(Luận văn) xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn leptospira interrogans gây bệnh leptospirosis tại việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ lu an va XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ n QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA tn to XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans p ie gh GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM d oa nl w an lu ll u nf va LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va THÁI NGUYÊN - NĂM 2017 ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ lu an va XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ n QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA tn to gh XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans p ie GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM oa nl w CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 d u nf va an lu ll LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG oi m z at nh Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Bích Thủy z m co l gm @ an Lu n va THÁI NGUYÊN, NĂM 2017 ac th si LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người tận tình bảo, hướng dẫn q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường lu Đại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ an suốt trình học tập, nghiên cứu khoa học va n Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, KS Phạm tn to Thùy Linh anh chị em, cán phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên gh p ie cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, nhiệt tình hướng w dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tơi hồn thành luận văn oa nl Cuối cùng, xin bày tỏ lòng yêu thương biết ơn sâu sắc đến gia đình, d đồng nghiệp - người tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả lu ll u nf va an trình học tập hồn thành luận văn oi m Thái Nguyên, tháng năm 2017 z at nh Tác giả z l gm @ Trần Thị Thanh Huệ m co an Lu n va LỜI CAM ĐOAN ac th si Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu trực tiếp thực với giúp đỡ cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn khoa học TS Võ Thị Bích Thủy Các tư liệu trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn lu an n va Trần Thị Thanh Huệ p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề lu Mục tiêu nghiên cứu an n va Nội dung nghiên cứu tn to CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU gh 1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira p ie 1.2 Tình hình nghiên cứu giới nl w 1.2.1 Tình hình bệnh Leptospirosis d oa 1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 10 an lu 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 12 u nf va 1.3.1 Tình hình bệnh Leptospirosis 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 14 ll oi m VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 z at nh 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.2 Hóa chất, thiết bị 16 z gm @ 2.2.1 Hóa chất 16 l 2.2.2 Thiết bị 17 m co 2.3 Địa điểm nghiên cứu 17 an Lu 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18 n va ac th si ii 2.4.2 Định lượng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 19 2.4.3 Thiết kế cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 20 2.4.4 Kỹ thuật PCR 20 2.4.5 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA 21 2.4.6 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 22 2.4.7 Phân tích xây dựng sơ đồ hình phân loại chủng Leptospira 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 lu 3.1 Phân loại học phân tử chủng Leptospira 24 an 3.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số 24 n va tn to 3.1.2 Trình tự cặp mồi gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB 26 ie gh 3.1.3 Nhân gen với cặp mồi gen 16S rDNA 27 p 3.1.4 Tinh sản phẩm PCR gen 16S rDNA 28 oa nl w 3.1.5 Giải trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn 29 d 3.1.6 Phân tích xây dựng phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn 30 an lu ll u nf va 3.2 Xác định có mặt gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 34 oi m KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 z at nh Kết luận 41 Đề nghị 41 z m co l PHỤ LỤC gm @ TÀI LIỆU THAM KHẢO an Lu n va ac th si iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT lu an Base pair dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EMJH Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris EtBr Ethidium Bromide F- Forward Primer : Mồi xuôi R- Reverse Primer: Mồi ngược n va bp gh tn to Kilobase p ie Kb Leptospira Protein màng (outer membrane protein) an lu Polymerase Chain Reaction u nf va PCR d OMP Multilocus Sequence Typing oa MLST nl w L Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA ll RNA oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng 17 2.2 Thành phần phản ứng nhân gen 21 3.1 3.2 lu an 3.3 Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ bước sóng 260nm 25 280nm chủng Leptospira Trình tự cặp mồi dùng để nhân đoạn gen 27 Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ sở 30 liệu GenBank n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si v DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Leptospira interrogans Chu kì nhiệt phản ứng PCR nhân gen 21 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số chủng Leptospira 24 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 28 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S lu 3.3 an tinh va Hình ảnh phát sinh chủng loại chủng xoắn khuẩn 3.4 29 32 n 35 gh tn to 3.5.a Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA 3.5.b Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32 p ie 35 3.5.c Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB 36 nl w 3.5.d Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1 d oa 36 3.5.e Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21 an lu 37 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41 va 3.5.f 37 ll u nf oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến giới, Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal HealthOIE) xếp vị trí thứ nhóm bệnh nguy hiểm bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp Việt Nam Nguyên nhân gây loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans lu Leptospira interrogans loài gây bệnh thường kí sinh người động an n va vật, bao gồm 200 typ, chia thành 23 nhóm (trong Leptospira khả gây bệnh động vật lây sang người Bệnh xoắn khuẩn gh tn to interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất) Xoắn khuẩn có p ie gây cịn gọi bệnh vàng da, gây ảnh hưởng đến quan gây sẩy thai thú nuôi Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc, oa nl w da, mắt màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu d mẫu mô động vật mắc bệnh Bệnh phát triển khắp nơi giới, gây an lu thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe u nf va người Do tính đa dạng triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn ll đốn tỷ lệ tử vong cao Việc điều trị bệnh khó khăn nên địi hỏi m oi biện pháp phịng ngừa bệnh có hiệu cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng z at nh bệnh xoắn khuẩn Leptospira yêu cầu cấp thiết z Trong trình nghiên cứu ứng dụng, nhà khoa học tập trung gm @ vào loại vắc xin có khả phịng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ l vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe m co cộng đồng động vật Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc an Lu thiết kế dựa sở trình tự gen yếu tố độc lực tác nhân gây bệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn loại vắc xin Đây bước đột n va ac th si 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Trình tự gen 16S rDNA chủng xoắn khuẩn kết xây dựng sơ đồ phân loại cho thấy mẫu chủng sử dụng nghiên cứu chủng Leptospira interrogans mà khơng bị nhầm lẫn q trình thực nghiệm Các chủng Leptospira interrogans Việt Nam có khác biệt so với số chủng Leptospira gây bệnh khác giới (mức độ gần gũi mặt di truyền từ 62 - 99 %, khoảng cách di truyền 0,00 - 0,82), dịch lu tễ học địa lý khác dẫn đến đa dạng di truyền an - Ở chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, sử dụng va n chế vắc xin vô hoạt Việt Nam có mặt số gen mã hóa kháng nguyên, gh tn to bao gồm: gen LipL32, LipL21 gen LigA xuất tất chủng kiểm tra, riêng gen OmpL1 xuất chủng (gồm L interrogans ie p serovar Bataviae, L interrogans serovar Canicola, L interrogans serovar Mitis nl w L interrogans serovar Pomona), gen LipL41 khơng xuất bất d oa chủng Leptospira Chúng bước đầu dự đốn 3/ gen sử an lu dụng gen tiềm cho nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp phòng va chống bệnh xoắn khuẩn Việt Nam Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu ll u nf sinh học phân tử sâu để chứng minh giả thuyết oi z at nh Cần tiếp tục nghiên cứu: m Đề nghị z - Giải trình tự gen định kháng nguyên tiềm (gen LigA, LigB, @ l gm gen OmpL1, gen LipL32, gen LipL41 gen LipL21) - Phân tích protein tái tổ hợp tiềm để tạo sở cho việc sản xuất vắc xin m co tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis Việt Nam an Lu n va ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu Tiếng Việt Trần Quang Bính (2010), "Nhân số trường hợp nhiễm Leptospira khó chẩn đốn", Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, Phụ Số 2,14: p 603-607 Báo Lao động (2003), "Hà Nội có nguy bùng phát dịch Leptospirosis", Báo Lao động Trần Thanh Phong ( 1996), Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo, Tủ sách ĐHNL TP.HCM lu an Huỳnh Hồng Quang (2009), Bệnh Leptospirose dấu hiệu lâm va n sàng cần phân biệt với sốt rét ác tính thể gan mật,Viện Sốt Rét Ký Sinh tn to Trùng Côn Trùng Quy Nhơn Nguyễn Thị Nội, Vũ Đình Hưng (1980), Bệnh Leptospirosis gia súc người, Kết nghiên cứu KH&KT thú y 1968 – 1978: p 226-232 p ie gh Lê Thị Thanh Xuân (2015), "Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh xoắn nl w d oa trùng Leptospira Việt Nam giai đoạn 2002-2011", Tạp chí y học dự an lu phòng, 6(15): p 358 va B Tài liệu Tiếng Anh A Slack (2010), Leptospirosis, Aust Fam Physician, 7(39): p 495 - 498 Alston JM (1963), The Leptospiroses,The Practitioner, 191: p 594-598 Alston JM and Brown HC (1937), The epidemiology of Weil's ll u nf oi m z at nh disease,Journal of the Royal Society of Medicine, 30(6): p 741-756 Artiushin S, Timoney JF, Nally J, Verma A (2004), Host-inducible z 10 @ gm immunogenic sphingomyelinase-like protein, Lk73 5, of Leptospira 11 m co l interrogans,Infection and immunity, 72(2): p 742-749 Bacelo Katia L, Hartwig Daiane D, Seixas Fabiana K, Schuch Rodrigo, an Lu Moreira Angelita da S, Amaral Marta, Collares Tiago, Vendrusculo Claire T, McBride Alan JA, Dellagostin Odir A (2014), Xanthan gum as n va ac th si an adjuvant in a subunit vaccine preparation against leptospirosis, BioMed research international 12 Baranton Guy and Postic Danièle (2006), "Trends in leptospirosis epidemiology in France Sixty-six years of passive serological surveillance from 1920 to 2003", International journal of infectious diseases, 10(2): p 162-170 13 Bourhy Pascale, Collet Louis, Brisse Sylvain, Picardeau Mathieu (2014), "Leptospira mayottensis sp nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans", International journal of systematic lu an and evolutionary microbiology, 64(12): p 4061-4067 Branger C, Sonrier C, Chatrenet B, Klonjkowski B, Ruvoen-Clouet N, n va 14 tn to Aubert A, Andre-Fontaine G, Eloit M (2001), Identification of the Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination, Infection p ie gh hemolysis-associated protein as a cross-protective immunogen of and immunity, 69(11): p 6831-6838 w Charon Nyles W and Goldstein Stuart F (2002), Genetics of motility and oa nl 15 d chemotaxis of a fascinating group of bacteria: the spirochetes, Annual lu Coutinho ML, Vasconcellos FA, Fernandes CPH, Seyffert N, Seixa K, u nf 16 va an review of genetics, 36(1): p 47-73 ll Ko AI, Dellagostin OA, Aleixo JAG (2007), "Evaluation of the Anti‐ m oi LipL32 Monoclonal Antibodies Potential for Use in Leptospirosis z at nh Immunodiagnostic Tests", Journal of immunoassay & z immunochemistry, 28(3): p 279-288 @ 17 Cullen Paul A, Cordwell Stuart J, Bulach Dieter M, Haake David A gm l Adler Ben (2003), LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of an Lu 2421 m co pathogenic Leptospira species, Infection and immunity, 71(5): p 2414- n va ac th si 18 Dai B, Chen Z, Haake DA, You Z, Fang Z (1999), Alignment of DNA sequences of ompL1 genes of insert fragment of recombinant plasmid, pDC38 of L interrogans serovar lai and L kirschneri, Hua xi yi ke da xue xue bao= Journal of West China University of Medical Sciences= Huaxi yike daxue xuebao/[bian ji zhe, Hua xi yi ke da xue xue bao bian wei hui], 30(3): p 236-240 19 Day MJ (2006), Vaccine side effects: fact and fiction, Veterinary microbiology, 117(1): p 51-58 20 Dezhbord Mehrangiz, Esmaelizad Majid, Khaki Pejvak, Fotohi Fariba, lu an Moghaddam Athena Zarehparvar (2014), "Molecular identification of n va the ompL1 gene within Leptospira interrogans standard serovars", The tn to Journal of Infection in Developing Countries, 8(06): p 688-693 Diament Decio, Brunialti Milena Karina Colo, Romero Eliete Calo, Kallas Esper Georges, Salomao Reinaldo (2002), Peripheral blood p ie gh 21 mononuclear cell activation induced by Leptospira interrogans w Erridge Clett, Pridmore Alison, Eley Adrian, Stewart John, Poxton Ian d 22 oa nl glycolipoprotein, Infection and immunity, 70(4): p 1677-1683 lu va an R (2004),"Lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis, Chlamydia u nf trachomatis and Pseudomonas aeruginosa signal via toll-like receptor 2", ll Journal of Medical Microbiology, 53(8): p 735-740 m Forster Karine M, Hartwig Daiane D, Oliveira Thaís L, Bacelo Kátia L, oi 23 z at nh Schuch Rodrigo, Amaral Marta G, Dellagostin Odir A (2015), DNA z prime-protein boost based vaccination with a conserved region of @ leptospiral immunoglobulin-like A and B proteins enhances protection gm Franỗois Guido, Duclos Philippe, Margolis Harold, Lavanchy Daniel, m co 24 l against leptospirosis, Memórias Instituto Oswaldo Cruz, (AHEAD) an Lu Siegrist Claire-Anne, Meheus André, Lambert Paul-Henri, Emiroglu Nedret, Badur Selim, Van Damme Pierre (2005), Vaccine safety n va ac th si controversies and the future of vaccination programs, The Pediatric infectious disease journal, 24(11): p 953-961 25 Gebriel AM, G Subramaniam, and SD Sekaran (2006), The detection and characterization of pathogenic Leptospira and the use of OMPs as potential antigens and immunogens, Trop Biomed, 23(2): p 194-207 26 Guerreiro Hygia, Croda Júlio, Flannery Brendan, Matsunaga James Reis, Mitermayer Galvaxo (2001), Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans, Infect, Immun 27 Haake DA, Champion CI, Martinich C, Shang ES, Blance DR, Miller lu an JN, Lovett MA (1993), "Molecular cloning and sequence analysis of the n va gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of tn to pathogenic Leptospira spp" Journal of bacteriology, 175(13): p 4225- gh 4234 Haake David A, Chao Garlo, Zuerner Richard L, Barnett Jeanne K, p ie 28 Barnett Dean, Mazel Mary, Matsunaga James, Levett Paul N, Bolin w oa nl Carole A (2000), The leptospiral major outer membrane protein LipL32 d is a lipoprotein expressed during mammalian infection, Infection and lu Haake David A, Mazel Mary K, McCoy Adam M, Milward Frank, Chao u nf 29 va an immunity, 68(4): p 2276-2285 ll Garlo, Matsunaga James, Wagar Elizabeth A (1999), Leptospiral outer OmpL1 oi proteins m membrane and LipL41 exhibit synergistic z at nh immunoprotection, Infection and immunity, 67(12): p 6572-6582 Hu Weilin and Yan Jie (2014), Leptospira and leptospirosis in China, z 30 @ Current opinion in infectious diseases, 27(5): p 432-436 gm Hübener EA and Reiter Hans (1915), Beiträge zur Aetiologie der l 31 m co Weilschen Krankheit, Dtsch,Med, Wochenschr., 41: p 1275-1277 an Lu n va ac th si 32 Inada R and Ido Y (1915), A report of the discovery of the causal organism (a new species of spirocheta) of Weil’s disease, Tokyo Ijishinshi, 1908: p 351-360 33 Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune (1918), "INTRAVENOUS SEROTHERAPY OF WEIL'S DISEASE (SPIROCHỈETOSIS ICTEROHỈMORRHAGICA)", The Journal of experimental medicine, 27(2): p 283 34 Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune (2014), B-cell-specific peptides of Leptospira interrogans LigA for lu an diagnosis of patients with acute leptospirosis, Clinical and Vaccine n va Immunology, 21(3): p 354-359 Koizumi N and Watanabe H (2005), "Leptospirosis vaccines: past, tn to 35 gh present, and future", Journal of postgraduate medicine, 51(3): p 210 Nobuo Koizumi and Haruo Watanabe (2003), Molecular cloning and p ie 36 characterization of a novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain, w Koizumi Nobuo and d 37 oa nl FEMS microbiology letters, 226(2): p 215-219 Watanabe Haruo (2004), Leptospiral lu va an immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity, Vaccine, Lee Seoung Hoon, Kim Kyung A, Park Yong Gun, Seong In Wha, Kim Min ll 38 u nf 22(11): p 1545-1552 m oi Ja, Lee Yong Ju (2000), Identification and partial characterization of a z at nh novel hemolysin from Leptospira interrogans serovar Lai, Gene, 254(1): @ 39 z p 19-28 Lee Seoung Hoon, Kim Sangduk, Park Seung Chul, Kim Min Ja (2002), gm l Cytotoxic activities of Leptospira interrogans hemolysin SphH as a pore- an Lu 315-322 m co forming protein on mammalian cells, Infection and immunity, 70(1): p n va ac th si 40 Levett Paul N, Branch Songee L, Whittington Carol U, Edwards Charles N, Paxton Helene (2001), Two methods for rapid serological diagnosis of acute leptospirosis, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 8(2): p 349-351 41 Li Chunhao, Motaleb A, Sal Melanie, Goldstein Stuart F, Charon Nyles W (2000), "Spirochete periplasmic flagella and motility", Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p 345-354 42 Maneewatch Santi, Adisakwattana Poom, Chaisri Urai, Saengjaruk , Patcharin, Srimanote Potjanee, Thanongsaksrikul Jeeraphong, lu an Sakolvaree Yuwaporn, Poungpan Phakkanan, Chaicumpa Wanpen n va (2014), Therapeutic epitopes of Leptospira LipL32 protein and their tn to characteristics, Protein Engineering Design and Selection: p gzu006 Matsunaga James, Young Tracy A, Barnett Jeanne K, Barnett Dean, Bolin Carole A, Haake David A (2002), Novel 45-kilodalton leptospiral p ie gh 43 protein that is processed to a 31-kilodalton growth-phase-regulated w lu McBride AJ Athanazio DA, Reis MG, Ko AI (2005), Leptospirosis, Curr va an 44 d 334 oa nl peripheral membrane protein, Infection and immunity, 70(1): p 323- Nascimento Ana Lucia Tabet Oller do, Verjovski-Almeida S, Van Sluys ll 45 u nf Opin Infect Dis 5(18): p m oi MA, Monteiro-Vitorello CB, Camargo LEA, Digiampietri LA, z at nh Harstkeerl RA, Ho PL, Marques MV, Oliveira MC (2004), "Genome z features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni", Brazilian @ Journal of Medical and Biological Research, 37(4): p 459-477 gm Oliveira Thaís Larré, Grassmann André Alex, Schuch Rodrigo Andrade, l 46 m co Neto Amilton Clair Pinto Seixas, Mendonỗa Marcelo, Hartwig Daiane an Lu Drawanz, McBride Alan John Alexander, Dellagostin Odir Antonio (2015), Evaluation of the Leptospira interrogans Outer Membrane n va ac th si Protein OmpL37 as a Vaccine Candidate, PloS one, 10(11): p e0142821 47 Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Chang Chao-Fu, Pan MJ Yang CW, Harpending Peter, McDonough Sean P, Dubovi Edward, Divers Thomas, Qu Jiaxin (2005), Evaluation of lig-based conventional and real time PCR for the detection of pathogenic leptospires, Molecular and cellular probes, 19(2): p 111-117 48 Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Jusuf SSD, Artiushin S, Timoney John F, McDonough Sean P, Barr Steve C, Divers Thomas J, lu an Simpson Kenneth W, McDonough Patrick L (2002), Cloning and n va molecular characterization of an immunogenic LigA protein of tn to Leptospira interrogans, Infection and immunity, 70(11): p 5924-5930 Palaniappan Raghavan UM, McDonough Sean P, Divers Thomas J, Chen Chia-Sui, Pan Ming-Jeng, Matsumoto Mitsuharu, Chang Yung-Fu p ie gh 49 (2006), Immunoprotection of recombinant leptospiral immunoglobulin- w oa nl like protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection, d Infection and immunity, 74(3): p 1745-1750 lu Palaniappan Raghavan UM, Ramanujam Subbupoongothai, and Chang va an 50 u nf Yung-Fu (2007), Leptospirosis: pathogenesis, immunity, and diagnosis ll Current opinion in infectious diseases, 20(3): p 284-292 m Park Se-Hoon, Ahn Byung-Yoon, and Kim Min-Ja (1999), Expression oi 51 z at nh and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58 z of Leptospira species: a major target antigen of the humoral immune @ response, DNA and cell biology, 18(12): p 903-910 gm Picardeau M (2013), Diagnosis and epidemiology of leptospirosis, l 52 Picardeau Mathieu, Bauby Hélène, and Saint Girons Isabelle (2003), an Lu 53 m co Médecine et maladies infectieuses, 43(1): p 1-9 Genetic evidence for the existence of two pathways for the biosynthesis n va ac th si of methionine in the Leptospira spp, FEMS microbiology letters, 225(2): p 257-262 54 Priya C Gowri, Bhavani K, Rathinam SR, Muthukkaruppan VR (2003), "Identification and evaluation of LPS antigen for serodiagnosis of uveitis associated with leptospirosis", Journal of medical microbiology, 52(8): p 667-673 55 Ren Shuang-Xi, Fu Gang, Jiang Xiu-Gao, Zeng Rong, Miao You-Gang, Xu Hai, Zhang Yi-Xuan, Xiong Hui, Lu Gang, Lu Ling-Feng (2003), Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans lu an revealed by whole-genome sequencing, Nature, 422(6934): p 888-893 Rettinger Anna, Krupka Inke, Grünwald Karola, Dyachenko Viktor, n va 56 tn to Fingerle Volker, Konrad Regina, Raschel Heribert, Busch Ulrich, Sing identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene p ie gh Andreas, Straubinger Reinhard K (2012), Leptospira spp strain sequencing and multi locus sequence typing (MLST), BMC w oa nl microbiology, 12(1): p 185 Sambrook (2011), Molecular cloning: a laboratory manual 58 Seixas Fabiana Kömmling, Fernandes Claudia Hartleben, Hartwig d 57 va an lu u nf Daiane Drawanz, Conceicao Fabricio Rochedo, Aleixo Jose Antonio ll Guimaraes, Dellagostin Odir Antonio (2007), "Evaluation of different m oi ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of z at nh developing a recombinant vaccine against leptospirosis", Canadian z journal of microbiology, 53(4): p 472-479 @ 59 Silva Éverton F, Medeiros Marco A, McBride Alan JA, Matsunaga gm l Jim, Esteves Gabriela S, Ramos João GR, Santos Cleiton S, Croda Júlio, m co Homma Akira, Dellagostin Odir A (2007), The terminal portion of an Lu leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective n va ac th si immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis, Vaccine, 25(33): p 6277-6286 60 Smythe Lee D, Smith Ina L, Smith Greg A, Dohnt Michael F, Symonds Meegan L, Barnett Leonie J, McKay David B (2002), A quantitative PCR (TaqMan) assay for pathogenic Leptospira spp, BMC infectious diseases, 2(1): p 13 61 Talwani Rohit, Gilliam Bruce L, and Howell Charles (2011), Infectious diseases and the liver, Clinics in liver disease, 15(1): p 111-130 62 Vanasco Norma Bibiana, Schmeling MF, Lottersberger Javier, Costa lu an Federico, Ko Albert Icksang, Tarabla Héctor Dante (2008), Clinical n va characteristics and risk factors of human leptospirosis in Argentina tn to (1999–2005), Acta Tropica, 107(3): p 255-258 Vedhagiri K, Natarajaseenivasan K, Chellapandi P, Prabhakaran SG, Selvin Joseph, Sharma S, Vijayachari P (2009), Evolutionary implication of outer p ie gh 63 membrane lipoprotein-encoding genes ompL1, lipL32 and lipL41 of w oa nl pathogenic Leptospira species, Genomics, proteomics & bioinformatics, d 7(3): p 96-106 lu Wang Zhijun, Jin Li, and Węgrzyn Alicja (2007), Leptospirosis va an 64 Wasinski Bernard and Dutkiewicz Jacek (2013), Leptospirosis-current ll 65 u nf vaccines, Microbial Cell Factories, 6(1): p 39 m oi risk factors connected with human activity and the environment, Annals z at nh of Agricultural and Environmental Medicine, 20(2) Xiao Di, Zhang Cuicai, Zhang Huifang, Li Xiuwen, Jiang Xiugao, z 66 @ Zhang Jianzhong (2015), "A novel approach for differentiating gm l pathogenic and non-pathogenic Leptospira based on molecular Yanagihara Yasutake, Villanueva Sharon YAM, Yoshida Shin-ichi, an Lu 67 m co fingerprinting", Journal of proteomics, 119: p 1-9 Okamoto Yoshihiro, Masuzawa Toshiyuki (2007), Current status of n va ac th si leptospirosis in Japan and Philippines, Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 30(5): p 399-413 68 Yang Hong-Liang, Zhu Yong-Zhang, Qin Jin-Hong, He Ping, Jiang XuCheng, Zhao Guo-Ping, Guo Xiao-Kui (2006), In silico and microarraybased genomic approaches to identifying potential vaccine candidates against Leptospira interrogans, BMC genomics, 7(1): p 293 69 Ye Cuilian, Yan Weiwei, McDonough Patrick L, McDonough Sean P, Mohamed Hussni, Divers Thomas J, Chang Yung-Fu, Yang Zhibang (2014), Serodiagnosis of equine leptospirosis by enzyme-linked lu an immunosorbent assay using four recombinant protein markers, Clinical n va and Vaccine Immunology, 21(4): p 478-483 Zuerner Richard, Haake David, Adler Ben, Segers Ruud (2000), tn to 70 Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p 455-462 p ie gh "Technological advances in the molecular biology of Leptospira", d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu PHỤ LỤC n va Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Bataviae ac th si GACCGGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGAA GGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCAGC AATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCAT TGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAA ACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGA GTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCG TAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCT AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA lu an GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAAGGTTGTCTACCAGTTGTTGG n va GGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGC tn to CTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAATGAAATTTGACGG ie gh Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Mitis p GGCCCAAGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGA nl w AGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCMSGGAAAAATAAGCAG d oa CAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC an lu AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCATT u nf va GGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAAA CTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGAG ll oi m TTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGT z at nh AGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCTA AAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTAA z @ ATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTTGGG l gm GGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGCCT GGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGGA m co Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Pomona an Lu n va ac th si GGATGGCCGTCCCAGGGCGGTCTACTTAATCCGTTAGGTTCGTTAC TGAGGGTTAAAACCCCCAACAACTGGTAGACCACGTTTAGGGCGT GGATTACCGGGGTATCTAATCCCGTTCACTACCCACGCTTTCGTGC CTCAGCGTCAGTTTTAGGCCAGCAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTT CCTCCAGATATCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCCACTT GCCTCTCCCAAACTCCAGACACATAGTTTCAAGTGCAGGCTGCGA GTTGAGCCCGCAGTTTTCACACCTGACTTACATGTCCGCCTACGCA CCCTTTACGCCCAATGATTCCGAACAACGCTTGCACCATACGTATT ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTTAGGCAGGTAC lu an CATCATCACATTGCTGCTTATTTTTCCCTGCTTACTGAACTTTACAA n va TCCGAAGACCTTCATCGTTCACGCGGCGTCGCTGCTTCAGGGTTCC tn to CCCCAATATAGAATAATCCTAATCGGCCGTGCCCCATCAGCCAAG gh GCATTAATAACCCTGGCCAAGGGGGGGGAAACCCAAAAACCCCCC p ie CCCCCGAGAAAGAAAAAATTTCCCCAATAGTAAAATTTTTCAAAA AGGGGGAAAAAAAAAACCCCCCGGGGAAAAAGGGTCCCCCCCCA w oa nl AAGCCCCGAAAAAAGGGGGCCCCCCCGGGGAAAAAAATAAGGGG d GGAAATGTTTTTAACAAAAAATTGCGGGCAAACAGGGGGGGGAG lu va an GGGGGGAAATAGATATTAGGTGGGATAAAAAACGAGACGCGCGG u nf GGTGTTGCAAAAAAAACCTTTGCGCGTAGTGGTGAGAGAGAGAAG ll AGACCCCCTCTCCCGCGTGGGGCGCGGGGAAATATTATAATATTTT m oi GGAAAGACACATCACGAGCAGACCAGCATTAAGGTATAACACTAG z at nh CTAAACTAGACTGAGCATACGA z Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Canicola @ l gm GGGCGTGGGGGGCAAATCTGACCACCCATGCCGCGTGAAGGATGA AGGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATAGGGGGCGAAAAAAGG m co GAAATCTTTCTCACTTGACCGTACCCTATGAATAACACACCGGCTA an Lu ACTCCGTGCCAGCAAACCGCGGTACATACGGAGGGTGCAAGCGTT n va ATCCGGATTCACTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGGCGTATAAG ac th si TCAAATGGTGAAATCCTGGAGCTTATCTCCAGAACTGCCATTGATA CTATATGTCTTGAATATGGTGGAGGTAACCGGAATATGTCATGTAG CGGTGAAATGCATAAATATGAACATAGAACACCTATTGCGAAGGC GGCTTACTACGCCTATTTTGACCCTAAGGCACGAAAGCGTGGGGA TCAAACAGGATTAGATACCCTGGTACTCCACGCCCTAAACCATGAT TACTCGACGTGTGCGATAAACGGTACGCGTCTGAGCGAAAGCATT AAGTAATCCACCTGGGAAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAT GAAATTGACGG Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Grippotyphosa lu an TTAACCTTGGGGGCACCTGTATCAGCGCAGGCCGCGTGAACGACG va n AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCATTAGGCAGGGAAAAATAAGCA gh tn to ACCTTGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGATAACTACCTGC CAGCAACCGCGGTAATACCTATGGGGCAAGCGTTGTTCGGAATCA ie p TTGGGCGTAAAGGGTGCGTAAGCGGACATGTAATTCAAGTGTGAA nl w AACTGCGGGCTCACCTCATAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGG d oa AGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTACCGGTGAAATGC an lu GTAAATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCACTTGCTGGCCT u nf va AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCACTTGTTGG ll oi m GGGTTTTAACCCTCATTAACGAACCTAACGGATTAACTAGACCGCC z at nh TGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGG z Trình tự gen 16S rDNA chủng L interrogans serovar Icteroheamorrhagiae gm @ GCACGGAGGGGGGGCACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATG l m co AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCA GCAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTG an Lu CCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGKGCAAGCGTTGTTCGGAATC n va ATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGA ac th si AAACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTG GAGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCRGGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGC CTAAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGAT TAGATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTT GGGGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACC GCCTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAAATTGAC GGATAGCAAACCAAGAGTCTTGCTCACTGGGGGGAACCCTGAAGC ATTCACAACGCATGAGCCATCAACGTCGTCCAATTGTAAAAGTTCC lu an CTAAGCAGGGAAGTATAARCAGCATGCTGAATGATTGTACCTGCC n va TAAAGGCACGGCTAATTACGTGCCGCRTCGGCCTAATACATTATGG tn to GTGCAACGGGTTGTTTAGGAATCATTAGTAACGTAGAGAGGGCGA gh TATAGGGCGGAACATCGACAAGTCAGGATGTGAAAACTGGCGTGC p ie TCACTACACTGCAATAGAAAAATAAACGTTATTCGAGGAGTTTCG GGAACAAGCAAATGATAATTCCCAGGATGTCACAAGGTGACAACC w d oa nl GTGGCTACAAAATRTCTCTCAGACAGGGA ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si