ousara sichaleune nghiên cứu điều chế cao đặc chứa isoflavonoid từ thân sắn dây củ tròn

Sau khi hòa tan dịch chiết etanol với dung dịch etanol 10% v/v, phần hòa tan của chiết xuất thô của thân cây đã kích thích sự tăng sinh của tế bào MCF-7 mà không có tác dụng ức chế tăng

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn và kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn đến TS Phạm Lê Minh - Bộ

môn Hóa phân tích và độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Đại học Dược Hà Nội – người đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em, giúp em hoàn thành khóa luận này Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu và các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi với nhiều kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học tại đây

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Thái Hà Văn - Bộ môn Dược học cổ

truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, sẵn sàng giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khan mà em gặp phải Bên cạnh đó, em không thể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp nếu không có sự giúp đỡ nhiệt tình từ các bạn trong nhóm nghiên cứu của Th.S Phạm Thái Hà Văn Cảm ơn các bạn vì đã cùng đồng hành, động viên, trao đổi kiến thức, giúp đỡ mình trong suốt quá trình nghiên cứu Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ em trong suốt thời gian qua

Do kiến thức bản thân còn giới hạn nên luận văn không tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý, chỉnh sửa của quý thầy cô, bạn bè Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Ousara SICHLEUNE

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Sắn dây củ tròn 2

1.2 Loài Pueraria candollei var mirifica 3

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 10

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu 11

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng daidzein trong thân SDCT 19

3.2 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 23

3.3 Kết quả điều chế cao đặc giàu daidzein theo các thông số đã lựa chọn 26

3.4 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc điều chế được 26

3.5 Bàn luận 28

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Kiến nghị 31

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính

thống (Association of Official Analytical Chemists)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High

performance liquid chromatography)

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer

tt/tt Thể tích/thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng hàm lượng isoflavonoid có trong vỏ thân, thân không vỏ và toàn bộ

thân của Pueraria candollei var mirifica 4

Bảng 1.2 Hàm lượng Chromen trong vỏ thân, thân không vỏ và toàn bộ thân của Pueraria candollei var mirifica 5

Bảng 1.3 Bảng tổng hợp các phương pháp chiết xuất SDCT 6

Bảng 1.4 Bảng tổng hợp các dung môi chiết xuất SDCT 7

Bảng 1.5 Một số hệ dung môi pha động sử dụng trong định tính daidzein bằng phương pháp TLC 8

Bảng 1.6 Hệ dung môi pha động sử dụng trong định lượng daidzein bằng phương pháp HPLC 9

Bảng 2.1 Cách pha dãy dung dịch chuẩn acid gallic 18

Bảng 3.1 Kết quả tính phù hợp hệ thống của phương pháp định lượng 21

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 21

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng 22

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng 23

Bảng 3.5 Kết quả điều chế cao đặc mẫu dược liệu 26

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô 26

Bảng 3.7 Kết quả định lượng daidzein trong cao đặc điều chế được 27

Bảng 3.8 Kết quả đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn acid gallic 28

Bảng 3.9 Kết quả định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu cao thử 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của 17β – estradiol 4

Hình 1.2 Một số hợp chất isoflavonoid được phân lập từ thân SDCT 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của chromen trong thân SDCT 5

Hình 2.1 Hình ảnh mẫu vật 10

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình điều chế cao đặc thân SDCT 16

Hình 3.1 Phổ hấp thụ phân tử UV – Vis của daidzein trong khoảng 200 – 400 nm 19

Hình 3.2 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu ghi ở bước sóng 249 nm 20

Hình 3.3 Chồng phổ UV – Vis của pic chất chuẩn daidzein và pic tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu thử 20

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và Spic của daidzein 22

Hình 3.5 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết xuất 24

Hình 3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất 24

Hình 3.7 Kết quả khảo sát nồng độ EtOH (tt/tt) 25

Hình 3.8 Hình ảnh cao đặc điều chế được 26

Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC của chất đối chiếu daidzein (C) và cao đặc thân SDCT (T) 27 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ acid gallic chuẩn và độ hấp thụ quang A 28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Pueraria candollei var mirifica là một loại cây nổi tiếng trong y học cổ truyền

Thái Lan [8] Ngày nay, các nguyên cứu cho thấy trong cây có chứa nhiều loại phytoestrogen có tác dụng hướng estrogen mạnh như isoflavonoid, chromen, coumestan, và đặc biệt là miroestron, đồng thời cũng có các báo cáo về thử nghiệm lâm sàng, tiền lâm sàng chứng minh tác dụng cải thiện triệu chứng mãn kinh ở phụ nữ [18]

Rễ củ được sử dụng làm trẻ hóa ở tuổi mãn kinh gần một tram năm trước Thân và lá còn sót lại sau khi thu hoạch củ dưới lòng đất cũng chứa phytoestrogen và có đặc tính estrogen Lá SDCT đã được báo cáo là có tích tụ isoflavonoid, tuy nhiên hàm lượng phytoestrogen ở phần lá thấp hơn rễ củ khoảng hai lần [7] Thân SDCT hiện chưa được nghiên cứu rộng rãi về phytoestrogen và hoạt động estrogen Mặc khác, thân cây

Pueraria lobata cũng chứa phytoestrogen, được sử dụng rộng rãi trong các loại thuốc

truyền thống của Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc [11] Vì vậy, thân cây SDCT sẽ là nguồn cung cấp phytoestrogen thay thế đầy hứa hẹn

Từ lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu điều chế cao đặc chứa isoflavonoid từ thân sắn dây củ tròn” được đề xuất nghiên cứu với 4 mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng daidzein trong cao đặc thân SDCT bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất tới hàm lượng daidzein trong cao đặc thân SDCT

3 Điều chế cao đặc thân SDCT giàu daidzein theo các thông số quy trình đã khảo sát

4 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc thân SDCT điều chế được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Sắn dây củ tròn

1.1.1 Chi Pueraria

1.1.1.1 Vị trí phân loại

- Tên khoa học: Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyom

Dham - Tên Việt Nam hay dùng: Sắn dây củ tròn, Sâm tố nữ - Theo Armen Takhtajan, 2009, cây SDCT được xác định:

Chi Pueraria gồm các loài cây thân leo, dây leo quấn, hiếm khi là cây bụi Hầu

hết các loài đều có lông ngắn ở thân, mọc trên mặt đất hoặc neo trên các giá đỡ như cây bụi hay cây

Lá kép lông chim có 3 lá chét Lá kèm có thể có hoặc không có thùy cơ bản Hoa hầu như không có cuống hoa, có 1 lá bắc nằm thấp dưới đài hoa và đài hoa có 2 lá bắc con bên Đài hoa có 5 thùy, nhưng 2 lá đài trên cùng gần như hoàn toàn hàn liền Nhị hoa hàn liền thành ống 9 nhị, với nhị mười (thuộc tiền khai hoa cờ) hàn liền với ống, ở một vài loài nhị mười rời khi hoa nở Bầu hình trứng thon dài, thường có lông, thỉnh thoảng nhẵn, với vòi dạng sợi, tận cùng núm hình cầu với nhú ngắn

Quả loại đậu thường dẹt, nhẵn hoặc có lông, màu nâu nhạt đến đen, chứa ít hơn 20 hạt Hạt màu nâu hoặc đen như hạt đậu, dẹt hoặc thuôn Hạt nảy mầm trên mặt đất, mang 2 lá mầm đơn giản và đối xứng nhau Lá tiếp theo là lá thứ ba mọc xen kẽ [9]

1.1.1.3 Phân bố chi Pueraria

Theo “Pueraria: the genus Pueraria”, chi Pueraria và các loài của nó phân bố

khắp Trung Quốc, Nhật Bản, Nam - Đông Nam Á và một phần của châu Đại Dương

Chi Pueraria có 15 loài, ba loài trong đó có phân loài: Pueraria candollei Benth có hai thứ, Pueraria montana (Lour.) Merr và Pueraria phaseoloides (Roxb.) Benth có ba

thứ mỗi loài [8]

Theo “Thực vật chí Trung Quốc” có khoảng 20 loài thuộc chi Pueraria phân bố

ở vùng nhiệt đới và châu Á, có 10 loài phân bố tại Trung Quốc trong đó có 3 loài đặc hữu [17]

1.2 Loài Pueraria candollei var mirifica

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây dây leo bằng thân quấn Rễ phình thành củ, vỏ màu nâu nhạt, mặt cắt nngang màu trắng Lá kép có 3 lá chét, có thể dài đến 60 cm, mặt trên lá có một lớp lông tơ, màu xanh đậm, mặt dưới có lông ngắn màu xám, gân lá hình lông chim Lá chét giữa hình thoi, đầu nhọn nguyên, hai lá chét bên mọc đối, hình trứng ngược, dài 20 cm, mép lá nguyên, lệch gốc, cuống lá chét bên có lông mịn màu trắng, dài khoảng 7 mm Lá kèm của lá chét dạng sợi; hai lá chét bên mỗi lá một lá kèm, lá chét ở giữa có hai lá kèm

Cụm hoa chùm tán, hoa dài khoảng 1,5cm, màu tím xanh, lưỡng tính, mẫu 5, tiền khai hoa cờ Cuống hoa màu nâu, có lông mịn phủ phía ngoài, dài khoảng 1-3 mm Lá bắc cụm hoa mảnh, kích thước 1x4 mm, mặt ngoài mang nhiều lông dài, mặt trong nhẵn Mỗi tán mang ba hoa, có một lá bắc hình khiên Hoa màu xanh tím, dài khoảng 10 mm, không đều, lưỡng tính Hoa có hai lá bắc con, hình trứng, dài 1 mm, mặt trong nhẵn, màu trắng, mặt ngoài nhiều lông, màu vàng nhạt, kích thước 1 x 1,5mm, dễ rụng Đài hoa dài khoảng 5 mm, hàn liền giống hình chuông, màu tím nâu, có lông mịn bao phủ phía ngoài, chia làm năm thùy, không đều, ba thùy nhọn ở phía trước, hai thùy sau dính với nhau Nhị 10 xếp thành 2 bó (9 nhị liền và 1 nhị rời) Nhụy có bầu trên, lá noãn 1, đính noãn mép

Quả loại đậu, dẹt, dài 5-7cm, rộng 6-7 mm, khi non màu xanh, già màu nâu, có 3-5 hạt

Củ có kích thước đa dạng, vỏ củ nâu, bên trong trắng, mặt cắt ngang có hình như nan hoa xe đạp [4]

Cây thường ra hoa vào tháng 2- 3, kết quả vào tháng 4 [8]

1.2.2 Phân bố và bộ phận dùng

SDCT phân bố trong các khu rừng lá rụng ở độ cao 300–800m phía bắc, tây và

đông bắc Thái Lan, có thể cả ở Myanmar [8]

Theo “Từ điển thực vật thông dụng” chi Pueraria gồm tới 20 loài phân bố ở Đông

Nam Á và châu Đại Dương [2] Tại Việt Nam, SDCT phân bố ở các tỉnh phía Tây Bắc Việt Nam như Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Ba Vì và một số huyện miền núi của Thanh Hóa và Nghệ An [4]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của 17β – estradiol

bộ thân của Pueraria candollei var mirifica

Isoflavonoid Vỏ thân (mg/g) Thân không vỏ

(mg/g)

Toàn bộ thân (mg/g) Kwakhurin 0.1 ± 0.00 Không xác định 0.08 ± 0.00

Genistein 0.04 ± 0.01 0.03 ± 0.00 0.03 ± 0.00 Daidzein 0.01 ± 0.00 0.11 ± 0.00 0.09 ± 0.00 Daidzin Không xác định 0.12 ± 0.01 0.06 ± 0.00 Puerarin Không xác định 0.27 ± 0.01 0.14 ± 0.00 Hàm lượng isoflavonoid tổng số cao nhất được tìm thấy ở thân không vỏ, thân và cuối cùng là vỏ thân Vỏ thân không phát hiện thấy daidzein và puerarin Kwakhurin không được xác định trong thân không có vỏ [21]

1.3.1.2 Nhóm Chromen

Isomiroestrol Deoxymiroestrol Miroestrol

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của chromen trong thân SDCT Bảng 1.1 Hàm lượng Chromen trong vỏ thân, thân không vỏ và toàn bộ thân của

Pueraria candollei var mirifica

Chromen Vỏ thân (µg/g) Thân không vỏ

(µg/g)

Toàn bộ thân (µg/g) Isomiroestrol 97.13 ± 7.28 10.44 ± 0.99 23,93 ± 0.74 Deoxymiroestrol 20.89 ± 2.43 5.35 ± 0.38 15.05 ± 3.71 Miroestrol 94.71 ± 6.48 3.60 ± 0.11 36.93 ± 0.46

Hàm lượng chromen được tìm thấy cao nhất trong vỏ thân, toàn bộ thân và cuối cùng là thân không vỏ [21]

1.4 Tác dụng sinh học

Năm 2020, Witsarut Kraithong và cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt động estrogen của thân và rễ củ SDCT đối với sự tăng sinh tế bào MCF – 7 Vỏ thân (chiết xuất thô 10 μg/mL) chứa hàm lượng chromenes cao và lượng isoflavonoid thấp, kích thích tăng trưởng tế bào MCF-7 (tác dụng tăng sinh tương đối [RPE] 127,25% ± 4,43% so với estradiol [10−10 M]) Sau khi hòa tan dịch chiết etanol với dung dịch etanol 10% (v/v), phần hòa tan của chiết xuất thô của thân cây đã kích thích sự tăng sinh của tế bào MCF-7 mà không có tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào ở nồng độ cao (100 μg/mL) như đã quan sát thấy trong phần không tan của dịch chiết Nghiên cứu cho rằng phần hòa tan của dịch chiết thô có thể ít độc hơn so với dịch chiết thô etanolic và các thành phần không phân cực của dịch chiết [21]

1.5 Công dụng trong y học cổ truyền và dân gian

Pueraria candollei var mirifica là một loại cây nổi tiếng trong y học cổ truyền

Thái Lan Rễ củ được sử dụng làm trẻ hóa ở phụ nữ tuổi mãn kinh gần một trăm năm Thân và lá còn sót lại sau khi thu hoạch củ dưới lòng đất cũng chứa phytoestrogen và có đặc tính estrogen Lá SDCT đã được báo cáo là có tích tụ isoflavonoid, tuy nhiên hàm lượng phytoestrogen ở phần lá thấp hơn rễ củ khoảng hai lần [7] Thân SDCT hiện chưa được nghiên cứu rộng rãi về phytoestrogen và hoạt động estrogen Mặc khác, thân

cây Pueraria lobata cũng chứa phytoestrogen, được sử dụng rộng rãi trong các loại

thuốc truyền thống của Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc [11] Vì vậy, thân cây SDCT sẽ là nguồn cung cấp phytoestrogen thay thế đầy hứa hẹn

1.6 Chiết xuất SDCT

Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất khỏi phần không tan trong dược liệu Sản phẩm của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết [3]

Đối với dược liệu SDCT, phương pháp chiết xuất chủ yếu tập trung vào việc chiết xuất cao toàn phần, sản phẩm thu được đa dạng về thành phần hóa học Hiện nay nhiều phương pháp và kỹ thuật chiết khác nhau đã được nghiên cứu và áp dụng trong phòng thí nghiệm và thực tế sản xuất công nghiệp Hiệu quả và chất lượng sản phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó phương pháp chiết và dung môi có tác động nhiều nhất

1.6.1 Phương pháp chiết xuất

Có nhiều phương pháp khác nhau để chiết xuất SDCT đã đươc thực hiện như chiết siêu âm [6], ngâm lạnh [13]…

Bảng 1.2 Bảng tổng hợp các phương pháp chiết xuất SDCT

Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Ứng dụng

Ngâm nóng

Đơn giản nhất Thích hợp nhiều loại dược liệu Các điều kiện ngâm đồng nhất [16]

Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của chất [16]

Phòng thí nghiệm và công nghiệp

Chiết hồi lưu

Đơn giản, dễ thao tác

Có thể tái sử dụng dung môi thu hồi [3]

Tốn nhiều dung môi, năng lượng [3] Phòng thí nghiệm

và công nghiệp

Chiết siêu âm

Cải thiện độ tan của dược liệu Rút ngắn thời gian chiết [3]

Thiết bị tốn kém Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của chất [3]

Phòng thí nghiệm và công nghiệp

Chiết Soxhlet

Dễ chiết kiệt, tiết kiệm dung môi, dịch chiết đặc Rút ngắn thời gian chiết [3]

Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của dược chất [3] Phòng thí nghiệm

Chiết dưới áp suất

cao

Có thể dung dung môi truyền thống Rút ngắn thời gian chiết [3]

Thiết bị tốn kém Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của chất [3]

Phòng thí nghiệm

Các phương pháp chiết hiện đại như chiết dưới áp suất cao, chiết bằng dung môi siêu tới hạn cho hiệu suất chiết cao với thời gian chiết xuất ngắn và lượng dung môi nhỏ hơn Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị, điều kiện chiết xuất khó khăn hơn dẫn đến khó ứng dụng trong quy mô công nghiệp

1.6.2 Dung môi chiết xuất

Dung môi là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình chiết xuất Có nhiều dung môi khác nhau đã được sử dụng để chiết xuất SDCT trong các nghiên cứu như: EtOH, nước, ethyl acetat, MeOH [19], [13], [5]

Bảng 1.3.Bảng tổng hợp các dung môi chiết xuất SDCT

EtOH Hòa tan nhiều loại hoạt chất

Dung môi xanh, an toàn

Tốn chi phí hơn so với dung môi là nước

MeOH Khả năng hòa tan tốt Độc, hạn chế dùng Nước Dung môi phổ biến nhất, có sẵn, rẻ, không

độc

Hòa tan không chọn lọc Hiệu suất thấp

Ethyl acetat

Ít độc, mùi dễ chịu Chủ yếu chiết xuất hợp

Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao

không quá 20% [1]

1.7.2 Phương pháp điều chế cao đặc

Quá trình điều chế cao đặc thường có 2 giai đoạn: - Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp Tùy theo bản

chất của dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mô sản xuất và điều kiện trang thiết bị, có thể sử dụng phương

pháp chiết xuất: Ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác [1]

- Giai đoạn 2: Dịch chiết được cô đặc đến khi dung môi dùng để chiết xuất còn lại không quá 20% được cao đặc Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 600C Nếu không có điều kiện cô đặc và sấy ở dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 800C Trường hợp muốn thu được cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp bằng các phương pháp thích hợp tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất [1]

1.7.3 Yêu cầu chất lượng với cao đặc

- Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng nếu có trong DĐVN V [1]

- Mất khối lượng do làm khô: nếu không có chỉ dẫn khác, cao đặc không quá 20% [1]

- Kim loại nặng: nếu không có chỉ dẫn khác, không được quá 20 phần triệu [1] - Dung môi tồn dư: nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn

hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sừ dụng phải đáp ứng yêu cẩu qui định trong Phụ lục 10.14 Xác định dung môi tồn dư – DĐVN V [1]

- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 12.17 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật – DĐVN V [1]

- Giới hạn nhiễm khuẩn: đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 13.6 Thử giới hạn

nhiễm khuẩn – DĐVN V [1] 1.8 Các phương pháp xác định daidzein

1.8.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (TLC)

Bảng 1.4 Một số hệ dung môi pha động sử dụng trong định tính daidzein bằng

1.8.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Vỏ rễ, rễ không vỏ, vỏ thân, thân không vỏ, toàn bộ thân được chiết xuất và hòa tan lại với 1 mL EtOH thu được các dung dịch thử Các dung dịch này được đưa vào phân tích hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện sắc ký [21]:

- Cột thích thước (25 cm × 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh C (5 µm) - Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 280 nm

- Nhiệt độ cột: 30oC - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl - Pha động: Dung dịch acetonitrile – acid acetic 1,5% triển khai theo chương trình

trong bảng 1.6 dưới đây:

Bảng 1.5 Hệ dung môi pha động sử dụng trong định lượng daidzein bằng

1.8.3 Một số phương pháp khác

Một số phương pháp được sử dụng định lượng daidzein như sắc kí khí…[14]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Thân SDCT được thu hái tại xã Tản Lĩnh, huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội vào

tháng 8/2023 Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Pueraria candollei var mirifica (Airy

Shaw & Suvat.) Niyom Dham

Người giám định: ThS Nghiêm Đức Trọng Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu Bản: HNIP/18696/23

- Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45 µm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc syringe 0,45 µm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)

- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg - Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ)

- Tủ sấy Memmert (Đức) - Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức) - Bể điều nhiệt Memmert (Đức) WNB14

- Máy cô quay chân không IKA ® RV 8 (IKA, Đức) - Máy ly tâm Hermle Z207A

- Máy siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc)

- Bếp hồng ngoại Sunhouse SHD 6011 điều chỉnh được công suất - Tủ hút phòng thí nghiệm Fume hood

- Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại, micro pipet và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác cần cho phân tích

2.1.3 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn

- Chất chuẩn đối chiếu: Daidzein (hãng Macklin, cas: 486-66-8, độ tinh khiết 99,67%)

- Các dung môi: MeOH, toluen, aceton, đạt tiêu chuẩn phân tích Các dung môi dùng cho HPLC, TLC được mua của hãng Merck

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 của hãng Merck

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng daidzein trong cao đặc thân SDCT bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất tới hàm lượng daidzein trong cao đặc thân SDCT

- Nội dung 3: Điều chế cao đặc thân SDCT giàu daidzein theo các thông số quy trình đã khảo sát

- Nội dung 4: Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc thân SDCT điều chế được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng daidzein trong thân SDCT

2.3.1.1 Chiết xuất và điều chế cao đặc thân SDCT

Cân khoảng 20 g bột thô thân SDCT vào bình nón 500ml, thêm 160 ml EtOH 70%, ngâm ấm 90 phút Dịch chiết lần 1 lọc qua bông Thêm 160 ml EtOH 70% vào bã dược liệu ngâm ấm lần 2 trong 90 phút Dịch chiết thu được để lắng, gạn và lọc qua bông Gộp dịch chiết, lọc qua phễu lọc buchner, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 50 - 60°C đến thể chất lỏng sánh,

sau đó chuyển vào tủ sấy ở 60°C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%)

Hàm lượng daidzein trong cao được tính theo công thức:

X (mg/g) = (S−b).V.100

a.m.(100−A)Trong đó:

X: hàm lượng daidzein trong cao (mg/g) S: diện tích pic daidzein trong sắc ký đồ (mAU.s) b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ daidzein và diện tích pic

V: thể tích dung dịch thử (mL) (V = 10 mL) a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ daidzein và diện tích pic

m: khối lượng cao (g) A: hàm ẩm của cao (%)

2.3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: Cột C18 Inertsustain GL Sciences (250 x 4,6 mm; 5 µm) - Chọn pha động: Khảo sát các hệ dung môi và lựa chọn hệ phù hợp - Chọn tốc độ dòng

- Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV – Vis của daidzein để xác định cực đại hấp thụ

- Chọn thể tích tiêm: 15 µL

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1,0000 g cao đặc SDCT vào cốc có

mỏ 50ml Thêm 7 ml MeOH, siêu âm 20 phút Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm thu được dung dịch thử

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1mg chuẩn daidzein hòa tan trong vừa đủ

10 ml MeOH thu được dung dịch chuẩn gốc S

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng

Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên [22]

Yêu cầu: Hệ thống được coi là thích hợp nếu RSD ≤ 2,0% với cả thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết

2.3.1.3.2 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác)

Tiến hành: Chạy sắc ký lần lượt với các mẫu: mẫu trắng (dung môi pha mẫu), dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn So sánh các sắc ký đồ thu được

Yêu cầu: - Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn: Pic của chất phân tích cần phân

tách hoàn toàn khỏi các pic khác và có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

- Sắc ký đồ của mẫu trắng: Không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

- Hệ số chồng phổ UV – Vis của pic thu được trong sắc ký đồ của mẫu thử so với pic tương ứng thu được trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn phải đạt từ 99,0% trở lên

2.3.1.3.3 Độ tuyến tính

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Kết quả được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số xác định R2

Tiến hành: Pha một dãy dung dịch chuẩn daidzein ở các nồng độ thích hợp Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện được chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ daidzein trong các dung dịch chuẩn

Yêu cầu: R2 ≥ 0,99

2.3.1.3.4 Độ chính xác

Độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

Tiến hành: Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập theo quy trình phân tích Tính toán giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng daidzein của 6 mẫu

Yêu cầu: RSD ≤ 3,7%

2.3.1.3.5 Độ đúng

Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực Tiến hành: Thêm một lượng đã biết chất chuẩn tương ứng với 25%, 50% và 75% vào mẫu thử ở mức 50% để thu được dung dịch với các nồng độ daidzein bằng 75%, 100%, 125% so với nồng độ daidzein trong mẫu thử Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và chạy sắc ký theo điều kiện được chọn, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần Xác định tỷ lệ thu hồi (%) so với nồng độ ban đầu

2.3.2 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất daidzein từ thân SDCT

2.3.2.1 Quy trình xử lý mẫu và chiết xuất

Xử lý dược liệu: Thân cắt nhỏ thành các miếng có chiều dài 2 cm, sấy khô ở 60oC, bảo quản trong túi nilon kín nơi khô ráo

Chiết xuất: Dược liệu được xay nhỏ, rây qua rây 500 µm Cân chính xác khoảng 20 g bột dược liệu phân tán vào bình nón nút mài khô, thêm chính xác 160 ml dung môi, dùng đũa thủy tinh trộn đều để dược liệu thấm đều dung môi và ngâm trương nở trong thời gian 10 phút Tiến hành chiết ấm trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Dịch chiết lần 1 lọc qua bông Thêm 160 ml dung môi vào bã dược liệu ngâm ấm lần 2 trong khoảng thời gian nhất định Dịch chiết thu được để lắng, gạn và lọc qua bông Gộp dịch chiết, lọc qua phễu lọc buchner, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 50 - 60°C đến thể chất lỏng sánh,

sau đó chuyển vào tủ sấy ở 60°C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%)

Lọc nóng qua bông thu được dịch chiết

2.3.2.2 Phương pháp định lượng daidzein trong cao thân SDCT

Xác định hàm lượng daidzein trong cao thân SDCT bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1,0000 g cao đặc SDCT vào cốc có mỏ 50ml Thêm 7 ml MeOH, siêu âm 20 phút Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm thu được dung dịch thử

Điều kiện sắc ký: như phương pháp đã được thẩm định ở mục 2.3.1.3

2.3.2.3 Các yếu tố khảo sát và thông số đánh giá

Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất giúp phát hiện và kiểm tra được yếu tố nào ảnh hưởng nhiều (đáng kể) đến hiệu quả chiết xuất

2.3.2.3.1 Lựa chọn phương pháp chiết

Như đã phân tích ở trên, có rất nhiều phương pháp để chiết xuất daidzein từ thân SDCT đã được nghiên cứu và áp dụng Tuy nhiên, với mục đích nghiên cứu để ứng dụng quy trình chiết xuất trong công nghiệp và các điều kiện trang thiết bị sẵn có nhóm nghiên cứu đã lựa chọn phương pháp chiết ngâm ấm do thao tác đơn giản, chi phí đầu tư thấp và có thể ứng dụng ở quy mô lớn

2.3.2.3.2 Khảo sát nồng độ EtOH (tt/tt)

Hiện nay, khái niệm và nguyên tắc “chiết xuất xanh” ngày càng được quan tâm và ứng dụng rộng rãi Vì vậy trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu chọn EtOH làm

dung môi chiết do EtOH chiết xuất được daidzein với lượng tương đối cao [13], đồng thời đây còn là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc, an toàn, thân thiện với môi trường và có thể sử dụng trong quy mô công nghiệp

Lựa chọn chiết tại EtOH 70% cho các thí nghiệm khảo sát và chọn khoảng nồng độ 30%, 50%, 70%, 90% để tiến hành khảo sát

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 20 g bột dược liệu, ngâm nóng bằng 160ml EtOH ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, 90% trong 90 phút, tại 70oC, chiết 2 lần

2.3.2.3.3 Khảo sát thời gian chiết

Thời gian chiết ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết cũng như chất lượng dịch chiết Khảo sát thời gian chiết tại 90 phút cho các thí nghiệm tiếp theo và chọn khoảng thời gian khảo sát là 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 20 g bột dược liệu, ngâm nóng bằng 160 ml EtOH 70% tại 70oC, chiết ở các khoảng thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, chiết 1 lần

2.3.2.3.4 Khảo sát nhiệt độ chiết

Nhiệt độ quá cao có thể ảnh hưởng đến các chất kém bền với nhiệt, hoặc tăng độ tan của tạp chất Khảo sát nhiệt độ chiết tại 70oC cho các thí nghiệm tiếp theo và chọn khoảng nhiệt độ khảo sát là 50oC, 60oC, 70oC, 80oC

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 20 g bột dược liệu, ngâm nóng bằng 160 ml EtOH 70% trong 90 phút, chiết ở khoảng nhiệt độ là 50oC, 60oC, 70oC, 80oC, chiết 2 lần

2.3.2.3.5 Lựa chọn kích thước dược liệu

Kích thích dược liệu là một yếu tố ảnh hưởng đến thời gian và hiệu suất chiết Dược liệu được nghiền nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc với dung môi, rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên, nếu bột quá mịn sẽ dễ gây tắc giấy lọc, tạo nhiều tạp chất làm quá trình xử lý dịch chiết phức tạp Vì vậy, nhóm nghiên cứu chọn kích thước bột thô để tiến hành thực nghiệm

2.3.2.3.6 Lựa chọn số lần chiết

Số lần chiết sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Tham khảo các chuyên luận Dược điển về chiết xuất, số lần chiết thường từ 1-3 lần Để đảm bảo hàm lượng hoạt chất chiết được đồng thời xây dựng được quy trình chiết phù hợp nhất để ứng dụng trong sản xuất, nhóm nghiên cứu lựa chọn số lần chiết là 2 cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.2.3.7 Lựa chọn tỉ lệ dung môi : dược liệu

Dùng ít dung môi sẽ chiết được ít hoạt chất, tăng lượng dung môi giúp tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên, dùng quá nhiều dung môi có thể dẫn đến dịch chiết loãng, lẫn nhiều tạp chất, hao phí dung môi, tốn thời gian thu hồi Với tỷ lệ dung môi: dược liệu >