Lý phương linh nghiên cứu điều chế cao đặc chứa isoflavonoid từ sắn dây củ tròn khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÝ PHƯƠNG LINH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC CHỨA ISOFLAVONOID TỪ SẮN DÂY CỦ TRỊN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÝ PHƯƠNG LINH Mã sinh viên: 1801386 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC CHỨA ISOFLAVONOID TỪ SẮN DÂY CỦ TRỊN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người suốt thời gian qua hỗ trợ, động viên em suốt khoảng thời gian em thực đề tài Đầu tiên, với lòng biết ơn kính trọng sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Thái Hà Văn – Giảng viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội – người trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em từ ngày đầu nghiên cứu, giúp em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy giáo, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình hướng dẫn em thời gian em thực khóa luận mơn Nhân đây, em xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường tồn thể thầy Đại học Dược Hà Nội đào tạo, trang bị kiến thức giúp đỡ em trình em học tập trường Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị cao học làm thực nghiệm môn Dược học cổ truyền, bạn làm khóa luận khóa 73: bạn Nguyễn Thị Vân Anh, Đỗ Trang Ngân, Nguyễn Thị Thanh Huyền em khóa 74 nhóm nghiên cứu môn Dược học cổ truyền, tất giúp đỡ, động viên, hỗ trợ suốt thời gian làm nghiên cứu môn Dược học cổ truyền Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè ln khích lệ, giúp đỡ cổ vũ em suốt thời gian qua Do kiến thức thân cịn giới hạn nên luận văn khơng tránh khỏi hạn chế thiếu sót Em mong nhận góp ý, chỉnh sửa quý thầy cô, bạn bè Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng năm 2023 Sinh viên Lý Phương Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Sắn dây củ tròn 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại 1.1.2 Phân bố .2 1.1.3 Đặc điểm thực vật .2 1.1.4 Bộ phận dùng .3 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Tác dụng sinh học 1.1.7 Độc tính .7 1.1.8 Một số tác dụng SDCT theo y học cổ truyền Thái Lan .8 1.2 Hàm lượng số isoflavonoid yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng isoflavonoid sắn dây củ tròn 1.3 Tổng quan cao đặc 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Phương pháp điều chế cao đặc 1.3.3 Yêu cầu chất lượng với cao đặc .10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .11 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 11 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 11 2.1.2 Thiết bị, máy móc 11 2.1.3 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu 12 2.3.1 Lựa chọn isoflavonoid để định lượng 12 2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng genistein rễ củ SDCT HPLC 12 2.3.3 Nghiên cứu chế tạo cao chiết 15 2.3.4 Khảo sát số tiêu chất lượng cao chiết SDCT 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19 3.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng genistein rễ củ SDCT 19 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 19 3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng genistein rễ SDCT 20 3.2 Chế tạo cao chiết 24 3.2.1 Quá trình chiết xuất 24 3.2.2 Quá trình tinh chế 25 3.2.3 Kết điều chế cao đặc rễ củ SDCT theo phương pháp chọn .26 3.3 Bàn luận 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 4.1 Kết luận 32 4.1.1 Về xây dựng phương pháp định lượng genistein rễ củ SDCT sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .32 4.1.2 Về quy trình điều chế cao đặc SDCT 32 4.1.3 Về khảo sát số tiêu chất lượng cao đặc rễ củ SDCT điều chế 33 4.2 Đề xuất .33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Association of Official Analytical Chemists DĐVN Dược điển Việt Nam EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao MeOH Methanol Rf Hệ số lưu RS Độ lệch chuẩn RSD Độ lệch chuẩn tương đối SDCT Sắn dây củ trịn SKLM Sắc kí lớp mỏng STT Số thứ tự TLC Thin layer chromatography YHCT Y học cổ truyền DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết tính phù hợp hệ thống phương pháp định lượng 21 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng genistein 22 Bảng 3.3 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng 23 Bảng 3.4 Kết thẩm định độ phương pháp định lượng 24 Bảng 3.5 Hiệu suất chiết hàm lượng genistein dịch chiết 25 Bảng 3.6 Hiệu suất tinh chế, chiết hàm lượng cao đặc 25 Bảng 3.7 Kết khảo sát tiêu khối lượng làm khô 27 Bảng 3.8 Kết định lượng genistein cao đặc điều chế 28 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức 17β – estradiol isoflavonoid SDCT Hình 1.2 Công thức coumestrol Hình 1.3 Cơng thức chromene Hình 2.1 Một số hình ảnh mẫu vật 11 Hình 3.1 Hình ảnh phổ genistein khoảng 200 – 400 nm 19 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu mẫu thử 20 Hình 3.3 Kết khảo sát tính đặc hiệu phương pháp định lượng genistein 21 Hình 3.4 Quy trình điều chế cao đặc rễ củ SDCT 26 Hình 3.5 Hình ảnh cao đặc điều chế 27 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC cao đặc rễ SDCT (T) chất đối chiếu genistein (C) bước sóng 254 nm 366 nm 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn dây củ tròn có tên khoa học Pueraria mirifica phân bố dùng núi cao phía bắc Thái Lan, Myanma Theo y học cổ truyền Thái Lan, từ lâu sắn dây củ trịn sử dụng với mục đích làm đẹp, trẻ hóa cho nữ giới tuổi mãn kinh Ngày nay, nguyên cứu cho thấy có chứa nhiều loại phytoestrogen có tác dụng hướng estrogen mạnh isoflavonoid, chromen, coumestan, đặc biệt miroestron, đồng thời có báo cáo thử nghiệm lâm sàng, tiền lâm sàng chứng minh tác dụng cải thiện triệu chứng mãn kinh phụ nữ [25] Với tác dụng tốt giá trị kinh tế cao, sắn dây củ tròn trồng di thực Việt Nam Để hướng tới phát triển dòng sản phẩm bào chế đại từ sắn dây củ tròn, việc nghiên cứu điều chế dạng bào chế cho dịch chiết dược liệu cần thiết Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trước đây, hầu hết dung môi chiết xuất cho sắn dây củ tròn Methanol hay Ethanol tuyệt đối [9], [28] Để nâng lên quy mô lên công nghiệp, việc sử dụng dung môi tuyệt đối gây lãng phí Vì nghiên cứu hướng tới việc sử dụng cồn thấp độ dung môi chiết xuất, đồng thời kết hợp với trình loại tạp để bào chế cao chiết sắn dây củ tròn giàu isoflavonoid Trong đề tài này, em lựa chọn dạng bào chế cao đặc dạng bào chế trung gian để tiếp tục chuyển sang dạng bào chế khác dung dịch, viên nang, viên nén, kem, gel, Chính vậy, em thực nghiên cứu “Nghiên cứu điều chế cao đặc chứa isoflavonoid từ sắn dây củ tròn” với mục tiêu chính: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng isoflavonoid cao đặc sắn dây củ tròn sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nghiên cứu điều chế cao đặc sắn dây củ tròn CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Sắn dây củ tròn 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại - Tên khoa học: Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyom Dham - Tên đồng nghĩa: Pueraria mirifica Airy Shaw & Suvat - Tên Việt Nam hay dùng: Sắn dây củ tròn, Sâm tố nữ - Hệ thống phân loại: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Thực vật có mạch (Tracheophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Đậu (Fabales) Bộ Đậu (Fabaceae/ Leguminosae) Họ Chi Pueraria Loài Pueraria candollei Thứ var mirifica 1.1.2 Phân bố Sâm tố nữ lần tìm thấy phía Bắc Thái Lan, Myanmar cách 800 năm Hiện nay, loài phân bố chủ yếu khu rừng rụng vùng Đông Bắc Tây Bắc Thái Lan, Myanma, Ấn Độ phân bố chủ yếu độ cao 300800m Tại Việt Nam, năm 2011, chuyến điều tra khảo sát nguồn tài nguyên thuốc Bản Cá – Sơn La, Cử nhân Ngô Văn Trại - Nguyên cán Viện Dược Liệu Trung Ương tình cờ phát thấy có mặt Sâm tố nữ khu vực sinh sống người dân tộc Thái trắng Trong suốt trình nghiên cứu, nhà khoa học Việt Nam phát giống Sâm phân bố tỉnh phía Tây Bắc Việt Nam Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang số huyện miền núi Thanh Hóa Nghệ An [2] 1.1.3 Đặc điểm thực vật Cây thân leo Lá kép có chét, hình trứng ngược Cụm hoa chùm tán, hoa phân bố không Hoa dài khoảng 1,5 cm, màu tím xanh, lưỡng tính, mẫu 5, tiền khai hoa cờ Nhị 10 xếp thành bó (9 nhị liền nhị rời) Nhụy: bầu trên, nỗn 1, đính nỗn mép Quả có vỏ nâu, có -5 hạt Củ có kích thước đa dạng, vỏ củ nâu, bên trắng, mặt cắt ngang có nan hoa xe đạp Cây thường hoa vào tháng 2- 3, kết vào tháng [21] [22] Đồng thời, hiệu suất tinh chế hiệu suất tinh chế tồn q trình phương pháp cao phương pháp Nguyên nhân loại tạp nhiệt, nhiệt độ làm bay cồn, dung môi bị giảm độ cồn khiến isoflavonoid bị kết tủa tạp Mặt khác, việc kết tinh lại cồn cao độ loại tạp carbohydrat, đường, polysacharid - tạp dịch chiết sắn, nên hiệu suất tinh chế phương pháp cao phương pháp Vậy, nghiên cứu lựa chọn quy trình điều chế cao đặc rễ củ SDCT sau: - Quá trình chiết xuất: ngâm nhiệt độ phòng EtOH 70o, tỷ lệ DM/DL lần = 10/1, ngâm lần, lần 48h - Q trình tinh chế: Dịch chiết thu hồi dung mơi đến 1/10 thể tích ban đầu , thêm Ethanol 96%, để lắng, lọc thu lấy dịch Dịch chiết cô đặc áp suất giảm nhiệt độ 50oC, sau đưa - vào tủ sấy nhiệt độ 60oC Quá trình chiết xuất thể hình 3.4 Hình 3.4 Quy trình điều chế cao đặc rễ củ SDCT 3.2.3 Kết điều chế cao đặc rễ củ SDCT theo phương pháp chọn Cao đặc điều chế theo quy trình trình bày mục 2.3.4 với thơng số quy trình chiết lựa chọn - Khối lượng dược liệu sử dụng: 100,03 g - Khối lượng cao đặc thu được: 9,22 g 26 Hiệu xuất trình điều chế cao đặc từ dược liệu khơ : HS (%) = 100 × Trong đó: 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 đặ𝑐 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑑ượ𝑐 𝑙𝑖ệ𝑢 ×(100−độ ẩ𝑚 𝑑ượ𝑐 𝑙𝑖ệ𝑢) = 10.0% Khối lượng (g) Độ ẩm (%) Độ ẩm dược liệu đem chiết 8,15% 3.2.3.1 Cảm quan, thể chất, màu sắc, mùi vị - Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế mục 3.2.3 - Tiến hành: cảm quan Hình 3.5 Hình ảnh cao đặc điều chế Nhận xét: Cao đặc chất mềm dẻo, đồng nhất, màu nâu đen, có mùi đặc trưng, vị đắng 3.2.3.2 Mất khối lượng làm khô - Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế mục 3.2.3 - Tiến hành: theo mục 2.3.4.3 Kết trình bày theo bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết khảo sát tiêu khối lượng làm khô Lần đo Khối lượng cao khô trước sấy (g) Khối lượng cao khô sau sấy (g) Độ ẩm (%) 0,5063 0,4245 16,18% 0,5174 0,4351 15,89% 0,5006 0,4204 16,01% Trung bình 16,03% 27 Nhận xét: mẫu cao có độ ẩm < 20%, đạt chất lượng theo DĐVN V tiêu khối lượng làm khô 3.2.3.3 Định tính SKLM - Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế mục 3.2.3 Tiến hành: theo mục 2.3.4.3 - Kết quả: Hình ảnh sắc ký đồ thể hình 3.5 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC cao đặc rễ SDCT (T) chất đối chiếu genistein (C) bước sóng 254 nm 366 nm Hình (A): Hệ dung mơi Chloroform: Methanol= 10:1 Hình (B): Hệ dung mơi Chloroform: Methanol= 20:1 Nhận xét: Trên hệ dung môi A, quan sát ánh sáng UV 254 nm, sắc ký đồ mẫu thử xuất vết tương đương với vết genistein chuẩn (Rf= 0,58) Vậy phản ứng dương tính, cao chiết sắn dây củ trịn có genistein Ở bước sóng UV 366 nm, Genistein khơng vết sắc ký đồ, nên, vết genistein bước sóng Trên hệ dung mơi B, quan sát ánh sáng UV 254 nm, sắc ký đồ mẫu thử xuất vết tương đương với vết genistein chuẩn (Rf= 0,29) Trên hệ dung môi này, genistein tách rõ với vệt phát quang UV 366 (Rf = 0,27) so với hệ A Vậy hệ B sử dụng để dịnh tính genistein dịch chiết rễ củ SDCT 3.2.3.4 Định lượng genistein cao chiết - Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế mục 3.2.3 - Tiến hành: theo mục 2.3.4.3 28 - Kết quả: trình bày theo bảng Bảng 3.8 Kết định lượng genistein cao đặc điều chế STT Khối lượng cao (g) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng (mg/g) 0,2549 259886 0,44 0,2569 263956 0,45 0,2511 255173 0,44 0,2534 253419 0,43 0,2558 261051 0,44 0,2518 263519 0,46 Trung bình 0,44 SD 0,008 RSD 1,91% Nhận xét: Hàm lượng genistein cao đặc định lượng trung bình 0,44 mg/g Chênh lệch lần định lượng không đáng kể Từ kết tính tổng lượng genistein chiết cao 0,44 x 9,22 x (100% - Độ ẩm) = 3,4 mg genistein Từ đó, tính hiệu suất chiết genistein tồn q trình 86.38% Hiệu suất thấp khơng đáng kể so với hiệu suất lý thuyết nghiên cứu (88,39 %) 3.3 Bàn luận 3.3.1 Về phương pháp định lượng genistein rễ củ SDCT Về dung môi chiết xuất: Sử dụng MeOH dung mơi hịa tan chọn lọc EtOH, hòa tan tốt isoflavonoid dược liệu đồng thời hạn chế tạp đường, tinh bột, tạp tan nước lẫn vào mẫu thử Về phương pháp chiết xuất: phương pháp chiết sóng siêu âm giúp giảm thời gian chiết, cho hiệu suất chiết cao, phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm Vậy nên, để đảm bảo thu sản phẩm với chất lượng tốt, hiệu suất chiết cao, nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết genistein MeOH với hỗ trợ sóng siêu âm Về phương pháp phân tích: lựa chọn phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để tiến hành nghiên cứu phương pháp phổ biến sử dụng để định lượng genistein, đồng thời phương pháp có độ nhạy cao, cho kết xác Sau q trình khảo sát, nghiên cứu lựa chọn hệ pha động Methanol : dung dịch acid phosphoric 0,1% để tiến hành định lượng điều kiện sắc ký lựa chọn sau: 29  Cột: C18 Inersustain GL Science (250  4,6 mm; m)  Pha động: MeOH : acid phosphoric 0,1% , tỷ lệ dung môi theo bảng sau: Thời gian (phút) Tỷ lệ H3PO4 0.1% Tỷ lệ MeOH 90 10 20 70 30 30 50 50 35 10 90 40 90 10 45 90 10  Tốc độ dịng: ml/phút  Dectector DAD với bước sóng 261 nm  Thể tích tiêm: 20 µl Q trình thẩm định phương pháp định lượng genistein rễ củ SDCT nghiên cứu tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ xác (độ lặp lại, độ xác trung gian), độ đạt giới hạn yêu cầu Điều cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn nghiên cứu phù hợp Tiến hành định lượng genistein rễ củ SDCT, kết thu sau: hàm lượng genistein rễ củ SDCT trồng Ba Vì 42,85 (µg/g) Hàm lượng cao hàm lượng genistein SDCT nội địa 11,9 – 18,4 (µg/g) [9] nghiên cứu khác Điều cho thấy tiềm khai thác isoflavonoids giống SDCT trồng Việt Nam không thua SDCT trồng nội địa Thái Lan 3.3.2 Về phương pháp chế tạo cao chiết Về dung môi chiết xuất: Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh isoflavonoids tan tốt cồn, hỗn hợp cồn nước nên nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết xuất để chế tạo cao EtOH 70o do: - EtOH 70o hòa tan tốt hoạt chất dược liệu - Giá thành rẻ MeOH hay EtOH tuyệt đối - Vẫn có khả hạn chế số tạp tan nhiều nước carbohydrat, số loại đường Về phương pháp chiết xuất: sử dụng phương pháp ngâm nhiệt độ thường với hiệu suất chiết trung bình 93,76 % Nghiên cứu lựa chọn phương pháp do: - Đây phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần dụng cụ phức tạp 30 - Tác dụng nhiệt làm giảm thời gian chiết, lại tăng khả hịa tan tạp chất, đồng thời gây biến tính tinh bột sắn dây củ tròn, gây cản trở cho trình loại tạp, tinh chế Về trình tinh chế: nghiên cứu việc loại tạp phương pháp kết tủa cồn cao độ (Hiệu suất tinh chế = 94,28%) hiệu phương pháp kết tủa nhiệt (Hiệu suất tinh chế = 83,24%) Nguyên nhân do: - Trong q trình kết tủa nhiệt, đun cách thủy gây tượng bay cồn, nên độ cồn dịch chiết giảm Các hoạt chất - bị tủa dung môi thay đổi độ cồn dẫn đến việc hoạt chất Việc tác động nhiệt không loại tạp dịch chiết carbohydrat, số loại đường Khi nâng quy mô lên, nghiên cứu điều chế cao đặc rễ củ SDCT ( độ ẩm = 16,03%) với hàm lượng genistein 0,44 mg/g với hiệu suất chiết tồn q trình 86,38% 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian làm thực nghiệm, đề tài hoàn thành mục tiêu đề với kết cụ thể sau: 4.1.1 Về xây dựng phương pháp định lượng genistein rễ củ SDCT sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Quy trình xử lý mẫu thử: Lấy khoảng 2g dược liệu khô, thêm 20 ml MeOH, chiết siêu âm nhiệt độ phòng 20p Lọc lấy dịch, bổ sung thêm 20 ml MeOH, tiếp tục chiết Sau chiết, gộp tất dịch chiết cô thu hồi dung môi đến cắn Cắn hịa tan xác 25 ml MeOH Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký khảo sát được:  Cột: C18 Inersustain GL Science (250  4,6 mm; m)  Pha động: MeOH : acid phosphoric 0,1% , tỷ lệ dung môi theo bảng sau: Thời gian (phút) Tỷ lệ H3PO4 0.1% Tỷ lệ MeOH 90 10 20 70 30 30 50 50 35 10 90 40 90 10 45 90 10  Tốc độ dòng: ml/phút  Dectector DAD với bước sóng 261 nm  Thể tích tiêm: 20 µl Với điều kiện sắc ký này, cho thời gian lưu genistein thời điểm 38.12 phút hàm lượng genistein rễ củ SDCT xác định 42,85 (µg/g) với RSD = 1,49% Thẩm định phương pháp chọn qua độ đặc hiệu, độ phù hợp hệ thống, độ xác, khoảng tuyến tính, độ cho thấy đạt theo quy định AOAC 4.1.2 Về quy trình điều chế cao đặc SDCT Cân xác khoảng 100 g dược liệu cho vào bình thủy tinh Thêm khoảng lít EtOH 70o, ngâm nhiệt độ phòng 48h Lọc lấy dịch chiết, tiếp tục thêm lít dung mơi lặp lại quy trình, gộp tất dịch thu dịch chiết SDCT Dịch chiết cô thu hồi dung môi đến 1/10 thể tích ban đầu, thêm 500 ml Ethanol 96%, để lắng , lọc qua phễu 32 Dịch chiết cô đặc áp suất giảm nhiệt độ 50oC, sau đưa vào tủ sấy nhiệt độ 60oC 4.1.3 Về khảo sát số tiêu chất lượng cao đặc rễ củ SDCT điều chế Cảm quan: Cao đặc chất mềm dẻo, đồng nhất, màu nâu đen, có mùi đặc trưng, vị đắng Độ ẩm: 16.03% Định tính genistein sắc ký lớp mỏng (TLC): Đã khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu thử, chất đối chiếu điều kiện sắc ký sau: - Chuẩn bị dung dịch thử: Lấy khoảng 0,1 g cao, thêm 10 ml MeOH để hòa tan, thu dịch chấm sắc ký - Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan genistein chuẩn MeOH để dung dịch có nồng độ khoảng 0.1 mg/ml - Pha động: CHCl3: MeOH = 20 : Định lượng genistein sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC): hàm lượng genistein cao đặc xác định 0,44 mg/g với hiệu suất chiết tồn q trình 86,38 % 4.2 Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất loại tạp để thu quy trình điều chế cao đặc rễ củ SDCT với hàm lượng isoflavonoid tối ưu - Nâng cấp quy mô lên pilot công nghiệp 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất y học, Hà Nội Cao Thị Hạnh ( 2022), Tổng quan thuốc sắn dây củ tròn (Pueraria mirifica), Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Tiếng Anh ACC Current Journal Review, (2002), Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women principal results from the women’s health initiative randomized controlled trial, 11(6), pp 38–39 Benson GK, Cowie AT, Hosking ZD, (1961), “Mammogenic activity of miroestrol”, J Endocrinol, 21, pp 401-409 CAIN, J C (1960), “Miroestrol: An Estrogen from the Plant Pueraria Mirifica.” Nature, pp.188, 774–777 Chandeying, V., Sangthawan, M (2007), “Efficacy comparison of Pueraria mirifica (PM) against conjugated equine estrogen (CEE) with/without medroxyprogesterone acetate (MPA) in the treatment of climacteric symptoms in perimenopausal women: phase III study”, J Med Assoc Thai, 90 (9), pp 17201726 Chearskul, S., Kooptiwut, S., Chatchawalvanit, et al (2004), “Morinda citrifolia has very weak estrogenic activity in vivo”, J Physiol Sci, 17, pp 22-29 Chen S.-B et al (2006), “High-performance thin-layer chromatographic fingerprints of isoflavonoids for distinguishing between Radix Puerariae Lobate and Radix Puerariae Thomsonii”, Journal of Chromatography A 1121 (1), pp 114-119 Cherdshewasart W et al (2007), “Major isoflavonoid contents of the 1-yearcultivated phytoestrogen-rich herb, Pueraria mirifica”, biotechnology, and biochemistry 71 (10), pp 2527-2533 Bioscience, 10 Cherdshewasart W et al (2008), “Correlation of antioxidant activity and major isoflavonoid contents of the phytoestrogen-rich Pueraria mirifica and Pueraria lobata tubers”, Phytomedicine 15 (1), pp 38-43 11 Cherdshewasart, W., Kitsamai, Y., and Malaivijitnond, S (2007), “Evaluation of the estrogenic activity of the wild Pueraria mirifica by vaginal cornification assay”, J Reprod Dev, 53(2), pp 385-93 12 Cherdshewasart, W., Subtang, S., & Dahlan, W (2007) “Major isoflavonoid contents of the phytoestrogen rich-herb Pueraria mirifica in comparison with Pueraria lobata”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(2), 428–434 13 Chivapat S et al (2012), “Toxicity study of Pueraria mirifica Airy Shaw et Suvatabandhu”, Bulletin of the Department of Medical Sciences 42 (3), pp 14 Fontanges, E., Fontana, A., and Delmas, P (2004), “Osteoporosis and breast cancer”, Joint Bone Spine, 71(2), pp 102-10 15 Gao, Y H and Yamaguchi, M (1999), “Suppressive effect of genistein on rat bone osteoclasts: apoptosis is induced through Ca2+ signaling”, Biol Pharm Bull, 22(8), pp 805-9 16 Horwitz William (2010), “Official methods of analysis of AOAC International” Volume I, agricultural chemicals, contaminants, drugs/edited by William Horwitz, Gaithersburg (Maryland): AOAC International, 1997 17 Ingham, J L., Tahara, S., & Dziedzic, S Z (1986) “A Chemical Investigation of Pueraria mirifica Roots”, Zeitschrift Für Naturforschung C, 41(4), 403–408 18 J E Compston, “Sex steroids and bones” Physio Rev, 81 (1), pp 419 -447 19 Jaroenporn S et al (2006), “Effects of Pueraria mirifica, an herb containing phytoestrogens, on reproductive organs and fertility of adult male mice”, Endocrine 30 (1), pp 93-101 20 Jones, HEH., Pope, G S (1960), “A study of the action of miroestrol and other oestrogens on the reproductive tract of the immature female mouse”, J Endocrinol, 20, pp 229–235 21 Kashemsanta M L et al (1952), “A new species of Pueraria (Leguminosae) from Thailand, yielding an oestrogenic principle”, Kew Bulletin, pp 549-552 22 Keung W M (2003), “Pueraria: the genus Pueraria”, CRC Press 23 Lissin, L W., Cooke, J P (2000), “Phytoestrogens and cardiovascular health”, J Am Coll Cardiol, 35(6), pp 1403-10 24 Malaivijitnond S (2012), “Medical applications of phytoestrogens from the Thai herb Pueraria mirifica”, Frontiers of medicine (1), pp 8-21 25 Manonai, J., Chittacharoen, A., Theppisai, U., & Theppisai, H (2007) “Effect of Pueraria mirifica on vaginal health” Menopause, 14(5), 919–924 26 Muangman, V., Cherdshewasart, W (2001), “Clinical trial of the phytoestrogenrich herb, Pueraria mirifica as a crude drug in the treatment of symptoms in menopausal women”, Siriraj Hosp Gaz, 53(5), pp 300-310 27 Ohta, H., et al (2002), “Bone resorption versus estrogen loss following oophorectomy and menopause”, Maturitas, 43(1), pp 27-33 28 Picherit, C., Dalle, M., Neliat, G., Lebecque and Davicco, P., Barlet, Mj., Coxam, V (2000), “Genistein and daidzein modulate in vitro rat uterine contractile activity”, J Steroid Biochem, 75, pp 201-208 29 PJ, Sulak (1997), “Endometrial cancer and hormone replacement therapy Appropriate use of progestins to oppose endogenous and exogenous estrogen”, Endocrinol Metab Clin North Am, 26 (2), pp 399–412 30 Satoshi Tahara , John L Ingham, Stanley Z Dziedzic (1987), “Structure Elucidation of Kwakhurin, a New Prenylated Isoflavone from Pueraria miriflca Roots” Zeitschrift Für Naturforschung C, 42c, 510—518 31 Sookvanichsilp, N., Soonthornchareonnon, N., and Boonleang, C (2008), “Estrogenic activity of the dichloromethane extract from Pueraria mirifica”, Fitoterapia, 79(7-8), pp 509-14 32 Suchinda Malaivijitnond (2012) “Medical applications of phytoestrogens from the Thai herb Pueraria mirifica” Front med,6 (1), pp 8-21 33 Sucontphunt, A., De-Eknamkul, W., et al (2011), “Protection of HT22 neuronal cells against glutamate toxicity mediated by the antioxidant activity of Pueraria candollei var mirifica extracts”, J Nat Med, 65(1), pp 1-8 34 Sugimoto, E., Yamaguchi, M (2000), “Stimulatory effect of daidzein in osteoblastic MC3T3-E1 cells”, Biochem Pharmacol, 59(5), pp 471-5 35 Tinwell, H., Soames, Ar., Foster, Jr., Ashby, J (2000), “Estradiol-type activity of coumestrol in mature and immature ovariectomized rat uterotrophic assay”, Environ Health Perspect, 108 (7), pp 631-634 36 Trisomboon, H., et al (2004), “Estrogenic effects of Pueraria mirifica on the menstrual cycle and hormone-related ovarian functions in cyclic female cynomolgus monkeys”, J Pharmacol Sci, 94(1), pp 51-9 37 Trisomboon, H., et al (2005), “Ovulation block by Pueraria mirifica: a study of its endocrinological effect in female monkeys”, Endocrine, 26(1), pp 33-9 38 Udomsuk L., Juengwatanatrakul T., et al (2012), “Bimodal action of miroestrol and deoxymiroestrol, phytoestrogens from Pueraria candollei var mirifica, on hepatic CYP2B9 and CYP1A2 expressions and antilipid peroxidation in mice” , Nutr Res, 32(1), pp 45-51 39 Urasopon, N., et al (2007), “Pueraria mirifica, a phytoestrogen-rich herb, prevents bone loss in orchidectomized rats”, Maturitas, 56(3), pp 322-31 40 Urasopon, N., et al (2008), “Preventive effects of Pueraria mirifica on bone loss in ovariectomized rats”, Maturitas, 59(2), pp 137-48 41 Wang, X., et al (2003), “Puerariae radix prevents bone loss in ovariectomized mice”, J Bone Miner Metab, 21(5), pp 268-75 42 Xu, H., et al (1998), “Estrogen reduces neuronal generation of Alzheimer betaamyloid peptides”, Nat Med, 4(4), pp 447-51 43 Yusakul G et al (2011), “Comparative analysis of the chemical constituents of two varieties of Pueraria candollei”, Fitoterapia 82 (2), pp 203-207 44 Cho J.-G et al (2014), “Flavonoids from Pueraria mirifica roots and quantitative analysis using HPLC”, Food Science and Biotechnology 23 (6), pp 1815-1820 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MẪU TIÊU BẢN PHỤ LỤC 2: GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN PHỤ LỤC 3: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC