu enzyme giới hạn Gắn gen mã hóa protein LipL21 vào vector biểu Biểu gen đích chủng E coli BL21 Điện di kiểm tra protein tái tổ hợp gel polyacrylamide có chất khử (SDS- PAGE) 2.2.2 Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein tái tổ hợp rLipL21 Trong nghiên cứu tạo kháng thể phương pháp gây miễn dịch thỏ Bao gồm kỹ thuật sau: 1) Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch 2) Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 3) Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 4) Kỹ thuật phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT) 2.2.3 Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 2.2.3.1 Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp rLipL21 khác Để có sở đánh giá chất lượng kháng nguyên tái tổ hợp (protein tái tổ hợp rLipL21) phải định lượng hàm lượng protein có dung dịch mẫu theo nguyên tắc từ nồng độ thấp đến nồng độ cao Dung dịch mẫu chia làm nồng độ từ 100 µg - 250 µg - 500 µg, sau tiêm cho thỏ (2 2,5kg/con) mũi cách ngày Sau 14 - 21 ngày tiến hành lấy máu, chắt huyết kiểm tra hàm lượng kháng thể huyết phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 2.2.3.2 Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 Dung dịch mẫu chứa protein nồng độ tối ưu Pha trộn với chất bổ trợ theo liều định Kỹ thuật tuân theo quy định Công ty VETVACO 2.2.3.3 Định liều tiêm vắc xin Căn vào hàm lượng protein tính trên, ta tiến hành định liều tiêm 1-2ml Liều tiêm có lượng kháng nguyên đủ để sinh miễn dịch động vật 2.2.3.4 Qui trình kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 Đánh giá tiêu vơ trùng, tiêu an tồn, tiêu hiệu lực theo quy định kiểm nghiệm vắc xin động vật 2.2.3.5 Đánh giá hiệu tạo miễn dịch Tiến hành tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 tiêm đối chứng PBS để xác định khả gây chết động vật thí nghiệm, khả tạo miễn dịch, thay đổi mô học quan sinh miễn dịch 2.2.3.6 Chế tạo thử nghiệm 600 liều vắcxin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis Căn kết ta tiến hành sản xuất thử nghiệm 600 liều vắc xin Leptospirosis tái tổ hợp Công ty cổ phần thuốc thú y trung ương Vetvaco 2.3 Phân tích xử lý kết nghiên cứu Xử lý số liệu phần mềm: SPSS 6.0, GraphPrism ver Sử dụng thuật tốn: χ2, tính tỷ lệ phần trăm, so sánh giá trị trung bình 2.4 Địa điểm tiến hành nghiên cứu Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bộ môn vi trùng, Xưởng sản xuất vắc xin, Trại nuôi động vật thuộc Công ty Thuốc Thú y Trung ương VETVACO CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nuôi cấy, định danh phân tử xây dựng phát sinh chủng loại 3.1.1 Nuôi cấy, tăng sinh xoắn khuẩn Các ống giống nhận từ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cấy vào môi trường EMJH bổ sung 10% huyết thỏ Sau cấy, môi trường nuôi nuôi lắc 200rpm 28 - 30ºC – 10 ngày đạt lượng khuẩn cần thiết khoảng 2x108 vi khuẩn/ml Sau đạt nồng cần thiết, sinh khối thu nhận cách ly tâm 4000rpm 4oC 10 phút (Hình 3.1) Hình 3.1 Hình ảnh sau ly tâm thu xoắn khuẩn 3.1.2 Xây dựng phát sinh chủng loại Sau tách chiết DNA, khuếch đại gen 16S rRNA phản ứng PCR, sản phẩm PCR sau tinh đưa giải trình tự gen phương pháp Sanger Thơng qua việc so sánh trình tự gen 16S rRNA chủng nghiên cứu với 32 chủng xoắn khuẩn công bố GenBank, nhằm xác định mối quan hệ chủng Leptospira Việt Nam chủng cổ điển, đồng thời định danh phân tử lại chủng này, số chương trình tin sin học sử dụng để xây phát sinh chủng loại (Hình 3.6) Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn nghiên cứu Kết xây dựng cho thấy serovar chúng tơi giải trình tự nằm nhóm lồi Leptospira interrogans (nhóm gây bệnh xoắn khuẩn Leptospira), nhánh với chủng L Pomona-5621 (mã GenBank: FJ154559), L Icterohaemorhagiae-CCZ45 (mã GenBank: EU581713), L Grippotyphosa-L1006 (mã GenBank: EF536975), L Bataviae-UT075 (mã GenBank: EF536993), gần nhánh với chủng L Canicola DB34 (mã GenBank: JQ988866) Từ kết phát sinh chủng loại cho thấy mối quan hệ gần gũi chủng với chủng lồi Leptospira interrogans cơng bố trước 3.2 Xác định gen định kháng nguyên chủng vùng giàu epitop gen 3.2.1 Nhân gen với cặp mồi gen định kháng nguyên Sử dụng DNA tổng số thu làm khn khuếch đại trình tự gen phù hợp nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp: OmpL1 [54, 76, 114], LipL21 [51], LipL32 [115], LipL41, LigA [82], LigB [67] phản ứng PCR với cặp mồi xuôi ngược thiết kế dựa trình tự gen công bố ngân hàng gen quốc tế Sau tiến hành PCR qua 25 chu kỳ, điều kiện nhiệt độ gắn mồi thích hợp với loại mồi (OmpL1 Tm 55oC, LigA Tm 55 oC, LigB Tm 55 oC, LipL21 Tm 50 oC, LipL32 Tm 50 oC, LipL41 Tm 50 oC).kết nhân gen kiểm tra agarose 1% Marker 1Kb plus Kết thu sau: gen OmpL1, LipL21, LipL32, LipL41, LigA xuất chủng, rõ ràng, có băng nhất, khơng lẫn tạp, kích thước nằm khoảng kích thước gen thiết kế Tuy nhiên, gen LipL21 gen nhiều nghiên cứu giới đánh giá gen tiềm sản xuất vắc xin tái tổ hợp khả tạo miễn dịch đặc hiệu protein tái tổ hợp Vì vậy, khuôn khổ luận án này, tiến hành nghiên cứu nhân dòng biểu gen LipL21 để tiến hành sản xuất vắc xin tái tổ hợp phịng chống bệnh Leptospirosis 3.2.2 Tinh giải trình tự đoạn gen định kháng nguyên xuất chủng xoắn khuẩn Tiến hành chạy PCR với mồi gen LipL21 Sản phẩm PCR sau tinh GeneJETTM PCR Purification Kit, kiểm tra agarose 1% với Marker Kb plus trước tiến hành giải trình tự gen 3.2.3 Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin vùng giàu epitop gen định kháng nguyên LipL21 3.2.3.1 Trình tự nucleotit Trình tự gen định kháng nguyên LipL21 so sánh với nhằm tìm kiếm vùng khác biệt chủng đồng thời xác định vùng bảo thủ chủng Sau giải trình tự gen định kháng LipL21, trình tự nucleotit nhận được: Kết so sánh trình tự nucleotit gen LipL21 chủng xoắn khuẩn cho thấy chủng L Bataviae, L Canicola, L Grippotyphosa, L Icterohaemorrhagiae L Pomona đạt tỷ lệ tương đồng lên đến 99% chủng, có vị trí sai lệnh, xuất rải rác toàn gen Các vị trí sai khác lần lượt: 99 (L Icterohaemorrhagiae), 171, 276, 279 (L Canicola, L Pomona), 324 (L Pomona), 450 (L Canicola, L Grippotyphosa, L Pomona) 3.2.3.2 So sánh trình tự axit amin Trình tự nucleotit thu được diễn giải sang trình tự axit amin nhằm kiểm tra sau khác trình tự amino acid chủng Xoắn khuẩn thu nhận (Hình 3.10) Mặc dù có vị trí sai khác tìm thấy từ trình tự nucleotit, khơng dẫn đến sai khác trình tự axit amin chủng xoắn khuẩn Trình tự axit amin chủng Leptospira giống hoàn toàn, điều kiện thuận lợi cho việc tạo chung loại protein tái tổ hợp đặc trưng cho loài xoắn khuẩn Leptospira Hình 3.9 Trình tự nucleotit gen LipL21 Hình 3.10 Trình tự axit amin gen LipL21 Từ kết trình tự nucleotit axit amin, sử dụng công cụ I-TASSER để xây dựng cấu trúc 3D gen LipL21 chủng xoắn khuẩn Với gen LipL21, trình tự axit amin đồng chủng, nên thu mơ hình 3D biểu diễn cho tất chủng (Hình 3.11) Hình 3.11 Cấu trúc 3D gen LipL21 chủng xoắn khuẩn 3.3.3 Xác định vùng giàu epitop Việc lựa chọn kháng nguyên tối ưu điều quan trọng để thiết kế vắc xin hiệu Các protein kháng nguyên này, tùy thuộc vào đáp ứng mong muốn, nên chứa vùng epitope thích hợp với thụ thể tế bào B tế bào T [116, 117] Trong nghiên cứu này, để xác định vùng giàu epitope gen LipL21, công cụ tin sinh khác sử dụng để dự đoán Kết dự đoán tổng hợp lại Bảng 3.1 Bảng 3.1 Trình tự vùng giàu epitop dự đốn gen LipL21 Tế bào Số lƣợng Công cụ tin sinh epitope Cytotoxic T cell (Tc cell) 53 NetMHC, NetCTL, ProPred T helper cells (Th cells) 19 B lymphocytes (B cells) 23 IEDB, ABCPred, BepiPred, SMVTriP Trình tự peptide Vị trí Vị trí Độ dài (aa) mở đầu kết thúc Tế bào lympho T ATTVGDGGW 28 36 TVGDGGWTF 30 38 GWGGPPEQR 40 48 GVVKGVGVY 131 139 IYAKFPGGK 165 173 DTNPKDWYY 57 65 ASDVVKKMV 98 106 YIKFSSRAS 63 71 IKFSSRASG 64 72 MVGETVESA 103 111 VKGVGVYEC 132 140 WECQCVIY 157 165 Tế bào lympho B RASGKAVAK 70 78 ETVESASGVSDGEAT 107 121 15 CKATGSGSDPKDVSKDNWE 141 159 19 TGQKDATTVGDGGWTF 23 39 16 EGWGGPPEQRNDGKTP 39 55 16 KKMVGETVESASGVSD 102 118 16 TGSGSDPKDVSKDNWE 144 160 16 VESASGVSDGEAT 109 121 12 KATGSGSDPKDVSKDNWE 141 159 18 ASDVVKKMVGETVESASGVS 97 116 20 Kết dự đoán thu 95 vị trí epitope loại tế bào tham gia hệ thống miễn dịch Cytotoxic T cell (Tc cell) có 53 vị trí, T helper cells (Th cells) có 19 vị trí B lymphocytes (B cells) có 23 Tiếp tục gia tăng số dự đoán đặc điểm kháng nguyên protein, sử dụng phần mềm dự đốn dựa theo tính ưa nước, kỵ nước khả nằm bề mặt phân tử axit amin theo hệ thống số liệu thu từ ma trận thống kê nhiều loại phân tử protein phân tích trước cho thấy có 22 vị trí peptide đoạn gen LipL21 (12 vị trí tế bào T 10 vị trí tế bào B) dự đốn giàu tính kháng nguyên Tiếp tục sử dụng phần mềm IEDB để nghiên cứu cấu trúc protein, phân tích tính thiên vị mã tính kháng nguyên LipL21 cho thấy vùng axit amin có vị trí đến 70 71 đến 119 có hiệu suất biểu cao tế bào tính kháng ngun Trình tự vùng giàu epitop dự đốn cho biết xác độ dài, điểm mở đầu điểm kết thúc đoạn epitop Dựa kết phân tích trình tự nucleotide trình tự axit amin, lựa chọn vùng gen đặc hiệu giàu epitope, xuất chủng vi khuẩn Leptospira, từ đó, chúng tơi thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen LipL21 phù hợp với nghiên cứu Bảng 3.2 Trình tự mồi đặc hiệu nhân đoạn gen LipL21 Tên mồi Trình tự (5’-3’) Kích thƣớc (bp) LipL21-RAAAATAGATATCAATAGACTTATAGCTCTATCTT Fw TAG 548 LipL21-RAACGAACTCGAGTTTGGAAACCTCTTGAGC Rw Nhiệt độ bắt cặp 55°C 55°C 3.3 Nhân dòng biểu gen định kháng nguyên LipL21 tế bào vật chủ E.coli tinh protein tái tổ hợp rLipL21 Kỹ thuật bao gồm việc chèn phân tử DNA ngoại lai mã hóa kháng nguyên protein ngồi màng, kích thích phản ứng miễn dịch, vào tế bào vi khuẩn động vật có vú, biểu kháng nguyên tế bào sau tinh chế chúng để sử dụng làm vắc xin 3.3.1 Nhân dòng gen định kháng nguyên LipL21 vào vector pJET1.2 hệ biểu E.coli DH 10b Hình 3.12 Tạo, sàng lọc kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 tế bào E.coli DH10b A: Tách chiết DNA vi khuẩn B: PCR khuẩn lạc C: Cắt mở vòng plasmid với enzyme EcoRV XhoI D: Kiểm tra khuẩn lạc E.coli DH10b mang plasmid môi trường LB có bổ sung ampicillin E: PCR sàng lọc khuẩn lạc mang plasmid pJET1.2 gen LipL21 F: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp cắt với enzyme EcoRV XhoI Sản phẩm PCR thu được gắn vào plasmid pJET1.2 biến nạp vào chủng E.coli DH10b Sản phẩm biến nạp ni chọn lọc mơi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin nuôi qua đêm 37oC Các khuẩn lạc phát triển ampicillin sàng lọc PCR khuẩn lạc với mồi nằm gen 12 operator Tuy nhiên, nồng độ IPTG cao gây độc tế bào Do đó, tiến hành đánh giá mức độ biểu protein LipL21 điều kiện nồng độ IPTG: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM; 0,4 mM Kết kiểm tra gel polyacrylamide có chứa SDS Hình 3.18 Điện di đồ sản phẩm protein biểu điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác Kí hiệu sử dụng: M: Thang chuẩn protein; (-) IPTG: Không cảm ứng IPTG, Nồng độ IPTG cảm ứng: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM; 0,4 mM Kết điện di kiểm tra gel polyacrylamide có chứa SDS cho thấy nồng độ IPTG 0,2 mM 0,4 mM, protein LipL21 biểu tốt Tuy nhiên, sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp, lượng IPTG dùng không nên cao làm giá thành sản xuất cao, lựa chọn nồng độ chất cảm ứng 0,2 mM thích hợp - Tối ưu thời gian cảm ứng Thời gian cảm ứng có liên quan mật thiết tới khả biểu protein tái tổ hợp Theo nghiên cứu trước đó, thời gian cảm ứng thích hợp khoảng thời gian từ 2h đến 5h Do đó, chúng tơi tiến hành đánh giá mức độ biểu protein LipL21 thời gian cảm ứng: 1h, 2h, 3h, 4h Kết kiểm tra gel polyacrylamide có chứa SDS Hình 3.19 Điện di đồ sản phẩm protein biểu điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác Kí hiệu sử dụng: M: Thang chuẩn protein; (-) IPTG: Không cảm ứng IPTG; Cảm ứng IPTG 1h, 2h, 3h, 4h Kết điện kiểm tra gel polyacrylamide có chứa SDS cho thấy thời gian biểu 4h, protein LipL21 biểu tốt (nồng độ protein đo gấp 1,25-1,5 so với cảm ứng IPTG 3h) Như vậy, từ kết thu trên, đưa điều kiện tối ưu cho biểu protein LipL21 tái tổ hợp là: Nhiệt độ nuôi cấy 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,2mM, thời gian cảm ứng 4h 13 Dịch chiết protein đem tinh cột His Bind phương pháp sắc ký lực Các phân đoạn định lượng bước sóng A280 nm Hình 3.20 Hình 3.20 Định lượng Bradford phân đoạn tinh Các phân đoạn 4, 5, 6, có kết định lượng Bradford cao điện di kiểm tra gel polyacrylamide có SDS (Hình 3.21) Kết phù hợp với thí nghiệm hiệu suất biến nạp tế bào BL21 (DE3) pET32a LipL21 Kí hiệu sử dụng: (1): Dịch qua cột; (2): Dịch rửa đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol 60mM; (3), (4), (5), (6): phân đoạn 4, 5, 6, rửa đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol 500mM Hình 3.21 Điện di đồ sản phẩm biểu pET32a-LipL21 E coli BL2 tinh Kết điện di gel polyacrylamide (Hình 3.21) cho thấy phân đoạn đếu xuất băng có kích thước 39 kDa phù hợp với tính tốn lý thuyết 3.4 Kiểm tra tính sinh miễn dịch protein tái tổ hợp rLipL21 Sau 21 ngày tiến hành lấy máu, chắt huyết kiểm tra hàm lượng kháng thể huyết phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể (Hình 3.22) Ngƣng kết với Mẫu huyết kháng nguyên Miễn dịch protein LipL21 tái tổ hợp Nồng độ 100µg Nồng độ 250µg Nồng độ 500µg Đối chứng 14 Hình 3.22 Kết ngưng kết kháng nguyên protein tái tổ hợp LipL21 với nồng độ khác 100µg, 250µg, 500µg kháng thể thu từ thỏ Kết phản ứng ngưng kết cho thấy nồng độ 100µg, có tổng số có xuất ngưng kết (chiếm 25%) Ở nồng độ 250µg, có tổng số có xuất ngưng kết Và nồng độ 500µg, tất có phản ứng ngưng kết (100% thỏ thí nghiệm) Vì vậy, nồng độ protein tái tổ hợp LipL21 250µg 500µg lựa chọn để thực nghiên cứu Với mẫu có xuất ngưng kết, chúng tơi tiến hành thực phản ứng Microscopic agglutination test (MAT) huyết chủng Leptospira sống Kết ngưng kết quan sát kính hiển vi đen (Hình 3.23) Hình 3.23 Kết phản ứng MAT chủng Leptospira sống huyết thu Kết quan sát kính hiển vi đen cho thấy có ngưng kết chủng Leptospira sống huyết thu Tuy nhiên mức độ ngưng kết lơ tiêm 250µg đạt 3+ (70%: +, 30%: ++), ngược lại lơ tiêm 500µg mẫu ngưng kết ≥ 3+ Như kết luận kháng nguyên tái tổ hợp LipL21 có khả sinh miễn dịch có xuất phản ứng ngưng kết với chủng Leptospira sống Dựa vào kết đánh giá khả sinh miễn dịch lựa chọn nồng độ 500 µg để tiến hành sản xuất thử nghiệm vắc xin LipL21 tái tổ hợp 3.5 Qui trình chế tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 phòng bệnh Leptospirosis 3.5.1 Xác định tá chất phối trộn đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 để tạo vắc xin tái tổ hợp Trong q trình nghiên cứu chúng tơi sử dụng loại tá chất để phối trộn keo phèn nhũ dầu Kết cho thấy keo phèn kết hợp với kháng nguyên tái tổ hợp làm phức hợp khó tan, gây phản ứng cục nơi tiêm (xuất khối bã đậu vị trí tiêm động vật thí nghiệm), cho hiệu giá ngưng kết kháng nguyên - kháng thể thấp Trong đó, sử dụng với tá chất nhũ dầu kết hợp tỷ lệ 1/1 (nhũ dầu: kháng nguyên rLipL21 = 1:1) phức hợp tan đồng nhất, không tạo thành u cục vị trí tiêm, hiệu giá ngưng kết cao (các kết khơng trình bày đây) Do vậy, lựa chọn nhũ dầu chất bổ trợ với kháng nguyên rLipL21 sản xuất thử nghiệm vắc xin 3.5.2 Định liều tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu cho động vật thí nghiệm Protein tái tổ hợp LipL21 sau phối trộn với nhũ dầu theo tỷ lệ, tiến hành gây miễn dịch cách tiêm da cho thỏ mẫn cảm (2-2,5kg) với liều tiêm 1ml 2ml Sau ngày thỏ miễn dịch tiếp, liều vắc xin quy định lần cho động vật Sau tuần kể từ lần tiêm đầu, hiệu lực vắc xin đánh giá phản ứng ngưng kết kháng nguyên- kháng thể (Hình 3.24) 15 Mẫu huyết Ngƣng kết với Đối chứng Miễn dịch chủng Leptospira Liều tiêm 1ml/thỏ Liều tiêm 2ml/thỏ Hình 3.24 Phản ứng vi ngưng kết protein tái tổ hợp LipL21 phối trộn với nhũ dầu với liều tiêm 1ml 2ml Kết phản ứng MAT thống kê Bảng 3.3 Từ kết cho thấy, với liều tiêm 1ml, tổng số xuất ngưng kết mạnh (trên 3+) Với liều tiêm 2ml, tổng số có xuất ngưng kết Bảng 3.3 Kết kiểm tra ngưng kết với chất bổ trợ nhũ dầu Ngƣng kết với chủng Mẫu huyết Leptospira Đối chứng Miễn dịch Liều tiêm 1ml/thỏ + + - + - - Liều tiêm 2ml/thỏ + - + + - - Ghi chú: (+): ngưng kết với hiệu giá ≥ 3+ (-): không ngưng kết Với liều tiêm 1ml phức hợp kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu (nồng độ kháng nguyên rLipL21: 500µg, tỷ lệ phối trộn: phần thể tích nhũ dầu/ phần thể tích kháng nguyên rLipL21) cho kết ngưng kết tốt Đây số quan trọng lựa chọn để tiến hành sản xuất vắc xin 3.5.3 Kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 3.5.3.1 Đánh giá tiêu vô trùng Sản xuất thử nghiệm 50 liều vắc xin tái tổ hợp rLipL21 Sau lấy ngẫu nhiên số mẫu vắc xin sản xuất để tiến hành đánh giá tiêu vô trùng vắc xin Bảng 3.4 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin Mẫu Kiểm tra vô trùng Môi trƣờng kiểm tra kiểm tra Môi trƣờng nhân Thạch Thiogly- Saboura- Canh Thạch Canh Thiogly- máu collat ud thang thịt máu thang thịt collat Ghi chú: : âm tính, khơng có vi khuẩn nấm mọc môi trường kiểm tra Mẫu kiểm tra môi trường thường quy đạt vơ trùng, khơng có vi khuẩn nấm mọc tất môi trường kiểm tra, đạt yêu cầu so với tiêu chuẩn quy định (TCVN 3299-80, TCN 192-94) 16 3.5.3.2 Đánh giá tiêu an toàn Trên chuột lang chuột nhắt trắng, sau 10 ngày theo dõi tất động vật hồn tồn khỏe mạnh, khơng có phản ứng tồn thân phản ứng cục vị trí tiêm (Bảng 3.5) Kết cho thấy vắc xin đạt an tồn động vật thí nghiệm Bảng 3.5 Kết kiểm tra an tồn vắc xin động vật thí nghiệm Động vật thí Số lƣợng Liều tiêm nghiệm (con) (ml) Chuột lang 30 Chuột nhắt trắng 30 0,1 Đƣờng tiêm Theo dõi Sống/ tiêm (ngày) (con) Dưới da 10 30/30 Dưới da 10 30/30 3.5.3.3 Đánh giá tiêu hiệu lực Mẫu huyết thỏ tiêm có miễn dịch thỏ đối chứng khơng tiêm vắc xin pha loãng 1/50, kiểm tra vi ngưng kết Bảng 3.6 Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin phản ứng vi ngưng kết Chủng Leptospira Mẫu huyết Đối chứng Miễn dịch L Bataviae + + + + - - L Canicola + + + + - - L Grypothyphosa + + + + - - L Ictero haemohagiae + + + + - - L Pomona + + + + - - Ghi chú: (+): ngưng kết với hiệu giá ≥ 3+ (-): không ngưng kết Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin tái tổ hợp chủng Leptospira sống cho thấy 100% có phản ứng ngưng kết Như vậy, bước đầu kết luận vắc xin tái tổ hợp rLipL21 có hiệu lực với chủng Leptospira, bảo hộ cho toàn động vật thí nghiệm 3.5.3.4 Đánh giá hiệu tạo miễn dịch động vật thí nghiệm Hai lơ chuột nhắt trắng thí nghiệm (30 chuột khỏe mạnh, đạt tiêu chuẩn trọng lượng/ lô) tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 (liều 0,1ml/con)- lơ thí nghiệm PBS (liều 0,1 ml/con)- lô đối chứng Thời gian tiêm, thời gian cơng cường độc, thời gian lấy mẫu thí nghiệm trình bày phần phương pháp nghiên cứu Tỷ lệ chuột sống/ chết lô theo dõi hàng ngày thống kê vào ngày thứ 10, 20 30 sau công cường độc, đến ngày 30 tiến hành mổ chuột thu bệnh phẩm gan, thận, làm tiêu tổ chức để kiểm tra thay đổi mô học quan hai nhóm chuột tiêm vắc xin đối chứng Kết cho thấy, lô đối chứng, sau cơng cường độc ngày tồn chuột lơ chết, lơ thí nghiệm có lượng động vật thí nghiệm bị chết, cụ thể 20 ngày sau công cường độc có 10% động vật thí nghiệm bị chết, sau 30 ngày cịn 64% số chuột thí nghiệm cịn sống (Hình 3.25) 17 Hình 3.25 Tỷ lệ chuột tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 sống/ chết sau công cường độc xoắn khuẩn Leptospira Các thể chuột lơ thí nghiệm đối chứng (lơ chuột thí nghiệm cá thể sống ngày 30 sau công cường độc, lô đối chứng chuột vừa chết ngày thí nghiệm trước đó) mổ lấy bệnh phẩm gan, thận với mục đích kiểm tra biến đổi tế bào mô quan Kết cho thấy, nhóm động vật thí nghiệm đối chứng có thay đổi tổ chức mô tế bào gan, thận so với chuột khẻ mạnh bình thường Xuất biểu thâm nhiễm tế bào viêm, xuất huyết, tắc nghẽn mạch máu Tuy nhiên, nhóm tiêm PBS, mức độ tổn thương lớn hơn, tế bào viêm xuất nhiều tổ chức, lòng ống thận thu hẹp có máu đọng, có nhiều điểm xuất huyết tế bào tổ chức (Hình 3.26) Hình 3.26 Hình ảnh chụp thay đổi mơ bệnh học thận gan chuột thí nghiệm Kí hiệu sử dụng: Mũi tên đen: thâm nhiễm viêm; Mũi tên xanh: xuất huyết; Mũi tên đỏ: tắc nghẽn mạch máu Sử dụng kỹ thuật Western blot- phương pháp có độ nhạy cao dựa tính đặc hiệu kháng thể để phát protein điện di gel SDS-PAGE chuyển lên màng lai Kết cho thấy, xuất băng vạch đặc hiệu, có kích thước khoảng 39 kDa màng lai (Hình 3.27), sau tiêm kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 khoảng 50 ngày máu chuột miễn dịch phát đươc kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên rLipL21 18 Hình 3.27 Kết phản ứng Western blot kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 kháng thể đặc hiệu Kí hiệu sử dụng: M (Marker): thang chuẩn protein 3.6 Sản xuất vắc xin đánh giá khác với vắc xin tái tổ hợp rLipL21 3.6.1 Sản xuất 600 liều vắc xin Các bước tạo nhũ (W/O: nước dầu) Sau kháng nguyên LipL21 đạt tiêu vô trùng (10 TCN 161 – 92), tiến hành phối trộn nhũ Để phối trộn lơ thí nghiệm (600 liều) vacxin Lepto dạng nhũ dầu, tiến hành với công thức phối trộn chung với tỷ lệ là: Kháng nguyên LipL21: ISA 206 = 50% : 50% Các bước để tạo nhũ tiến hành sau: a) Chuẩn bị nguyên, vật liệu: Tên nhũ: ISA 206 (hãng Seppic) Kháng nguyên tái tổ hợp LipL21 Máy tạo nhũ Silverson L4RT cốc đong 250ml giá đỡ đồng hồ đếm ngược b) Phương pháp tạo nhũ: Bước 1: Đong 100ml ISA 206/ cốc đong (cốc số 1) 100ml kháng nguyên LipL21/ cốc đong khác ( cốc số 2) Bước 2: Đưa đầu máy tạo nhũ vào cốc chứa nhũ ( cốc 1) Bắt đầu khuấy với tốc độ 1000 vịng/phút phút Bước 3: Rót từ từ kháng nguyên LipL21 vào cốc có nhũ Tăng tốc độ khuấy lên 4000 vòng /phút (Để đầu tạo nhũ cốc) Nghiêng cốc để nhũ đều, tiến hành đánh tạo nhũ 15 phút Bước 4: Bật đồng hồ, theo dõi 15 phút tắt máy Bước 5: Thu hoạch nhũ c) Thu hoạch nhũ: 100ml chất nhũ ISA 206 phối trộn với 100 ml canh trùng (tỉ lệ 50 : 50) Sau 15 phút hồn tất q trình tạo nhũ máy tạo nhũ Silverson L4RT, ta thu 200 ml vacxin Lepto tái tổ hợp dạng nhũ dầu Từ 200ml vacxin ta chia 10 chai nhựa, chai dung tích 20ml Tổng số chai thu 10 chai tương ứng với 200 liều 19 Làm lần tương tự với qui trình trên, Chúng tơi thu 03 lơ thí nghiệm, tương ứng 600 liều vacxin lepto tái tổ hợp dạng nhũ (200 liều/lô) Vacxin sau chia vào chai bảo quản nhiệt độ -80C Trong điều kiện đề tài, theo dõi mẫu vacxin bảo quản điều kiện nhiệt độ phòng ( 25 - 280C) Kết đạt yêu cầu nhiệt độ phịng: Sau 35 ngày nhũ khơng tách lớp Hình 3.28 Máy tạo nhũ L4RT (Hãng Silverson - Anh Quốc) 3.6.2 Kiểm tra tiêu vacxin theo tiêu chuẩn ngành 03 lơ vắc xin Lepto thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên tiến hành kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011: Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y - phép thử độ khiết, kiểm tra tiêu an toàn hiệu lực theo tiêu chuẩn sở TCCS - OMP QCB 012 3.6.2.1 Kết kiểm tra tạp nhiễm loại vi khuẩn nấm mốc Kết kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc Chúng tiến hành cấy vắc xin ống môi trường loại sau đây: thạch máu, thioglycollat, canh thang thịt Sabouraud, lượng vắc xin cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với mơi trường kiểm tra - Ủ mơi trường thạch máu, thioglycollat, canh thang thịt cấy vắc xin tủ 37oC, theo dõi từ ngày đến 10 ngày - Riêng Sabouraud theo dõi nhiệt độ phòng (từ 200C đến 250C) 14 ngày Kết kiểm tra thể Bảng 3.7: Bảng 3.7 Kết kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc Lô Mẫu vắc kiểm xin tra 01 02 Kiểm tra vô trùng Môi trƣờng kiểm tra Thạch Thiogly máu collat Môi trƣờng nhân Canh Thạch Canh Thiogly thang thịt máu thang thịt collat Sabouraud 20 Lô Mẫu vắc kiểm xin tra 03 Kiểm tra vô trùng Môi trƣờng kiểm tra Thạch Thiogly máu collat Môi trƣờng nhân Canh Thạch Canh Thiogly thang thịt máu thang thịt collat Sabouraud Ghi chú: - -: âm tính, khơng có vi khuẩn nấm mọc mơi trường kiểm tra Mẫu kiểm tra môi trường thường quy đạt vơ trùng, khơng có vi khuẩn nấm mọc tất môi trường kiểm tra, đạt yêu cầu so với tiêu chuẩn quy định Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma Mẫu vắc xin cấy kiểm tra môi trường canh thang PPLO (Pleuropneumonia-like organism) với nồng độ từ 1% đến 2% mẫu kiểm tra 100 ml mơi trường đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin đĩa Theo dõi môi trường lỏng 14 ngày nhiệt độ từ 330C đến 370C Tại thời điểm ngày, ngày, 10 ngày 14 ngày, lấy canh khuẩn môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa) Ủ tủ ấm CO2 370C có 5% khí CO2, theo dõi 28 ngày Lô vắc xin 01 Mẫu kiểm tra 02 03 Bảng 3.8 Kết kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma Thời gian Môi trƣờng nuôi cấy Kết theo dõi - Canh thang PPLO 28 ngày - Thạch PPLO - Canh thang PPLO 28 ngày - Thạch PPLO - Canh thang PPLO 28 ngày - Thạch PPLO - Kết luận Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Ghi chú: (-): Mycoplasma mọc mơi trường kiểm tra Các mẫu kiểm tra canh thang thạch PPLO không phát Mycoplasma mọc, đạt yêu cầu so với tiêu chuẩn quy định Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella Mẫu vắc xin cấy môi trường kiểm tra: thạch XLD (Xyloza Lysin Deoxycholat Agar), với nồng độ từ 1% đến 2% dung tích mơi trường kiểm tra Ủ mơi trường cấy tủ 37 oC, theo dõi từ 24 đến 72 giờ, kết trình bày Bảng 3.9 21 Lô vắc xin Mẫu kiểm Bảng 3.9 Kết kiểm tra tạp nhiễm Salmonella Thời gian theo Môi trƣờng nuôi cấy Kết tra dõi - Đạt - Đạt - Đạt - Đạt - Đạt - Đạt - Đạt - Đạt - Đạt 01 02 03 Kết luận 2 72 Thạch XLD 72 Thạch XLD 72 Thạch XLD Ghi chú: (-): khơng có Salmonella mọc môi trường kiểm tra Các mẫu kiểm tra thạch XLD không phát Salmonella mọc, đạt yêu cầu so với tiêu chuẩn quy định 3.6.2.2 Kết kiểm tra an tồn Chúng tơi tiến hành tiêm da cho 02 chuột lang (250-350g) liều vắc xin sử dụng 03 chuột nhắt trắng (18-20g) 1/6 liều sử dụng Kết trình bày Bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết kiểm tra an toàn vắc xin động vật thí nghiệm Lơ vắc Động vật thí nghiệm xin Số Liều tiêm lƣợng (ml) Đƣờng tiêm Theo dõi Sống/ tiêm (ngày) (con) (con) Chuột lang Dưới da 10 2/2 Chuột nhắt trắng 0,2 Dưới da 10 3/3 Chuột lang Dưới da 10 2/2 Chuột nhắt trắng 0,2 Dưới da 10 3/3 Chuột lang Dưới da 10 2/2 Chuột nhắt trắng 0,2 Dưới da 10 3/3 Các lơ thí nghiệm tiêm an tồn chuột lang chuột nhắt trắng, sau 10 ngày theo dõi tất động vật hoàn toàn khỏe mạnh, khơng có phản ứng tồn thân phản ứng cục vị trí tiêm Kết cho thấy 03 lơ vắc xin đạt an tồn động vật thí nghiệm 3.6.2.3 Kết kiểm tra hiệu lực Mỗi lơ thí nghiệm, chúng tơi tiến hành gây miễn dịch cách tiêm da cho thỏ mẫn cảm (22,5kg) liều vắc xin quy định lần cho động vật Sau ngày thỏ miễn dịch tiếp, liều vắc xin quy định lần cho động vật Sau tuần kể từ lần tiêm đầu, hiệu lực vắc xin đánh giá phương pháp huyết (Phản ứng vi ngưng kết): Bốn mẫu huyết thỏ miễn dịch với mẫu huyết thỏ đối chứng khơng tiêm vắc xin, pha lỗng 1/50, kiểm tra qua 22 phiến kính với chủng Leptospira có vắc xin Đọc kết sau 20-30 phút kính tụ quang đen Kết thể Bảng 3.11 Bảng 3.11 Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin phản ứng vi ngưng kết Lô vắc Chủng Leptospira Mẫu huyết xin 01 02 03 Đối chứng Miễn dịch L.bataviae +++ +++ +++ +++ - - L.canicola +++ +++ +++ +++ - - L.grypothyphosa +++ +++ +++ +++ - - L.ictero haemohagiae +++ +++ +++ +++ - - L.pomona +++ +++ +++ +++ - - L.bataviae +++ +++ +++ +++ - - L.canicola +++ +++ +++ +++ - - L.grypothyphosa +++ +++ +++ +++ - - L.ictero haemohagiae +++ +++ +++ +++ - - L.pomona +++ +++ +++ +++ - - L.bataviae +++ +++ +++ +++ - - L.canicola +++ +++ +++ +++ - - L.grypothyphosa +++ +++ +++ +++ - - L.ictero haemohagiae +++ +++ +++ +++ - - L.pomona +++ +++ +++ +++ - - Ghi chú: (+): ngưng kết (-): không ngưng kết Kết chúng tơi kiểm tra 03 lơ thí nghiệm cho thấy mẫu huyết kiểm tra cho kết ngưng kết mạnh (+ + +) với chủng Leptospira, mẫu đối chứng âm tính Kết kiểm tra hiệu lực phản ứng huyết cho thấy tiêu hiệu lực đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn quy định 3.6.2.4 Kết đánh giá vắc xin thực địa Để minh chứng vắc xin tái tổ hợp có hiểu an tồn động vật, 500 liều vắc xin thử nghiệm tiêm thực địa tỉnh Hà Nam Phú Thọ Vắc xin tiêm thử nghiệm bị, chó thời gian theo dõi 30 ngày Kết thử nghiệm vắc xin thực địa thể bảng 3.12 23 Bảng 3.12 Kết tiêm thử nghiệm vắc xin động vật thực địa Tình trạng động vật sau tiêm Đơn vị Stt Tỉnh Phú Thọ Tỉnh Hà Nam Tổng cộng: Động vật tiêm Số lƣợng Liều tiêm Ngày tiêm Bò 100 1ml 1/10/21 Chó 200 1ml Bị 50 Chó 150 Ngày đọc kết Khỏe mạnh Phản ứng 2/11/21 100 5/10/21 6/11/21 200 1ml 20/10/21 21/11/21 50 1ml 22/10/21 23/11/21 150 500 500 Kết từ bảng 3.12 cho thấy, Vắc xin tái tổ hợp có kết an toàn thực địa 100% động vật (bị, chó) tiêm tỉnh Hà Nam Phú Thọ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã định danh phân tử xây dựng phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn gây bệnh Leptospirosis Việt Nam, gồm: L Bataviae, L Canicola, L Grippotyphosa, L Icterohaemorrhagiae, L Pomona Kết cho thấy chủng xoắn khuẩn nghiên cứu nằm nhóm loài Leptospira interrogans - Các gen định kháng nguyên, bao gồm gen OmpL1, LipL32, LipL21, LipL41, LigA xuất chủng Leptospira nghiên cứu, riêng gen LigB xuất rõ ràng chủng - Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin vùng giàu epitop gen LipL21 chủng Leptospira nghiên cứu Đã xây dựng cấu trúc 3D đồng năm chủng Xác định vùng từ vị trí axit amin đến 70 71 đến 119 cấu trúc 3D giàu epitope, có khả tạo miễn dịch cao protein tạo có đặc tính ưa nước - Nhân dịng biểu thành cơng protein tái tổ hợp LipL21 hệ vector pJET1.2, vector pET32a, E.coli DH10b, E.coli BL21 Tối ưu điều kiện biểu hiện, cụ thể là: (1): nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng 37oC, (2): nồng độ cảm ứng IPTG 0,2 mM, (3): thời gian cảm ứng IPTG 4h - Kiểm tra tính sinh miễn dịch protein rLipL21 (còn gọi kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21): nồng độ protein rLipL21 tái tổ hợp 500µg tiêm cho động vật thí nghiệm cho hiệu kháng thể cao nhất, nồng độ lựa chọn để thử nghiệm sản xuất vắc xin - Chế tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21: Lựa chọn nhũ dầu chất bổ trợ phù hợp để phối trộn kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21, tỷ lệ phối trộn là: phần nhũ dầu: phần kháng nguyên (protein tái tổ hợp rLipL21); Xác định liều vắc xin tái tổ hợp rLipL21 cho động vật thí nghiệm 1ml cho đáp ứng miễn dịch tốt 24 - Các mẫu vắc xin tạo đạt tiêu vơ trùng, an tồn, hiệu lực theo TCVN 329980, TCN 192-94 - Sản xuất thử nghiệm chất lượng 600 liều vắc xin đạt tiêu chuẩn GMP-WHO - Tiêm thử nghiệm thành công vắc xin động vật thực địa tỉnh Hà Nam Phú Thọ (Kết minh chứng xác nhận Chi cục Thú y sở trình bày phần Phụ lục Luận án) 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu gen định kháng nguyên khác để tạo nhiều dòng vắc xin tái tổ hợp - Hồn thiện qui trình sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 quy mô công nghiệp 25 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Định danh phân tử xác chủng Leptospira interrogans lưu hành gây bệnh Leptospirosis cho động vật Việt Nam Đây chủng sử dụng sản xuất vắc xin nhược độc vô hoặt phòng chống bệnh Xoắn khuẩn cho động vật Việt Nam Xác định, phân tích lựa chọn vùng thị giàu epitope gen LipL21 định kháng nguyên Sử dụng vùng trình tự gen LipL21 để tạo kháng nguyên tái tổ hợp, tạo kháng thể đặc hiệu phòng bệnh Leptospirosis Thử nghiệm thành công vắc xin tái tổ hợp rLipL21, tạo kháng thể đặc hiệu chống bệnh Leptospirosis quy mô phịng thí nghiệm Bước đầu xây dựng q trình sản xuất vắc xin tái tổ hợp Leptospira đạt tiêu chuẩn Việt Nam Sản xuất thử nghiệm 600 liều vắc xin tái tổ hợp phịng bệnh Leptospirosis quy mơ pilot Tiêm thử nghiệm thành công vắc xin động vật thực địa tỉnh Hà Nam Phú Thọ Đóng góp liệu khoa học thơng qua cơng bố 04 báo tạp chí chuyên ngành quốc tế quốc gia Đây nghiên cứu có tính ứng dụng cao, bước đầu sử dụng công nghệ sinh học phân tử nghiên cứu tạo dòng vắc xin tái tổ hợp cho động vật Việt Nam Đây loại vắc xin bổ sung cho nguồn vắc xin nhược độc vô hoạt có, vắc xin tái tổ hợp có khả phịng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng động vật nên dễ thị trường quan tâm chấp nhận 26 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Nguyen Tuan Hung, Nguyen Van Huy, Nguyen Duc Hieu, Dang Thi Quynh, Vo Thi Bich Thuy and Nghiem Ngoc Minh Expression and Purification of the Recombinant OmpL1 Protein for Potential Vaccine Production against Leptospirosis International Journal of Zoology and Animal Biology, 2020, 3(6):000252 Nguyen Tuan Hung, Nguyen Duc Hieu, Dang Thi Quynh, Nguyen Van Huy, Nghiem Ngoc Minh and Vo Thi Bich Thuy A Recombinant Lipl21 Protein Vaccine from Five Leptospira interrogans Strains Against Pathogenic Leptospiral Infection in Vietnam (2020) Approaches in Poultry, Dairy & Veterinary Sciences 8(1) 000676 2020 DOI: 10.31031/APDV.2020.08.000676 Nguyễn Tuấn Hùng, Đặng Thị Quỳnh, Nghiêm Ngọc Minh, Võ Thị Bích Thủy Phân tích nhân dịng gen LipL21 mã hóa cho protein màng từ năm chủng Leptospira spp phân lập Việt Nam Báo cáo Khoa học Nghiên cứu Giảng dạy sinh học Việt Nam- Hội nghị Khoa học Quốc gia lần thứ 4, Hà Nội 2020 Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ, p 431 – 440 Vo Thi Bich Thuy, Nguyen Tuan Hung, Nghiem Ngoc Minh Analyzing 16S rRNA sequences from Vietnamese pathogenic Leptospira strains and in-silico prediction of potential antigenic epitopes on LipL21, LipL32 outer membrane lipoproteins Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2018, Vol 16 (4), 745-756