Sau khi hòa tan dịch chiết etanol với dung dịch etanol 10% v/v, phần hòa tan của chiết xuất thô của thân cây đã kích thích sự tăng sinh của tế bào MCF-7 mà không có tác dụng ức chế tăng
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Sắn dây củ tròn
- Tên khoa học: Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyom Dham
- Tên Việt Nam hay dùng: Sắn dây củ tròn, Sâm tố nữ
- Theo Armen Takhtajan, 2009, cây SDCT được xác định:
Chi Pueraria gồm các loài cây thân leo, dây leo quấn, hiếm khi là cây bụi Hầu hết các loài đều có lông ngắn ở thân, mọc trên mặt đất hoặc neo trên các giá đỡ như cây bụi hay cây
Lá kép lông chim có 3 lá chét Lá kèm có thể có hoặc không có thùy cơ bản Hoa hầu như không có cuống hoa, có 1 lá bắc nằm thấp dưới đài hoa và đài hoa có 2 lá bắc con bên Đài hoa có 5 thùy, nhưng 2 lá đài trên cùng gần như hoàn toàn hàn liền Nhị hoa hàn liền thành ống 9 nhị, với nhị mười (thuộc tiền khai hoa cờ) hàn liền với ống, ở một vài loài nhị mười rời khi hoa nở Bầu hình trứng thon dài, thường có lông, thỉnh thoảng nhẵn, với vòi dạng sợi, tận cùng núm hình cầu với nhú ngắn
Quả loại đậu thường dẹt, nhẵn hoặc có lông, màu nâu nhạt đến đen, chứa ít hơn
20 hạt Hạt màu nâu hoặc đen như hạt đậu, dẹt hoặc thuôn Hạt nảy mầm trên mặt đất, mang 2 lá mầm đơn giản và đối xứng nhau Lá tiếp theo là lá thứ ba mọc xen kẽ [9]
Theo “Pueraria: the genus Pueraria”, chi Pueraria và các loài của nó phân bố khắp Trung Quốc, Nhật Bản, Nam - Đông Nam Á và một phần của châu Đại Dương Chi Pueraria có 15 loài, ba loài trong đó có phân loài: Pueraria candollei Benth có hai thứ, Pueraria montana (Lour.) Merr và Pueraria phaseoloides (Roxb.) Benth có ba thứ mỗi loài [8]
Theo “Thực vật chí Trung Quốc” có khoảng 20 loài thuộc chi Pueraria phân bố ở vùng nhiệt đới và châu Á, có 10 loài phân bố tại Trung Quốc trong đó có 3 loài đặc hữu [17]
Loài Pueraria candollei var mirifica
Cây dây leo bằng thân quấn Rễ phình thành củ, vỏ màu nâu nhạt, mặt cắt nngang màu trắng Lá kép có 3 lá chét, có thể dài đến 60 cm, mặt trên lá có một lớp lông tơ, màu xanh đậm, mặt dưới có lông ngắn màu xám, gân lá hình lông chim Lá chét giữa hình thoi, đầu nhọn nguyên, hai lá chét bên mọc đối, hình trứng ngược, dài 20 cm, mép lá nguyên, lệch gốc, cuống lá chét bên có lông mịn màu trắng, dài khoảng 7 mm Lá kèm của lá chét dạng sợi; hai lá chét bên mỗi lá một lá kèm, lá chét ở giữa có hai lá kèm
Cụm hoa chùm tán, hoa dài khoảng 1,5cm, màu tím xanh, lưỡng tính, mẫu 5, tiền khai hoa cờ Cuống hoa màu nâu, có lông mịn phủ phía ngoài, dài khoảng 1-3 mm Lá bắc cụm hoa mảnh, kích thước 1x4 mm, mặt ngoài mang nhiều lông dài, mặt trong nhẵn Mỗi tán mang ba hoa, có một lá bắc hình khiên Hoa màu xanh tím, dài khoảng 10 mm, không đều, lưỡng tính Hoa có hai lá bắc con, hình trứng, dài 1 mm, mặt trong nhẵn, màu trắng, mặt ngoài nhiều lông, màu vàng nhạt, kích thước 1 x 1,5mm, dễ rụng Đài hoa dài khoảng 5 mm, hàn liền giống hình chuông, màu tím nâu, có lông mịn bao phủ phía ngoài, chia làm năm thùy, không đều, ba thùy nhọn ở phía trước, hai thùy sau dính với nhau Nhị 10 xếp thành 2 bó (9 nhị liền và 1 nhị rời) Nhụy có bầu trên, lá noãn 1, đính noãn mép
Quả loại đậu, dẹt, dài 5-7cm, rộng 6-7 mm, khi non màu xanh, già màu nâu, có 3-5 hạt
Củ có kích thước đa dạng, vỏ củ nâu, bên trong trắng, mặt cắt ngang có hình như nan hoa xe đạp [4]
Cây thường ra hoa vào tháng 2- 3, kết quả vào tháng 4 [8]
1.2.2 Phân bố và bộ phận dùng
SDCT phân bố trong các khu rừng lá rụng ở độ cao 300–800m phía bắc, tây và đông bắc Thái Lan, có thể cả ở Myanmar [8]
Theo “Từ điển thực vật thông dụng” chi Pueraria gồm tới 20 loài phân bố ở Đông
Nam Á và châu Đại Dương [2]
Tại Việt Nam, SDCT phân bố ở các tỉnh phía Tây Bắc Việt Nam như Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Ba Vì và một số huyện miền núi của Thanh Hóa và Nghệ An [4]
Bộ phận dùng chủ yếu là rễ củ [10].
Tổng quan về thân SDCT
Cho đến hiện nay, đã phát hiện 5 isoflavonoid ( Kwakhurin, genistein, daidzein, daidzin, puerarin) và 3 chromenen có trong thân SDCT [21] Tất cả các phytoestrogen trên đều có cấu trúc tương tự 17β – estradiol (Hình 1.1) [12]
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của 17β – estradiol
Hình 1.2 Một số hợp chất isoflavonoid được phân lập từ thân SDCT
Bảng 1.1 Bảng hàm lượng isoflavonoid có trong vỏ thân, thân không vỏ và toàn bộ thân của Pueraria candollei var mirifica
Isoflavonoid Vỏ thân (mg/g) Thân không vỏ
Toàn bộ thân (mg/g) Kwakhurin 0.1 ± 0.00 Không xác định 0.08 ± 0.00
Daidzin Không xác định 0.12 ± 0.01 0.06 ± 0.00 Puerarin Không xác định 0.27 ± 0.01 0.14 ± 0.00 Hàm lượng isoflavonoid tổng số cao nhất được tìm thấy ở thân không vỏ, thân và cuối cùng là vỏ thân Vỏ thân không phát hiện thấy daidzein và puerarin Kwakhurin không được xác định trong thân không có vỏ [21]
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của chromen trong thân SDCT
Bảng 1.1 Hàm lượng Chromen trong vỏ thân, thân không vỏ và toàn bộ thân của
Chromen Vỏ thõn (àg/g) Thõn khụng vỏ
Toàn bộ thân (àg/g) Isomiroestrol 97.13 ± 7.28 10.44 ± 0.99 23,93 ± 0.74 Deoxymiroestrol 20.89 ± 2.43 5.35 ± 0.38 15.05 ± 3.71 Miroestrol 94.71 ± 6.48 3.60 ± 0.11 36.93 ± 0.46 Hàm lượng chromen được tìm thấy cao nhất trong vỏ thân, toàn bộ thân và cuối cùng là thân không vỏ [21].
Tác dụng sinh học
Năm 2020, Witsarut Kraithong và cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt động estrogen của thân và rễ củ SDCT đối với sự tăng sinh tế bào MCF – 7 Vỏ thân (chiết xuất thô 10 μg/mL) chứa hàm lượng chromenes cao và lượng isoflavonoid thấp, kích thích tăng trưởng tế bào MCF-7 (tác dụng tăng sinh tương đối [RPE] 127,25% ± 4,43% so với estradiol [10 −10 M]) Sau khi hòa tan dịch chiết etanol với dung dịch etanol 10% (v/v), phần hòa tan của chiết xuất thô của thân cây đã kích thích sự tăng sinh của tế bào MCF-7 mà không có tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào ở nồng độ cao (100 μg/mL) như đã quan sát thấy trong phần không tan của dịch chiết Nghiên cứu cho rằng phần hòa tan của dịch chiết thô có thể ít độc hơn so với dịch chiết thô etanolic và các thành phần không phân cực của dịch chiết [21].
Công dụng trong y học cổ truyền và dân gian
Pueraria candollei var mirifica là một loại cây nổi tiếng trong y học cổ truyền
Thái Lan Rễ củ được sử dụng làm trẻ hóa ở phụ nữ tuổi mãn kinh gần một trăm năm Thân và lá còn sót lại sau khi thu hoạch củ dưới lòng đất cũng chứa phytoestrogen và có đặc tính estrogen Lá SDCT đã được báo cáo là có tích tụ isoflavonoid, tuy nhiên hàm lượng phytoestrogen ở phần lá thấp hơn rễ củ khoảng hai lần [7] Thân SDCT hiện chưa được nghiên cứu rộng rãi về phytoestrogen và hoạt động estrogen Mặc khác, thân cây Pueraria lobata cũng chứa phytoestrogen, được sử dụng rộng rãi trong các loại
6 thuốc truyền thống của Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc [11] Vì vậy, thân cây SDCT sẽ là nguồn cung cấp phytoestrogen thay thế đầy hứa hẹn.
Chiết xuất SDCT
Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất khỏi phần không tan trong dược liệu Sản phẩm của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết [3] Đối với dược liệu SDCT, phương pháp chiết xuất chủ yếu tập trung vào việc chiết xuất cao toàn phần, sản phẩm thu được đa dạng về thành phần hóa học Hiện nay nhiều phương pháp và kỹ thuật chiết khác nhau đã được nghiên cứu và áp dụng trong phòng thí nghiệm và thực tế sản xuất công nghiệp Hiệu quả và chất lượng sản phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó phương pháp chiết và dung môi có tác động nhiều nhất
Có nhiều phương pháp khác nhau để chiết xuất SDCT đã đươc thực hiện như chiết siêu âm [6], ngâm lạnh [13]…
Bảng 1.2 Bảng tổng hợp các phương pháp chiết xuất SDCT
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Ứng dụng
Ngâm nóng Đơn giản nhất
Thích hợp nhiều loại dược liệu
Các điều kiện ngâm đồng nhất [16]
Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của chất [16]
Phòng thí nghiệm và công nghiệp
Chiết hồi lưu Đơn giản, dễ thao tác
Có thể tái sử dụng dung môi thu hồi [3]
Tốn nhiều dung môi, năng lượng
[3] Phòng thí nghiệm và công nghiệp
Cải thiện độ tan của dược liệu
Rút ngắn thời gian chiết [3]
Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của chất [3]
Phòng thí nghiệm và công nghiệp
Dễ chiết kiệt, tiết kiệm dung môi, dịch chiết đặc
Rút ngắn thời gian chiết [3]
Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của dược chất [3] Phòng thí nghiệm
7 Chiết dưới áp suất cao
Có thể dung dung môi truyền thống
Rút ngắn thời gian chiết [3]
Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của chất [3]
Các phương pháp chiết hiện đại như chiết dưới áp suất cao, chiết bằng dung môi siêu tới hạn cho hiệu suất chiết cao với thời gian chiết xuất ngắn và lượng dung môi nhỏ hơn Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị, điều kiện chiết xuất khó khăn hơn dẫn đến khó ứng dụng trong quy mô công nghiệp
Dung môi là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình chiết xuất Có nhiều dung môi khác nhau đã được sử dụng để chiết xuất SDCT trong các nghiên cứu như: EtOH, nước, ethyl acetat, MeOH [19], [13], [5]
Bảng 1.3.Bảng tổng hợp các dung môi chiết xuất SDCT
Dung môi Ưu điểm Nhược điểm
EtOH Hòa tan nhiều loại hoạt chất
Dung môi xanh, an toàn
Tốn chi phí hơn so với dung môi là nước
MeOH Khả năng hòa tan tốt Độc, hạn chế dùng
Nước Dung môi phổ biến nhất, có sẵn, rẻ, không độc
Hòa tan không chọn lọc Hiệu suất thấp
Ethyl acetat Ít độc, mùi dễ chịu Chủ yếu chiết xuất hợp chất ít phân cực.
Tổng quan về cao đặc
Cao thuốc là chế phẩm được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác [1]
Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20% [1]
1.7.2 Phương pháp điều chế cao đặc
Quá trình điều chế cao đặc thường có 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp Tùy theo bản chất của dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mô sản xuất và điều kiện trang thiết bị, có thể sử dụng phương
8 pháp chiết xuất: Ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác [1]
- Giai đoạn 2: Dịch chiết được cô đặc đến khi dung môi dùng để chiết xuất còn lại không quá 20% được cao đặc Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 0 C Nếu không có điều kiện cô đặc và sấy ở dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80 0 C Trường hợp muốn thu được cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp bằng các phương pháp thích hợp tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất [1]
1.7.3 Yêu cầu chất lượng với cao đặc
- Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng nếu có trong DĐVN V [1]
- Mất khối lượng do làm khô: nếu không có chỉ dẫn khác, cao đặc không quá 20% [1]
- Kim loại nặng: nếu không có chỉ dẫn khác, không được quá 20 phần triệu [1]
- Dung môi tồn dư: nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sừ dụng phải đáp ứng yêu cẩu qui định trong Phụ lục 10.14 Xác định dung môi tồn dư – DĐVN V [1]
- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 12.17
Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật – DĐVN V [1]
- Giới hạn nhiễm khuẩn: đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN V [1].
Các phương pháp xác định daidzein
1.8.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (TLC)
Bảng 1.4 Một số hệ dung môi pha động sử dụng trong định tính daidzein bằng phương pháp TLC
STT Hệ dung môi TLTK
2 n-hexan – ethyl acetat – acid acetic
1.8.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Vỏ rễ, rễ không vỏ, vỏ thân, thân không vỏ, toàn bộ thân được chiết xuất và hòa tan lại với 1 mL EtOH thu được các dung dịch thử Các dung dịch này được đưa vào phân tích hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện sắc ký [21]:
- Cột thớch thước (25 cm ì 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh C (5 àm)
- Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 280 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Pha động: Dung dịch acetonitrile – acid acetic 1,5% triển khai theo chương trình trong bảng 1.6 dưới đây:
Bảng 1.5 Hệ dung môi pha động sử dụng trong định lượng daidzein bằng phương pháp HPLC Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid acetic 1,5%
1.8.3 Một số phương pháp khác
Một số phương pháp được sử dụng định lượng daidzein như sắc kí khí…[14]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
Thân SDCT được thu hái tại xã Tản Lĩnh, huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội vào tháng 8/2023 Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyom Dham
Người giám định: ThS Nghiêm Đức Trọng Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu Bản: HNIP/18696/23
Hình 2.1 Hình ảnh mẫu vật
Xử lý mẫu: Thân cắt nhỏ thành các miếng có chiều dài 2 cm, sấy khô ở 60 o C, bảo quản trong túi nilon kín nơi khô ráo
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzeu, Nhật Bản): Buồng cấp dung môi LC-20AD, buồng ổn nhiệt cho cột CTO-10AS, cột sắc kí pha đảo C18, đầu dò UV-Vis SPD – M20A
- Hệ thống lọc chõn khụng, màng lọc 0,45 àm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc syringe 0,45 àm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)
- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg
- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ)
- Tủ sấy Memmert (Đức) - Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức)
- Bể điều nhiệt Memmert (Đức) WNB14
- Máy cô quay chân không IKA ® RV 8 (IKA, Đức)
- Máy siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc)
- Bếp hồng ngoại Sunhouse SHD 6011 điều chỉnh được công suất
- Tủ hút phòng thí nghiệm Fume hood
- Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại, micro pipet và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác cần cho phân tích
2.1.3 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn
- Chất chuẩn đối chiếu: Daidzein (hãng Macklin, cas: 486-66-8, độ tinh khiết 99,67%).
- Các dung môi: MeOH, toluen, aceton, đạt tiêu chuẩn phân tích Các dung môi dùng cho HPLC, TLC được mua của hãng Merck
- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 của hãng Merck.
Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng daidzein trong cao đặc thân SDCT bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất tới hàm lượng daidzein trong cao đặc thân SDCT
- Nội dung 3: Điều chế cao đặc thân SDCT giàu daidzein theo các thông số quy trình đã khảo sát
- Nội dung 4: Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc thân SDCT điều chế được.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp định lượng daidzein trong thân SDCT
2.3.1.1 Chiết xuất và điều chế cao đặc thân SDCT
Cân khoảng 20 g bột thô thân SDCT vào bình nón 500ml, thêm 160 ml EtOH 70%, ngâm ấm 90 phút Dịch chiết lần 1 lọc qua bông Thêm 160 ml EtOH 70% vào bã dược liệu ngâm ấm lần 2 trong 90 phút Dịch chiết thu được để lắng, gạn và lọc qua bông Gộp dịch chiết, lọc qua phễu lọc buchner, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 50 - 60°C đến thể chất lỏng sánh, sau đó chuyển vào tủ sấy ở 60°C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%)
Hàm lượng daidzein trong cao được tính theo công thức:
X: hàm lượng daidzein trong cao (mg/g)
S: diện tích pic daidzein trong sắc ký đồ (mAU.s) b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ daidzein và diện tích pic
12 V: thể tích dung dịch thử (mL) (V = 10 mL) a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ daidzein và diện tích pic m: khối lượng cao (g)
2.3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: Cột C18 Inertsustain GL Sciences (250 x 4,6 mm; 5 àm)
- Chọn pha động: Khảo sát các hệ dung môi và lựa chọn hệ phù hợp
- Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV – Vis của daidzein để xác định cực đại hấp thụ
- Chọn thể tớch tiờm: 15 àL
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1,0000 g cao đặc SDCT vào cốc có mỏ 50ml Thêm 7 ml MeOH, siêu âm 20 phút Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 àm thu được dung dịch thử
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1mg chuẩn daidzein hòa tan trong vừa đủ
10 ml MeOH thu được dung dịch chuẩn gốc S
2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng
Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên [22]
2.3.1.3.1 Tính phù hợp Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý
Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và dung dịch thử đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích, bao gồm giá trị về thời gian lưu, diện tích pic tương ứng và số đĩa lý thuyết
Yêu cầu: Hệ thống được coi là thích hợp nếu RSD ≤ 2,0% với cả thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết
Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác)
13 Tiến hành: Chạy sắc ký lần lượt với các mẫu: mẫu trắng (dung môi pha mẫu), dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn So sánh các sắc ký đồ thu được
- Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn: Pic của chất phân tích cần phân tách hoàn toàn khỏi các pic khác và có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
- Sắc ký đồ của mẫu trắng: Không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
- Hệ số chồng phổ UV – Vis của pic thu được trong sắc ký đồ của mẫu thử so với pic tương ứng thu được trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn phải đạt từ 99,0% trở lên
2.3.1.3.3 Độ tuyến tính Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Kết quả được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số xác định R 2
Tiến hành: Pha một dãy dung dịch chuẩn daidzein ở các nồng độ thích hợp Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện được chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ daidzein trong các dung dịch chuẩn
2.3.1.3.4 Độ chính xác Độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích
Tiến hành: Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập theo quy trình phân tích Tính toán giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng daidzein của 6 mẫu
2.3.1.3.5 Độ đúng Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực
Tiến hành: Thêm một lượng đã biết chất chuẩn tương ứng với 25%, 50% và 75% vào mẫu thử ở mức 50% để thu được dung dịch với các nồng độ daidzein bằng 75%, 100%, 125% so với nồng độ daidzein trong mẫu thử Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và chạy sắc ký theo điều kiện được chọn, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần Xác định tỷ lệ thu hồi (%) so với nồng độ ban đầu
Yêu cầu: Kết quả độ thu hồi phải đạt theo hướng dẫn của AOAC
2.3.2 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất daidzein từ thân SDCT
2.3.2.1 Quy trình xử lý mẫu và chiết xuất
Xử lý dược liệu: Thân cắt nhỏ thành các miếng có chiều dài 2 cm, sấy khô ở
60 o C, bảo quản trong túi nilon kín nơi khô ráo
Chiết xuất: Dược liệu được xay nhỏ, rõy qua rõy 500 àm Cõn chớnh xỏc khoảng 20 g bột dược liệu phân tán vào bình nón nút mài khô, thêm chính xác 160 ml dung môi, dùng đũa thủy tinh trộn đều để dược liệu thấm đều dung môi và ngâm trương nở trong thời gian 10 phút Tiến hành chiết ấm trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Dịch chiết lần 1 lọc qua bông Thêm 160 ml dung môi vào bã dược liệu ngâm ấm lần 2 trong khoảng thời gian nhất định Dịch chiết thu được để lắng, gạn và lọc qua bông Gộp dịch chiết, lọc qua phễu lọc buchner, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 50 - 60°C đến thể chất lỏng sánh, sau đó chuyển vào tủ sấy ở 60°C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%)
Lọc nóng qua bông thu được dịch chiết
2.3.2.2 Phương pháp định lượng daidzein trong cao thân SDCT
Xác định hàm lượng daidzein trong cao thân SDCT bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1,0000 g cao đặc SDCT vào cốc có mỏ 50ml Thêm 7 ml MeOH, siêu âm 20 phút Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 àm thu được dung dịch thử Điều kiện sắc ký: như phương pháp đã được thẩm định ở mục 2.3.1.3
2.3.2.3 Các yếu tố khảo sát và thông số đánh giá
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả điều chế cao đặc giàu daidzein theo các thông số đã lựa chọn
Cao đặc được điều chế theo quy trình trình bày ở mục 2.3.3.1 với các thông số quy trình được lựa chọn trên
Bảng 3.5 Kết quả điều chế cao đặc mẫu dược liệu
Khối lượng cao thu được (g)
Hiệu suất quá trình điều chế cao
Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc điều chế được
Hình 3.8 Hình ảnh cao đặc điều chế được
Nhận xét: Mẫu cao là khối đặc quánh đồng nhất, màu nâu sẫm, có mùi đặc trưng, vị đắng
3.4.2 Mất khối lượng do làm khô
- Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế ở mục 3.3
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô
Khối lượng cao trước khi sấy (g)
Khối lượng cao sau khi sấy (g) Độ ẩm (%)
Nhận xét: mẫu cao có độ ẩm < 20%, đạt chất lượng theo DĐVN V về chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô
3.4.3 Định tính bằng sắc kí lớp mỏng
- Mẫu nghiên cứu: 2 mẫu cao đặc điều chế ở mục 3.3
Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC của chất đối chiếu daidzein (C) và cao đặc thân SDCT
Nhận xét: Quan sát ở ánh sáng UV 254 nm đều cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện vết tương đương với vết daidzein chuẩn Chất daidzein có Rf ~ 0,54, tách hoàn toàn ra khỏi các vết còn lại trên sắc ký đồ Sắc ký đồ TLC được biểu hiện trong Hình 3.9 cho thấy hệ dung môi này có thể sử dụng để định tính cho cao đặc SDCT với chất đối chiếu daidzein
3.4.4 Định lượng daidzein trong cao
- Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế ở mục 3.3
Bảng 3.7 Kết quả định lượng daidzein trong cao đặc điều chế được
Hàm lượng daidzein trong cao đặc (mg/g)
Hàm lượng lượng daidzein trong cao đặc định lượng được là 0,543 mg/g
3.4.5 Định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần
Kết quả đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn được thể hiện ở bảng 3.8 và 3.9
Bảng 3.8 Kết quả đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn acid gallic Nồng độ dung dịch chuõ̉n (àg/mL) 10 20 30 40 50 60 70 Độ hấp thụ quang A 0,136 0,270 0,404 0,512 0,620 0,731 0,836
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ acid gallic chuẩn và độ hấp thụ quang A
Bảng 3.9 Kết quả định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu cao thử Khối lượng cao đem thử (g) Độ hấp thụ quang
Hàm lượng polyphenol toàn phần trong cao (mg/g)
Bàn luận
3.5.1 Về phương pháp định lượng daidzein trong cao thân SDCT
Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về xác định hoạt chất chính trong thân SDCT, đồng thời cũng chưa có nghiên cứu về phương pháp định lượng riêng biệt các hoạt chất trong thân SDCT
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu định lượng daidzein do đây là phương pháp phổ biến sử dụng trong định lượng các hợp chất thiên nhiên, có độ nhạy cao và kết quả chính xác y = 0.0116x + 0.0387 R² = 0.9975
Nồng độ dung dịch chuẩn (àg/mL)
29 Tham khảo các tài liệu [11], tiến hành khảo sát và kết quả điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:
- Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 àm)
- Tốc độ dòng: 1,2 mL/ phút
- Detector DAD với bước sóng 249 nm
- Thể tớch tiờm mẫu: 15 àL
Quá trình thẩm định phương pháp định lượng trong cao thân SDCT về tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng đều đạt giới hạn yêu cầu Điều này cho thấy các điều kiện sắc ký được lựa chọn là phù hợp
3.5.2 Về khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất tới hàm lượng daidzein trong dịch chiết thân SDCT
Phương pháp chiết xuất sử dụng là ngâm ấm, cách tiến hành đơn giản với dung môi là hỗn hợp EtOH và nước cất, đều là những dung môi thân thiện với môi trường
Vì vậy có thể ứng dụng trong sản xuất công nghiệp để đạt hiệu quả chiết xuất tối đa với dược liệu thân SDCT
Quy trình chiết xuất hoạt chất từ dược liệu chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố: nguyên liệu sử dụng, dung môi chiết xuất, kỹ thuật, phương tiện thực hiện quá trình chiết xuất Ở nghiên cứu này, chúng tôi chỉ khảo sát các yếu tố về thời gian chiết, nhiệt độ chiết, nồng độ EtOH:
- Dung môi chiết xuất: Khảo sát dung môi EtOH – nước ở các mức nồng độ EtOH là 30%, 50%, 70%, 90% Kết quả khảo sát cho thấy dung môi EtOH 70% cho hàm lượng daidzein chiết được là cao nhất
- Nhiệt độ chiết xuất: Tăng nhiệt độ chiết xuất có tác dụng làm giảm độ nhớt và sức căng bề mặt, tăng tính thấm dung môi vào tế bào dược liệu, đồng thời tăng độ tan, tốc độ khuếch tán hoạt chất từ dược liệu ra môi trường và tăng khuyếch tán đối lưu, giúp rút ngắn thời gian chiết và tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên, nhiệt độ cao có thể gây nguy hiểm khi chiết xuất bằng EtOH nếu thiết bị không đảm bảo độ an toàn Vì vậy, đề tài giới hạn cận trên của yếu tố nhiệt độ là 80 o C Kết quả khảo sát cho thấy chiết xuất ở 80 o C cho hàm lượng daidzein chiết được là cao nhất
- Thời gian chiết xuất: Thông thường, hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu ra môi trường Khi đạt cân bằng chiết (hàm lượng hoạt chất trong dược liệu cân bằng với môi trường), quá trình khuếch tán sẽ dừng lại Lúc này, hiệu suất chiết sẽ cao nhất Tuy nhiên, nếu thời gian chiết quá lâu làm
30 tăng tỉ lệ tạp chất, tăng nguy cơ phân hủy hoạt chất Kết quả cho thấy ở 150 phút hàm lượng daidzein chiết được là cao nhất