noknoy phaengmixay nghiên cứu điều chế cao đặc giàu kaemferol từ chè vằng phú thọ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NOKNOY PHAENGMIXAY NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC GIÀU KAEMFEROL TỪ CHÈ VẰNG

PHÚ THỌ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NOKNOY PHAENGMIXAY

1901545 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC GIÀU KAEMPFEROL TỪ CHÈ VẰNG

PHÚ THỌ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin cảm ơn tới hai thầy hướng dẫn em là thầy TS Phạm Lê Minh và Th.s Phạm Thái Hà Văn đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện

đề tài Cảm ơn thầy Minh đã sát sao, hướng dẫn em mỗi lúc em gặp khó khăn trong đề tài Cảm ơn thầy Văn đã cho em được làm nghiên cứu tại bộ môn Dược học cổ truyền, hướng dẫn làm thực nghiệm từ bước dễ đến bước khó và giúp em giải quyết những khó khăn

Em cũng xin cảm ơn toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đã dạy chúng em trong 5 năm học qua, quan tâm và yêu quý lưu học sinh Lào Đặc biệt, em rất cảm ơn các thầy cô vì đã cho em có cơ hội được làm khóa luận tốt nghiệp

Cũng cảm ơn tới bạn Khánh Huyền trong nhóm nghiên cứu đã giúp đỡ mình hoàn thành được khóa luận này Cảm ơn các bạn Winly, Dew, Aoy, Poppy đã đồng

hành cùng mình trong suốt năm học qua, cùng nhau cố gắng hoàn thành khóa luận để có thể tốt nghiệp

Cuối cùng, gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến bố mẹ, người đã động viên, an ủi con mỗi khi con khóc vì gặp khó khăn trong học tập khi ở Việt Nam

Do thời gian làm nghiên cứu cùng kiến thức bản thân có hạn, khóa luận còn nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý từ thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Noknoy PHAENGMIXAY

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNGDANH MỤC CÁC HÌNHDANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 12

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 12

2.1.3 Thuốc thử, hóa chất 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng bằng HPLC 13

2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng 15

2.3.3 Điều chế cao đặc theo các thông số quy trình 15

2.3.4 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc lá chè vằng 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng 18

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 18

3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong lá chè vằng 19

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm

lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng 24

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế đến cao đặc lá chè vằng 25

3.2.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất 26

3.3 Điều chế cao đặc lá chè vằng giàu flavonoid 28

3.3.1 Kết quả điều chế cao đặc lá chè vằng giàu flavonoid 28

3.3.2 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc điều chế được 29

3.4 Bàn luận 31

3.4.1 Về phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng 31

3.4.2 Về điều chế cao đặc giàu flavonoid từ chè vằng 31

3.4.3 Về kết quả điều chế cao đặc lá chè vằng chứa flavonoid 33

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

4.1 Kết luận 34

4.2 Đề xuất 34

Bảng 3.6 Kết quả hiệu suất điều chế cao đặc lá chè vằng 29

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô 29

Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng kaempferol trong 2 mẫu cao đặc 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức hóa học của các hợp chất flavonoid trong chè vằng 4

Hình 1.2 Công thức hóa học của 1 số hợp chất glycosid trong chè vằng 5

Hình 1.3 Công thức hóa học của một số triterpenoid trong chè vằng 5

Hình 1.4 Công thức hóa học của một số acid phenolic trong chè vằng 5

Hình 1.5 Công thức một số hợp chất sterol trong chè vằng 6

Hình 1.6 Công thức của một số tinh dầu trong chè vằng 7

Hình 1.7 Công thức hóa học của kaempferol 9

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol……….16

Hình 3.1 Phổ UV – Vis của chất đối chiếu kaempferol ……… 18

Hình 3.2 Hình ảnh sắc ký đồ của (A) Mẫu trắng, (B) Mẫu đối chiếu, (C) Mẫu thử, (D) Mẫu thử thêm chất đối chiếu, (E) Chồng phổ mẫu thử và mẫu đối chiếu 20

Hình 3.3 Đồ thị khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diẹn tích pic 21

Hình 3.4 Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy 25

Hình 3 5 Kết quả khảo sát thời gian sấy 26

Hình 3.6 Kết quả khảo sat thời gian chiết xuất 26

Hình 3.7 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết 27

Hình 3.8 Kết quả khảo sát nồng độ ethanol 28

Hình 3.9 Hình ảnh cao đặc điều chế được 29

Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC của cao đặc chè vằng (T) và chất đối chiếu kaempferol (C) 30

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

3 HPTLC High Performance Thin-layer

Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

7 TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng 8 DPPH 2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume.) phân bố rộng rãi ở khu vực Đông

Nam Á nói chung và Việt Nam nói riêng Tại Phú Thọ Việt Nam, chè vằng được trồng phổ biến do điều kiện khí hậu phù hợp Chè vằng được sử dụng rộng rãi với các công dụng như: lợi sữa, chữa áp xe vú, chống ghẻ lở… [10], [13]

Những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu về chè vằng như phân lập ra các hoạt chất nhóm flavonoid, glycosid, steroid,… Bên cạnh đó là những tác dụng dược lý đã được chứng minh là tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư…

Kaempferol là một hợp chất flavonoid đã được chứng minh có trong chè vằng và có liên quan mật thiết đến tác dụng chống oxy hóa của chè vằng Hàm lượng kaempferol đã được xác định có trong lá chè vằng khoảng 0,07% Hoạt chất này được cho là có tiềm năng làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc [12]

Hiện nay, điều chế cao với hàm lượng hoạt chất cao đang là xu hướng phát triển của công nghệ dược phẩm Quá trình điều chế cao cần phải xác định được các thông số trong quá trình chiết xuất để tối ưu được hàm lượng hoạt chất Bên cạnh đó, phương pháp hỏa chế trong y học cổ truyền được cho là làm thay đổi thành phần các chất trong dược liệu do đó làm tăng hoặc thay đổi tác dụng Việc áp dụng phương pháp hỏa chế vào quá trình điều chế cao là một hướng nghiên cứu cần được quan tâm

Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc giàu kaempferol từ chè vằng Phú Thọ” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn điều kiện xử lý dược liệu tạo cao đặc lá chè vằng Phú Thọ giàu kaempferol

2 Điều chế cao đặc giàu kaempferol từ lá cây chè vằng Phú Thọ quy mô 50g/mẻ dựa trên điều kiện xử lý dược liệu đã khảo sát

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Chè vằng

1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Jasminum subtriplinerve Blume [13] - Tên đồng nghĩa: Jasminum nervosum [26]

- Tên khác: Vằng, vằng sẻ, vằng lá nhỏ, lài 3 gân [13] - Theo hệ thống phân loại của Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009) [27], chè

vằng thuộc: Phân giới thực vật bậc cao

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùy, gồm 7 – 9 hoa màu trắng: lá bắc hình dùi, đài hoa có ống ngắn, 8 – 10 thùy rất hẹp và nhọn, tràng có ống dài phình lên ở đầu, 8 -10 cánh hoa hẹp, nhị đính ở hông tràng

Quả mọng, khi chín màu đen Mùa hoa: tháng 3 – 4; mùa quả: tháng 5 – 6 [13]

1.1.3 Phân bố, sinh thái

Về phân bố:

Chè vằng phân bố phổ biến và khá tập trung ở khu vực các nước Đông Nam Á và Nam Á Ngoài ra, cây cũng gặp cả ở các tỉnh phía nam Trung Quốc và đảo Hải Nam [13]

Ở Việt Nam, chè vằng có rải rác ở hầu hết các tỉnh thuộc vùng núi thấp, trung du và cả đồng bằng Không thấy cây mọc ở vùng núi cao trên 1500m [13]

Cây gặp nhiều từ Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Phú Thọ, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, qua Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng tới Khánh Hòa [5]

Về sinh thái:

Chè vằng là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, nhất là thời kỳ cây còn nhỏ, thường mọc lần trong các lùm bụi ở ven đồi, bờ nương rẫy và quanh làng bản Cây

mọc nơi đất ẩm, sinh trưởng mạnh hơn cây ở vùng đồi khô hạn Chỉ những cây mọc trùm lên các cây bụi khác, được chiếu sáng đầy đủ mới thấy có nhiều hoa quả Trong tự nhiên thường gặp nhiều cây con mọc từ hạt xung quanh gốc cây mẹ Sau khi bị chặt phá nhiều lần, phần thân, cành còn lại của chè vằng đều có khả năng tái sinh nhiều chồi [13]

1.1.4 Bộ phận dùng

Cành lá, thu hái quanh năm, phơi khô [13]

1.2 Tổng quan về lá chè vằng

1.2.1 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học trong chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume ) gồm các

nhóm chất: flavonoid, glycosid, acid phenolic, steroid, tinh dầu và các nhóm khác

Các phenylpropanoid glycosid được xác định có trong chè vằng, bao gồm

6'-O-menthiafoloylverbascosid [19]

Verbascosid

Isoverbascosid

Apiosylverbascosid

1.2.1.3 Triterpenoid

Các hợp chất triterpenenoid được tìm thấy trong lá chè vằng bao gồm: acid acetyl oleanolic, lup-20-en-3β-ol [18], acid oleanolic, acid betulinic [16], acid acetyloleanolic, acid 2α-hydroxy-oleanolic [30]

Hình 1.3 Công thức hóa học của một số triterpenoid trong chè vằng

1.2.1.4 Acid phenolic

Acid galic, acid protocatechuic được xác định có trong cành và lá chè vằng[11]

Hình 1.2 Công thức hóa học của 1 số hợp chất glycosid trong chè vằng

Hình 1.4 Công thức hóa học của một số acid phenolic trong chè vằng

1.2.1.5 Steroid

Một số hợp chất steroid được tìm thấy trong là và cành chè vằng như en-3β-ol [18], β-Sitosterol, stigmasterol [16], β-daucosterol, astaraxerol, taraxerone [30]

stigmast-5-Hình 1.5 Công thức một số hợp chất sterol trong chè vằng

Năm 2012, Nguyễn Thị Thanh Mai và các cộng sự đã chứng minh cao chloroform, cao ethyl acetat, cao n-butanol đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, trong đó cao ethyl acetat thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất Có 3 hợp chất tinh khiết gồm acid 3,4,5- trihidroxibenzoic, acid 3,4-dihidroxibenzoic và verbascosid được phân lập từ cây Vằng sẻ đều có tác dụng chống oxy hóa, trong đó verbascosid thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn cả chất chuẩn quercetin

Năm 2019, Triệu Tuấn Anh và cộng sự đã thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết giàu polyphenol Kết quả cho thấy dịch chiết có thể loại bỏ được 46,11% gốc tự do DPPH (30 μg/mL) ở nồng độ 10,000 μg/ml [29]

1.2.2.2 Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2008, Đái Huệ Ngân và các cộng sự đã chứng minh dịch chiết ether dầu hỏa

có tác dụng ức chế B subtilis với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 100 μg/mL, các dịch chiết ethyl acetat và ethanol ức chế S aureus với giá trị MIC = 200 μg/mL và chiết xuất methanol ức chế E coli với giá trị MIC = 200 μg/mL, dịch chiết nước không có khả

năng ức chế 2 vi khuẩn ở nồng độ dưới 200 μg/mL Các dịch chiết trên không cho thấy bất kỳ tác dụng ức chế nào đối với vi nấm [18]

Năm 2013, Nguyễn Đăng Minh Chánh và cộng sự đã chứng minh dịch chiết

methanol lá có khả năng kháng khuẩn với loài Rhizoctonia solani [22]

Bệnh viện Thái Bình có làm kháng sinh đồ so sánh với penixilin 1 đơn vị quốc tế trong 1ml và strptomycin 20γ trong 1ml, cloroxit 50γ trong 1ml và sulfamid thì thấy dây chè

Hình 1.6 Công thức của một số tinh dầu trong chè vằng

vằng có tác dụng kháng sinh mạnh hơn các thuốc trên đối với tụ cầu khuẩn

(Staphyllococcus) và liên cầu khuẩn tan huyết (Streptococcus hemolytique) [10]

1.2.2.3 Tác dụng chống ung thư

Năm 2008, Đái Huệ Ngân và các cộng sự đã chứng minh dịch chiết ether dầu hỏa từ thân và lá chè vằng có tác dụng gây độc tế bào in vitro trên cả hai dòng tế bào ung thư ở người là Hep-G2 và RD với giá trị IC50 lần lượt là 19,2 và 20,0 μg/mL [18]

1.2.2.4 Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

Năm 2022, Lê Minh Ngọc và cộng sự đã đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase trên in vitro và in silico của cao chiết lá vằng Kết quả cho thấy cao phân đoạn n-hexan

và EtOAc có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 7,27 ± 0,71 mg/mL và 7,42 ± 0,95 mg/mL Cao chiết tổng, phân đoạn n-BuOH và phân đoạn nước

không thể hiện tác dụng ức chế α-glucosidase Các hợp chất rutin, isoverbascosid,

astragalin, isoquercitrin, verascosid, stirysterol, nicotiflorin và chevangin B có thể đóng một vai trò quan trọng trong tác dụng sinh học này [21]

1.2.2.5 Giảm đau, chống viêm và hạ acid uric, lipid máu

Năm 2021, Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng giảm đau,

chống viêm và hạ axit uric máu của chiết xuất ethanol 50% từ Jasminum subtriplinerve

Blume trên chuột nhắt với liều 800 và 120mg/kg cân nặng Kết quả cho thấy không có dấu hiệu ngộ độc ở chuột được cho uống với liều tối đa là 20 g dịch chiết/kg cân nặng Chiết xuất này có tác dụng giảm đau và hạ axit uric máu mãn tính ở liều uống 800 mg/kg ở chuột [28]

Năm 2023, Phạm Hồng Minh và cộng sự đã trên chuột Kết quả cho thấy cao chiết lá chè vằng ở các liều lập lại 18 mg/kg/ngày và 54 mg/kg/ngày có tính an toàn sau 90 ngày cho uống Cao chiết lá chè vằng không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, các thông số tạo máu, tổn thương tế bào gan hoặc chức năng gan và thận ở chuột thí nghiệm Về tác dụng hạ lipid máu, cao chiết lá chè vằng ở liều 36 mg/kg/ngày và 108 mg/kg/ngày làm giảm rõ rệt các chỉ số lipid trong máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, non-HDL-C) sau 7 ngày uống trên mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh gây bởi poloxamer-407 ở chuột nhắt Swiss [24]

1.2.3 Tri thức sử dụng trong dân gian

Tại Việt Nam, nhân dân nhiều tỉnh dùng lá vằng phơi khô nấu hay pha nước uống hằng ngày hay cho phụ nữa sau khi đẻ uống Có nơi dùng lá nấu nước tắm cho trẻ em bị ghẻ lở [10] Ngoài ra còn chữa kinh nguyệt không đều, bế kinh đau bụng ở phụ nữ, chữa vàng da, nhuận gan [13]

Tại miền nam Việt Nam, nhân dân dùng lá chữa sưng vú, cho phụ nữ mới đẻ uống, còn dùng chữa rắn cắn, rễ mài với dấm thanh để làm hết mủ những ung nhọt đã nung mủ [10]

Tại bệnh viện Thái Bình, Việt Nam, dùng lá chè vằng giã nát chữa áp xe vú [10]

– 280oC + Kaempferol có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 266 nm và 362 nm trong

methanol; ở bước sóng 265 nm và 365 nm trong ethanol - Tác dụng dược lý:

+ Chống oxy hóa [25] + Chống ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan…[25]

+ Kháng khuẩn (E coli, K pneumoniae,…), kháng nấm, chống viêm [23],

[14]

1.4 Phương pháp định lượng kaempferol bằng HPLC

HPLC là một phương pháp thường được sử dụng để định lượng các hợp chất do khả năng và giới hạn phát hiện cao

Một số hệ dung môi pha động được sử dụng trong các nghiên cứu về định lượng kaempferol như sau:

Hình 1.7 Công thức hóa học của kaempferol

Bảng 1.1 Một số hệ dung môi pha động định lượng kaempferol bằng HPLC

STT

Chế độ rửa giải

Thành phần pha động (tt/tt)

Tốc độ dòng (ml/phút)

Thể tích tiêm

(µl)

Bước sóng quan sát

(nm)

Tài liệu tham khảo

1 Đẳng

dòng

Acetonitril : đệm phosphat 10mM, pH =2,5 (40:60)

2 Đẳng

dòng

Methanol : dung dịch acid phosphoric 0,4% (52:48)

3 Đẳng

dòng

Methanol : dung dịch acid phosphoric0,4% (52:48)

1.5 Phương pháp hỏa chế

➢ Phương pháp hỏa chế là phương pháp chế biến sử dụng tác động của nhiệt độ trực tiếp hoặc gián tiếp qua các phụ liệu trung gian ở các mức nhiệt độ khác nhau [4] ➢ Mục đích của hỏa chế bao gồm [4]:

- Tăng tính ấm, giảm tính hàn của vị thuốc: lửa thuộc nhiệt, thuộc dương Hỏa chế

nghĩa là đưa thêm phần nhiệt, phần dương vào vị thuốc, làm giảm tính hàn cho vị thuốc

- Giảm độc tính, giảm tác dụng quá mạnh của vị thuốc: Thường nhiệt độ cao phân

hủy các chất gây độc của thuốc

- Ổn định hoạt chất trong vị thuốc - Giảm độ bền cơ học của vị thuốc ở nhiệt độ cao, các chất hữu cơ bị phân hủy,

các liên kết hữu cơ bị phá vỡ làm giảm độ bền của vị thuốc

- Tạo mùi thơm cho vị thuốc

➢ Các phương pháp hỏa chế như sao, nung, chế sương, lùi (vùi, ổi), nướng, hỏa phi ➢ Một số phương pháp sao trực tiếp trong hỏa chế:

- Sao qua (vi sao): nhiệt độ khoảng 50 – 80oC Mục đích làm khô, làm thơm, tránh mốc mọt và ổn định thành phần hoạt chất

- Sao vàng: nhiệt độ khoảng 100-140oC, tăng mùi thơm, tăng tác dụng quy tỳ

- Sao vàng cháy cạnh: nhiệt độ khoảng 100-160oC Mục đích giảm bớt mùi vị khó chịu của thuốc

- Sao vàng hạ thổ: nhiệt độ khoảng 100-160oC Giúp cân bằng âm dương cho vị thuốc Hạ nhiệt nhanh, tránh sự ảnh hưởng tiếp theo của nhiệt độ

- Sao đen (hắc sao, sao tồn tính): nhiệt độ khoảng 180 – 240oC, tăng tác dụng tiêu thực, giảm tính mãnh liệt của vị thuốc

- Sao cháy, nhiệt độ khoảng 180-240oC, tăng tác dụng cầm máu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Lá chè vằng được thu hái lại huyện Thanh Thủy, tỉnh Phú Thọ vào tháng 4/2023

Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Jasminum subtriplinerve Blume, họ Nhài (Oleaceae)

đã được giám định bởi ThS Nghiêm Đức Trọng – bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu bản: HNIP/18834/24

Xử lý mẫu: Lá chè vằng được rửa sạch, phơi khô, bảo quản trong túi kín, nơi khô ráo

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản): buồng cấp dung môi

LC-20AD, buồng ổn nhiệt cho cột CTO-10AS, cột sắc kí pha đảo C18, đầu dò Vis SPD – M20A

UV Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45 µm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc

syringe 0,45 µm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 mL Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)

- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) - Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ) - Bể siêu âm Elmasonic S100H (Đức)

- Bể điều nhiệt Memmert (Đức) WNB14 - Tủ sấy Memmert (Đức) UF110

- Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức) - Máy ly tâm Hermle Z207A

- Bếp hồng ngoại Sunhouse SHD 6011 điều chỉnh được công suất - Tủ hút phòng thí nghiệm Fume hood

- Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại, micro pipet và các dụng cụ thủy

tinh cần thiết khác cần cho quá trình phân tích

2.1.3 Thuốc thử, hóa chất

- Chất đối chiếu kaempferol với độ tinh khiết 97% hãng Macklin Số lô CAS:

520-18-3

- Các dung môi: methanol, acid hydrochloric, ethyl acetat, toluen đạt tiêu chuẩn phân

tích Các dung môi dùng cho HPLC được mua của hãng Merck

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 của hãng Merck 2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng bằng HPLC

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng

Nội dung 3: Điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol dựa theo các thông số đã khảo sát

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng bằng HPLC

Cân chính xác khoảng 0,1000 g cao đặc vào bình nón có nút mài khô, Thêm khoảng 10ml ethanol 70% vào để hòa tan cao, thêm 20 ml acid HCl 2N vào bình nón Lắp sinh hàn hồi lưu, thủy phân trong 2 giờ ở nhiệt độ khoảng 60oC Sau đó, trung hòa dịch thủy phân bằng Na2CO3 đến pH 5-6 Dịch đã trung hòa đem lắc với 20ml ethyl acetat, thu lấy lớp ethyl acetat phía trên Tiến hành lắc lần 2 tương tự như trên Dịch ethyl acetat được cô cặn đến cắn

Thêm khoảng 8 ml dung môi methanol vào cắn, siêu âm Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm thu được dung dịch thử

Hàm lượng kaempferol trong cao đặc được tính theo công thức:

kaempferol và diện tích pic

- V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 10 ml) - a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ

kaempferol và diện tích pic

- m: khối lượng cao (g) - A: hàm ẩm của cao (%)

2.3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

Cột sắc ký: Cột C18 Inertsustain GL Sciences (250 x 4,6 mm; 5 µm) Chọn pha động: Tham khảo một số tài liệu như ở bảng 1.1, khảo sát các hệ dung môi và lựa chọn hệ phù hợp

Chọn tốc độ dòng Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV – Vis của kaempferol để xác định cực đại hấp thụ

Chọn thể tích tiêm: 30 µL

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng

Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [15] về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên

2.3.1.3.1 Tính phù hợp hệ thống

Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và dung dịch thử, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích, bao gồm giá trị về thời gian lưu, diện tích pic tương ứng và số đĩa lý thuyết

Yêu cầu: Hệ thống được coi là thích hợp nếu RSD ≤ 2,0% với cả thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết lớn hơn 3000

2.3.1.3.2 Tính đặc hiệu

Tiến hành: Tiêm lần lượt với các mẫu: mẫu trắng (dung môi pha mẫu), dung dịch đối chiếu kaempferol , dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn So sánh các sắc ký đồ thu được

Yêu cầu:

- Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn: Pic của chất phân tích cần phân tách

hoàn toàn khỏi các pic khác và có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

- Sắc ký đồ của mẫu trắng: Không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương

ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

- Hệ số chồng phổ UV – Vis của pic thu được trong sắc ký đồ của mẫu thử so với

pic tương ứng thu được trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn phải đạt từ 99,0% trở lên 2.3.1.3.3 Độ tuyến tính

Tiến hành: Pha một dãy dung dịch chuẩn kaempferol ở các nồng độ thích hợp Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện được chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ kaempferol trong các dung dịch chuẩn

Yêu cầu: R2 ≥ 0,99

2.3.1.3.4 Độ chính xác

- Độ lặp lại trong ngày

Tiến hành: Chuẩn bị 6 mẫu độc lập theo quy trình trên Triển khai sắc ký, tính toán giá trị RSD của hàm lượng kaempferol của 6 mẫu

- Độ chính xác trung gian

Tiến hành: Phân tích mẫu trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi triển khai sắc ký Độ chính xác trung gian được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích trong 2 ngày

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của kết quả định lượng ≤ 3,7% với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1% và ≤ 5,3% với các chất có hàm lượng từ 0,001% đến dưới 0,01%

2.3.1.3.5 Độ đúng

Tiến hành: Thêm một lượng đã biết chất chuẩn hoặc chất đối chiếu tương ứng với 25%, 50% và 75% vào mẫu thử ở mức 50% để thu được dung dịch với các nồng độ kaempferol bằng 75%, 100%, 125% so với nồng độ kaempferol trong mẫu thử Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và khai triển sắc ký theo điều kiện được chọn, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần Xác định tỷ lệ thu hồi (%) so với nồng độ ban đầu

Yêu cầu: Với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1%, tỷ lệ thu hồi đạt 95,0 – 105,0% ở mỗi mức nồng độ Với các chất có hàm lượng từ 0,001% đến dưới 0,01%, tỷ lệ thu hồi đạt 90,0 – 107,0%

2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng

2.3.2.1 Các yếu tố khảo sát:

Chuẩn bị mẫu: ➢ Nhiệt độ sấy: 100oC, 120oC, 140oC, 160oC, 180oC, 200oC ➢ Thời gian sấy: 10 phút, 20 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút

Chiết xuất: ➢ Nhiệt độ chiết xuất: 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC ➢ Thời gian chiết xuất: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút ➢ Nồng độ EtOH: 0%, 20%, 40%, 60%, 70%, 80%

Thông số đánh giá: Hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng được tính theo công thức (1)

2.3.3 Điều chế cao đặc theo các thông số quy trình

2.3.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc

Quy trình điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol áp dụng các thông số quy trình lựa chọn áp dụng với quy mô sử dụng 50 g dược liệu

Tiến hành: Chế biến hỏa chế - sấy dược liệu với thông số được lựa chọn từ khảo sát Dược liệu được xay nhỏ đến bột thô Cân chính xác khoảng 50 g dược liệu cho vào bình thủy tinh 1 lít có nắp đậy Chiết nóng với dung môi ethanol, trong thời gian và nhiệt độ đã lựa chọn từ khảo sát 2.3.3.1 Lọc thu lấy dịch chiết, đem cô và sấy ở 50 – 60oC cho đến cao đặc

Sơ đồ tóm tắt quy trình điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol:

Sấy Xay thành bột thô, rây

500 ml dung môi Ethanol x 2 lần Chiết nóng

Lọc dịch chiết

Cô quay áp suất giảm Sấy ở 50 – 60 oC

2.3.3.2 Xác định hiệu suất điều chế cao đặc

Hiệu suất điều chế cao H (%):

H(%)= Khối lượng cao x (100-Hàm ẩm cao)

Khối lượng dược liệu x (100- Hàm ẩm dược liệu ) x 100 Trong đó: Khối lượng (g), Hàm ẩm cao (%), Hàm ẩm dược liệu ban đầu đem chiết (%)

2.3.4 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc lá chè vằng

2.3.4.1 Tính chất:

Mô tả mẫu cao đặc lá chè vằng về thể chất, màu sắc, mùi vị

2.3.4.2 Mất khối lượng do làm khô (phụ lục 9.6 DĐVN V)

Cân chính xác khoảng 1,0000 g cao và tiến hành như phụ lục 9.6 DĐVN V bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Mỗi mẫu cao xác định 3 lần

Chuẩn bị bản mỏng: Sử dụng bản mỏng silicagel 60GF254 (Merck) được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ

Pha động: Toluen : ethyl acetat : acid formic = 6 : 4 : 0,3 (v/v) Tiến hành chấm mẫu lên bản mỏng, triển khai sắc ký Lấy bản mỏng ra ngoài, để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát bản mỏng ở 3 mức: ánh sáng thường, dưới bước sóng 254 nm và bước sóng 366 nm

2.3.4.4 Định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng bằng HPLC

Tiến hành chuẩn bị mẫu và chạy sắc ký theo phương pháp đã được thẩm định ở mục 2.3.1.3