Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng .... Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Chè vằng
1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
- Tên khoa học: Jasminum subtriplinerve Blume [13]
- Tên đồng nghĩa: Jasminum nervosum [26]
- Tên khác: Vằng, vằng sẻ, vằng lá nhỏ, lài 3 gân [13]
- Theo hệ thống phân loại của Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009) [27], chè vằng thuộc:
Phân giới thực vật bậc cao
Cây nhỏ, mọc thành bụi Cành mảnh, vươn dài Lá mọc đối, hình bầu dục – mũi mác, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, mặt trên bóng, 3 gân tỏa từ gốc, những lá gần cụm hoa nhỏ dần trông như những lá bắc, cuống ngắn
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùy, gồm 7 – 9 hoa màu trắng: lá bắc hình dùi, đài hoa có ống ngắn, 8 – 10 thùy rất hẹp và nhọn, tràng có ống dài phình lên ở đầu, 8 -
10 cánh hoa hẹp, nhị đính ở hông tràng
Quả mọng, khi chín màu đen
Mùa hoa: tháng 3 – 4; mùa quả: tháng 5 – 6 [13]
Chè vằng phân bố phổ biến và khá tập trung ở khu vực các nước Đông Nam Á và Nam Á Ngoài ra, cây cũng gặp cả ở các tỉnh phía nam Trung Quốc và đảo Hải Nam [13] Ở Việt Nam, chè vằng có rải rác ở hầu hết các tỉnh thuộc vùng núi thấp, trung du và cả đồng bằng Không thấy cây mọc ở vùng núi cao trên 1500m [13]
Cây gặp nhiều từ Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Phú Thọ, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, qua Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng tới Khánh Hòa [5]
Chè vằng là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, nhất là thời kỳ cây còn nhỏ, thường mọc lần trong các lùm bụi ở ven đồi, bờ nương rẫy và quanh làng bản Cây
3 mọc nơi đất ẩm, sinh trưởng mạnh hơn cây ở vùng đồi khô hạn Chỉ những cây mọc trùm lên các cây bụi khác, được chiếu sáng đầy đủ mới thấy có nhiều hoa quả Trong tự nhiên thường gặp nhiều cây con mọc từ hạt xung quanh gốc cây mẹ Sau khi bị chặt phá nhiều lần, phần thân, cành còn lại của chè vằng đều có khả năng tái sinh nhiều chồi [13]
Cành lá, thu hái quanh năm, phơi khô [13].
Tổng quan về lá chè vằng
Thành phần hóa học trong chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume ) gồm các nhóm chất: flavonoid, glycosid, acid phenolic, steroid, tinh dầu và các nhóm khác
Trong cành lá cây chè vằng xác định có các hợp chất flavonoid như: rutin, isoquercitrin, astragalin, nicotiflorin [6], [7], [8], kaempferol [12]
Hình 1.1 Công thức hóa học của các hợp chất flavonoid trong chè vằng 1.2.1.2 Glycosid
Các phenylethanoid glycosid được tìm thấy trong lá chè vằng như: verbascosid [6], isoverbascosid, apiosylverbascosid [19]
Lá và cành chè vằng thu hái tại Thái Nguyên đã được phân lập ra các hợp chất terpen glycosid bao gồm: anatoliosid A, 6′′′-Epi-anatoliosid A, chevangin A, chevangin
Các phenylpropanoid glycosid được xác định có trong chè vằng, bao gồm 6'-O- menthiafoloylverbascosid [19]
Các hợp chất triterpenenoid được tìm thấy trong lá chè vằng bao gồm: acid 3β- acetyl oleanolic, lup-20-en-3β-ol [18], acid oleanolic, acid betulinic [16], acid acetyloleanolic, acid 2α-hydroxy-oleanolic [30]
Hình 1.3 Công thức hóa học của một số triterpenoid trong chè vằng
Acid galic, acid protocatechuic được xác định có trong cành và lá chè vằng [11]
Hình 1.2 Công thức hóa học của 1 số hợp chất glycosid trong chè vằng
Hình 1.4 Công thức hóa học của một số acid phenolic trong chè vằng
Một số hợp chất steroid được tìm thấy trong là và cành chè vằng như stigmast-5- en-3β-ol [18], β-Sitosterol, stigmasterol [16], β-daucosterol, astaraxerol, taraxerone [30]
Hình 1.5 Công thức một số hợp chất sterol trong chè vằng 1.2.1.6 Tinh dầu
Lá chè vằng có chứa tinh dầu Các thành phần trong tinh dầu được tìm thấy là: linalool, α-terpineol, geraniol, cis-linalool oxid [17]
Ngoài ra lá chè vằng chứa alcaloid, nhựa [13] Tuy nhiên vẫn còn thiếu các nghiên cứu tìm ra các hợp chất hóa học thuộc chất này
Chè vằng đã được chứng minh có các tác dụng dược lý sau: chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư,
1.2.2.1 Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2008, Đái Huệ Ngân và các cộng sự đã xác định được dịch chiết ethyl acetat thân và lá chè vằng ở nồng độ 200 μg/mL có tác dụng chống oxy hóa mạnh thông qua thử nghiệm thu dọn gốc tự do DPPH [18]
Năm 2012, Nguyễn Thị Thanh Mai và các cộng sự đã chứng minh cao chloroform, cao ethyl acetat, cao n-butanol đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, trong đó cao ethyl acetat thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất Có 3 hợp chất tinh khiết gồm acid 3,4,5- trihidroxibenzoic, acid 3,4-dihidroxibenzoic và verbascosid được phân lập từ cây Vằng sẻ đều có tác dụng chống oxy hóa, trong đó verbascosid thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn cả chất chuẩn quercetin
Năm 2019, Triệu Tuấn Anh và cộng sự đã thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết giàu polyphenol Kết quả cho thấy dịch chiết có thể loại bỏ được 46,11% gốc tự do DPPH (30 μg/mL) ở nồng độ 10,000 μg/ml [29]
Năm 2008, Đái Huệ Ngân và các cộng sự đã chứng minh dịch chiết ether dầu hỏa có tác dụng ức chế B subtilis với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 100 μg/mL, các dịch chiết ethyl acetat và ethanol ức chế S aureus với giá trị MIC = 200 μg/mL và chiết xuất methanol ức chế E coli với giá trị MIC = 200 μg/mL, dịch chiết nước không có khả năng ức chế 2 vi khuẩn ở nồng độ dưới 200 μg/mL Các dịch chiết trên không cho thấy bất kỳ tác dụng ức chế nào đối với vi nấm [18]
Năm 2013, Nguyễn Đăng Minh Chánh và cộng sự đã chứng minh dịch chiết methanol lá có khả năng kháng khuẩn với loài Rhizoctonia solani [22]
Bệnh viện Thái Bình có làm kháng sinh đồ so sánh với penixilin 1 đơn vị quốc tế trong 1ml và strptomycin 20γ trong 1ml, cloroxit 50γ trong 1ml và sulfamid thì thấy dây chè
Hình 1.6 Công thức của một số tinh dầu trong chè vằng
8 vằng có tác dụng kháng sinh mạnh hơn các thuốc trên đối với tụ cầu khuẩn (Staphyllococcus) và liên cầu khuẩn tan huyết (Streptococcus hemolytique) [10]
1.2.2.3 Tác dụng chống ung thư
Năm 2008, Đái Huệ Ngân và các cộng sự đã chứng minh dịch chiết ether dầu hỏa từ thân và lá chè vằng có tác dụng gây độc tế bào in vitro trên cả hai dòng tế bào ung thư ở người là Hep-G2 và RD với giá trị IC50 lần lượt là 19,2 và 20,0 μg/mL [18]
1.2.2.4 Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Năm 2022, Lê Minh Ngọc và cộng sự đã đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase trên in vitro và in silico của cao chiết lá vằng Kết quả cho thấy cao phân đoạn n-hexan và EtOAc có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 7,27 ± 0,71 mg/mL và 7,42 ± 0,95 mg/mL Cao chiết tổng, phân đoạn n-BuOH và phân đoạn nước không thể hiện tác dụng ức chế α-glucosidase Các hợp chất rutin, isoverbascosid, astragalin, isoquercitrin, verascosid, stirysterol, nicotiflorin và chevangin B có thể đóng một vai trò quan trọng trong tác dụng sinh học này [21]
1.2.2.5 Giảm đau, chống viêm và hạ acid uric, lipid máu
Năm 2021, Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng giảm đau, chống viêm và hạ axit uric máu của chiết xuất ethanol 50% từ Jasminum subtriplinerve Blume trên chuột nhắt với liều 800 và 120mg/kg cân nặng Kết quả cho thấy không có dấu hiệu ngộ độc ở chuột được cho uống với liều tối đa là 20 g dịch chiết/kg cân nặng Chiết xuất này có tác dụng giảm đau và hạ axit uric máu mãn tính ở liều uống 800 mg/kg ở chuột [28]
Năm 2023, Phạm Hồng Minh và cộng sự đã trên chuột Kết quả cho thấy cao chiết lá chè vằng ở các liều lập lại 18 mg/kg/ngày và 54 mg/kg/ngày có tính an toàn sau
90 ngày cho uống Cao chiết lá chè vằng không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, các thông số tạo máu, tổn thương tế bào gan hoặc chức năng gan và thận ở chuột thí nghiệm
Về tác dụng hạ lipid máu, cao chiết lá chè vằng ở liều 36 mg/kg/ngày và 108 mg/kg/ngày làm giảm rõ rệt các chỉ số lipid trong máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, non-HDL- C) sau 7 ngày uống trên mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh gây bởi poloxamer-407 ở chuột nhắt Swiss [24]
1.2.3 Tri thức sử dụng trong dân gian
Tại Việt Nam, nhân dân nhiều tỉnh dùng lá vằng phơi khô nấu hay pha nước uống hằng ngày hay cho phụ nữa sau khi đẻ uống Có nơi dùng lá nấu nước tắm cho trẻ em bị ghẻ lở [10] Ngoài ra còn chữa kinh nguyệt không đều, bế kinh đau bụng ở phụ nữ, chữa vàng da, nhuận gan [13]
Tại miền nam Việt Nam, nhân dân dùng lá chữa sưng vú, cho phụ nữ mới đẻ uống, còn dùng chữa rắn cắn, rễ mài với dấm thanh để làm hết mủ những ung nhọt đã nung mủ [10]
9 Tại bệnh viện Thái Bình, Việt Nam, dùng lá chè vằng giã nát chữa áp xe vú [10].
Kaempferol
Kaempferol phân bố rộng rãi ở nhiều loài thực vật, như bạch quả, bạch thược, bát giác liên, bòng bong, chè vằng… [12]
- Danh pháp (IUPAC): 3,5,7- trihydroxy -2-(4-hydroxyphenyl)- 4H-benzopyran- 4-on
+ Kaempferol có dạng tinh thể hình kim hoặc vi tinh thể, màu vàng rất nhạt + Tan tốt trong MeOH, EtOH, diethylether, tan trong dung dịch kiềm Hầu như không tan trong nước lạnh Không tan trong benzen, cloroform + Ở dạng tinh thể hình kim, Kaempferol có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng
+ Ở dạng vi tinh thể, Kaempferol có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 278 – 280 o C
+ Kaempferol có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 266 nm và 362 nm trong methanol; ở bước sóng 265 nm và 365 nm trong ethanol
+ Chống ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan…[25]
+ Kháng khuẩn (E coli, K pneumoniae,…), kháng nấm, chống viêm [23], [14].
Phương pháp định lượng kaempferol bằng HPLC
HPLC là một phương pháp thường được sử dụng để định lượng các hợp chất do khả năng và giới hạn phát hiện cao
Một số hệ dung môi pha động được sử dụng trong các nghiên cứu về định lượng kaempferol như sau:
Hình 1.7 Công thức hóa học của kaempferol
Bảng 1.1 Một số hệ dung môi pha động định lượng kaempferol bằng HPLC
Thành phần pha động (tt/tt)
Tốc độ dòng (ml/phút)
Bước sóng quan sát (nm)
Acetonitril : đệm phosphat 10mM, pH
Methanol : dung dịch acid phosphoric 0,4%
Methanol : dung dịch acid phosphoric0,4%
Phương pháp hỏa chế
➢ Phương pháp hỏa chế là phương pháp chế biến sử dụng tác động của nhiệt độ trực tiếp hoặc gián tiếp qua các phụ liệu trung gian ở các mức nhiệt độ khác nhau [4]
➢ Mục đích của hỏa chế bao gồm [4]:
- Tăng tính ấm, giảm tính hàn của vị thuốc: lửa thuộc nhiệt, thuộc dương Hỏa chế nghĩa là đưa thêm phần nhiệt, phần dương vào vị thuốc, làm giảm tính hàn cho vị thuốc
- Giảm độc tính, giảm tác dụng quá mạnh của vị thuốc: Thường nhiệt độ cao phân hủy các chất gây độc của thuốc
- Ổn định hoạt chất trong vị thuốc
- Giảm độ bền cơ học của vị thuốc ở nhiệt độ cao, các chất hữu cơ bị phân hủy, các liên kết hữu cơ bị phá vỡ làm giảm độ bền của vị thuốc
- Tạo mùi thơm cho vị thuốc
➢ Các phương pháp hỏa chế như sao, nung, chế sương, lùi (vùi, ổi), nướng, hỏa phi
➢ Một số phương pháp sao trực tiếp trong hỏa chế:
- Sao qua (vi sao): nhiệt độ khoảng 50 – 80 o C Mục đích làm khô, làm thơm, tránh mốc mọt và ổn định thành phần hoạt chất
- Sao vàng: nhiệt độ khoảng 100-140 o C, tăng mùi thơm, tăng tác dụng quy tỳ
- Sao vàng cháy cạnh: nhiệt độ khoảng 100-160 o C Mục đích giảm bớt mùi vị khó chịu của thuốc
- Sao vàng hạ thổ: nhiệt độ khoảng 100-160 o C Giúp cân bằng âm dương cho vị thuốc Hạ nhiệt nhanh, tránh sự ảnh hưởng tiếp theo của nhiệt độ
- Sao đen (hắc sao, sao tồn tính): nhiệt độ khoảng 180 – 240 o C, tăng tác dụng tiêu thực, giảm tính mãnh liệt của vị thuốc
- Sao cháy, nhiệt độ khoảng 180-240 o C, tăng tác dụng cầm máu
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
Lá chè vằng được thu hái lại huyện Thanh Thủy, tỉnh Phú Thọ vào tháng 4/2023 Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Jasminum subtriplinerve Blume, họ Nhài (Oleaceae) đã được giám định bởi ThS Nghiêm Đức Trọng – bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu bản: HNIP/18834/24
Xử lý mẫu: Lá chè vằng được rửa sạch, phơi khô, bảo quản trong túi kín, nơi khô ráo
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản): buồng cấp dung môi LC-20AD, buồng ổn nhiệt cho cột CTO-10AS, cột sắc kí pha đảo C18, đầu dò UV- Vis SPD – M20A
- Hệ thống lọc chõn khụng, màng lọc 0,45 àm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc syringe 0,45 àm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 mL Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)
- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản)
- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ)
- Bể siêu âm Elmasonic S100H (Đức)
- Bể điều nhiệt Memmert (Đức) WNB14
- Tủ sấy Memmert (Đức) UF110
- Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức)
- Bếp hồng ngoại Sunhouse SHD 6011 điều chỉnh được công suất
- Tủ hút phòng thí nghiệm Fume hood
- Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại, micro pipet và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác cần cho quá trình phân tích
- Chất đối chiếu kaempferol với độ tinh khiết 97% hãng Macklin Số lô CAS: 520- 18-3
- Các dung môi: methanol, acid hydrochloric, ethyl acetat, toluen đạt tiêu chuẩn phân tích Các dung môi dùng cho HPLC được mua của hãng Merck
- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 của hãng Merck.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng bằng HPLC
13 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng
Nội dung 3: Điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol dựa theo các thông số đã khảo sát.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng bằng HPLC 2.3.1.1 Xử lý mẫu
Xử lý dược liệu: Dược liệu sau khi thu hái và sấy khô sơ cấp, trải đều ra các khay và để trong tủ sấy ở nhiệt độ và thời gian nhất định
Chiết xuất: Dược liệu được xay nhỏ đến bột thô Cân chính xác khoảng 10,0000g bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài Thêm một thể tích dung môi ethanol, sau đó chiết nóng trong bể điều nhiệt Lọc nóng qua bông thu được dịch chiết Dịch chiết đem cô và sấy ở 50 – 60 o C cho đến cao đặc
Cân chính xác khoảng 0,1000 g cao đặc vào bình nón có nút mài khô, Thêm khoảng 10ml ethanol 70% vào để hòa tan cao, thêm 20 ml acid HCl 2N vào bình nón Lắp sinh hàn hồi lưu, thủy phân trong 2 giờ ở nhiệt độ khoảng 60 o C Sau đó, trung hòa dịch thủy phân bằng Na2CO3 đến pH 5-6 Dịch đã trung hòa đem lắc với 20ml ethyl acetat, thu lấy lớp ethyl acetat phía trên Tiến hành lắc lần 2 tương tự như trên Dịch ethyl acetat được cô cặn đến cắn
Thêm khoảng 8 ml dung môi methanol vào cắn, siêu âm Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 àm thu được dung dịch thử
Hàm lượng kaempferol trong cao đặc được tính theo công thức:
- X: hàm lượng kaempferol chiết được từ cao đặc (%)
- S: diện tích pic kaempferol trong sắc ký đồ (mAU.s)
- b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ kaempferol và diện tích pic
- V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 10 ml)
- a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ kaempferol và diện tích pic
2.3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
Cột sắc ký: Cột C18 Inertsustain GL Sciences (250 x 4,6 mm; 5 àm)
Chọn pha động: Tham khảo một số tài liệu như ở bảng 1.1, khảo sát các hệ dung môi và lựa chọn hệ phù hợp
Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV – Vis của kaempferol để xác định cực đại hấp thụ
Chọn thể tớch tiờm: 30 àL
2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng
Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [15] về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên
2.3.1.3.1 Tính phù hợp hệ thống
Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và dung dịch thử, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích, bao gồm giá trị về thời gian lưu, diện tích pic tương ứng và số đĩa lý thuyết
Yêu cầu: Hệ thống được coi là thích hợp nếu RSD ≤ 2,0% với cả thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết lớn hơn 3000
Tiến hành: Tiêm lần lượt với các mẫu: mẫu trắng (dung môi pha mẫu), dung dịch đối chiếu kaempferol , dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn So sánh các sắc ký đồ thu được
- Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn: Pic của chất phân tích cần phân tách hoàn toàn khỏi các pic khác và có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
- Sắc ký đồ của mẫu trắng: Không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
- Hệ số chồng phổ UV – Vis của pic thu được trong sắc ký đồ của mẫu thử so với pic tương ứng thu được trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn phải đạt từ 99,0% trở lên 2.3.1.3.3 Độ tuyến tính
Tiến hành: Pha một dãy dung dịch chuẩn kaempferol ở các nồng độ thích hợp Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện được chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ kaempferol trong các dung dịch chuẩn
- Độ lặp lại trong ngày
Tiến hành: Chuẩn bị 6 mẫu độc lập theo quy trình trên Triển khai sắc ký, tính toán giá trị RSD của hàm lượng kaempferol của 6 mẫu
- Độ chính xác trung gian
Tiến hành: Phân tích mẫu trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi triển khai sắc ký Độ chính xác trung gian được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích trong 2 ngày
Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của kết quả định lượng ≤ 3,7% với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1% và ≤ 5,3% với các chất có hàm lượng từ 0,001% đến dưới 0,01%
Tiến hành: Thêm một lượng đã biết chất chuẩn hoặc chất đối chiếu tương ứng với 25%, 50% và 75% vào mẫu thử ở mức 50% để thu được dung dịch với các nồng độ kaempferol bằng 75%, 100%, 125% so với nồng độ kaempferol trong mẫu thử Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và khai triển sắc ký theo điều kiện được chọn, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần Xác định tỷ lệ thu hồi (%) so với nồng độ ban đầu
Yêu cầu: Với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1%, tỷ lệ thu hồi đạt 95,0 – 105,0% ở mỗi mức nồng độ Với các chất có hàm lượng từ 0,001% đến dưới 0,01%, tỷ lệ thu hồi đạt 90,0 – 107,0%
2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng
2.3.2.1 Các yếu tố khảo sát:
➢ Thời gian sấy: 10 phút, 20 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút
➢ Thời gian chiết xuất: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút
Thông số đánh giá: Hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng được tính theo công thức (1)
2.3.3 Điều chế cao đặc theo các thông số quy trình
2.3.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc
Quy trình điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol áp dụng các thông số quy trình lựa chọn áp dụng với quy mô sử dụng 50 g dược liệu
16 Tiến hành: Chế biến hỏa chế - sấy dược liệu với thông số được lựa chọn từ khảo sát Dược liệu được xay nhỏ đến bột thô Cân chính xác khoảng 50 g dược liệu cho vào bình thủy tinh 1 lít có nắp đậy Chiết nóng với dung môi ethanol, trong thời gian và nhiệt độ đã lựa chọn từ khảo sát 2.3.3.1 Lọc thu lấy dịch chiết, đem cô và sấy ở 50 – 60 o C cho đến cao đặc
Sơ đồ tóm tắt quy trình điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol:
Xay thành bột thô, rây
500 ml dung môi Ethanol x 2 lần
Cô quay áp suất giảm
2.3.3.2 Xác định hiệu suất điều chế cao đặc
Hiệu suất điều chế cao H (%):
H(%)= Khối lượng cao x (100-Hàm ẩm cao)
Khối lượng dược liệu x (100- Hàm ẩm dược liệu ) x 100 Trong đó: Khối lượng (g), Hàm ẩm cao (%), Hàm ẩm dược liệu ban đầu đem chiết (%)
2.3.4 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc lá chè vằng
Mô tả mẫu cao đặc lá chè vằng về thể chất, màu sắc, mùi vị
2.3.4.2 Mất khối lượng do làm khô (phụ lục 9.6 DĐVN V)
Cân chính xác khoảng 1,0000 g cao và tiến hành như phụ lục 9.6 DĐVN V bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Mỗi mẫu cao xác định 3 lần
2.3.4.3 Định tính kaempferol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành như phần xử lý mẫu 2.3.1.1
Mẫu đối chiếu: Hòa tan kaempferol với methanol thu được nồng độ 0,1 mg/ml
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình điều chế cao đặc lá chè vằng giàu kaempferol
17 Chuẩn bị bản mỏng: Sử dụng bản mỏng silicagel 60GF254 (Merck) được hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ
Pha động: Toluen : ethyl acetat : acid formic = 6 : 4 : 0,3 (v/v)
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng
3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Dựa trên các chương trình triển khai sắc ký ở bảng 1.1 kết hợp với điều chỉnh các thông số, đề tài đã tìm ra hệ dung môi pha động: Acetonitril : dung dịch đệm phosphat 0,1% (35 : 65)
Sử dụng hệ pha động trên để chạy mẫu đối chiếu kaempferol và quét phổ trong khoảng 190 – 400nm Kết quả cho thấy kaempferol có hấp phụ cực đại tại bước sóng
366 nm Do đó, chọn bước sóng 366 nm để định lượng kaempferol
Qua khảo sát, điều kiện sắc ký lựa chọn để định lượng kaempferol trong lá chè vằng như sau:
• Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 àm)
• Pha động: acetonitril: dung dịch đệm phosphat 0,1% = 35: 65
• Tốc độ dòng: 1,2 mL/ phút
• Detector DAD với bước sóng 366 nm
• Thể tớch tiờm mẫu: 30 àL
Hình 3.1 Phổ UV – Vis của chất đối chiếu kaempferol
3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong lá chè vằng
3.1.2.1 Tính phù hợp hệ thống
Kết quả tiêm lặp lại 6 lần dung dịch thử và 6 lần dung dịch đối chiếu có nồng độ 13.65 àg/mL được thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả độ phù hợp hệ thống
Mẫu đối chiếu Mẫu thử
Kết quả khảo sát cho thấy: RSD của thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết đều nhỏ hơn 2,0% Số đĩa lý thuyết tốt đều lớn hơn 3000
Kết quả cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn có độ lặp lại cao về thời gian, diện tích pic và số đĩa lý thuyết, chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng kaempferol trong lá chè vằng và đạt yêu cầu theo AOAC
Hình ảnh các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu đối chiếu kaempferol, mẫu thử, mẫu thử thêm chất đối chiếu kaempferol và phổ UV, kết quả chồng phổ được trình bày hình 3.2 dưới đây:
- Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic kaempferol trong mẫu đối chiếu
- Khi thêm chất đối chiếu kaempferol vào mẫu thử thì diện tích và chiều cao pic kaempferol trong mẫu thử ban đầu tăng lên và không có pic lạ
- Phổ của pic trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và pic tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu thử cho kết quả hệ số chồng phổ đạt (0,9957>0,99)
Như vậy, phương pháp định lượng kaempferol có độ đặc hiệu cao min mAU
50 PDA Multi 1 366nm,4nm min mAU
Hình 3.2 Hình ảnh sắc ký đồ của (A) Mẫu trắng, (B) Mẫu đối chiếu, (C) Mẫu thử, (D) Mẫu thử thêm chất đối chiếu, (E) Chồng phổ mẫu thử và mẫu đối chiếu
3.1.2.3 Xác định khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
Tiến hành triển khai sắc ký với 6 mẫu dung dịch đối chiếu kaempferol có nồng độ từ 3,4375 – 110 àg/mL với điều kiện đó chọn Xõy dụng phương trỡnh sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ kaempferol (x) và diện tích pic (y) Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được ghi lại trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic kaempferol
STT Nồng độ (àg/mL) Diện tớch pic (mAU.s)
Khoảng tuyến tớnh (àg/mL) 3,4375 – 110
Kết quả khảo sát cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ kaempferol và diện tích pic, với hệ số xác định R 2 =0,9999 (R 2 ≥ 0,99) Như vậy, đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao, đảm bảo phép phân tích định lượng kaempferol y = 49603x + 3748.7 R² = 0.9999
Hình 3.3 Đồ thị khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diẹn tích pic
Phân tích mẫu thử trong 2 ngày, mỗi ngày 6 mẫu để đánh giá độ chính xác Các mẫu được lấy từ cao đặc lá chè vằng không qua quá trình hỏa chế Hàm ẩm cao là 5,5
Sử dụng phương trình ở trên để tính toán
Kết quả khảo sát ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả độ chính xác
Diện tích pic (mAU.s)
Hàm lượng kaempferol trong cao đặc (%) (kl/kl)
Diện tích pic (mAU.s)
Hàm lượng kaempferol trong cao đặc (%) (kl/kl)
Hàm lượng kaempferol trung bình 2 ngày (n =
Do hàm lượng kaempferol định lượng được trong cao là 0,1256% nằm trong khoảng từ 0,1% - 1% nên theo AOAC thì yêu cầu về giá trị RSD ≤ 2,7%
Các giá trị RSD định lượng kaempferol của mỗi ngày và cả 2 ngày lần lượt là 2,36%; 1,14% và 1,88% Các giá trị RSD thu được đều ≤ 2,7% Như vậy, phương pháp định lượng có độ lặp lại cao, ổn định, đạt yêu cầu về độ chính xác
Cân chính xác 1,6mg chất đối chiếu kaempferol pha vào bình định mức 50ml với methanol thu được dung dịch đối chiếu gốc có nồng độ 0,032 mg/ml
Sau đó, lần lượt hút chình xác 1,0 ml, 2,0 ml và 3,0 ml dung dịch đối chiếu gốc vào các bình nón có chứa sẵn chính xác khoảng 0,0500g cao đặc Tiến hành chuẩn bị mẫu như với mẫu thử và phân tích sắc ký theo quy trình phân tích
Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp định lượng kaempferol trong cao lá chè vằng được trình bày ở Bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả độ đúng
Lượng chất đối chiếu thêm vào (mg)
Lượng chất đối chiếu tìm lại (mg)
Nhận xét: Ở 3 mức nồng độ khác nhau, tỉ lệ thu hồi chất đối chiếu kaempferol nằm trong khoảng 97 – 103% (do hàm lượng kaempferol nằm trong khoảng 0,1% - 1%) với độ
24 lệch chuẩn tương đối về tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ đều ≤ 2,7% cho thấy phương pháp đảm bảo độ đúng định lượng kaempferol phù hợp theo quy định của AOAC Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng kaempferok trong cao đặc lá chè vằng được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng
Tiêu chuẩn Kết quả Yêu cầu và kết luận
Tính phù hợp hệ thống
Hệ số đĩa lý thuyết: RSD = 0,71%
Hệ số đĩa lý thuyết: RSD = 1,27%
Kết luận: Đạt Độ đặc hiệu
Pic kaempferol cân xứng Pic ở mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm đối chiếu có tR giống nhau, mẫu thử thêm đối chiếu có diện tích pic lớn hơn mẫu đối chiếu
Yêu cầu: R 2 ≥0,99 Kết luận: đạt Độ chính xác
Kết luận: đạt Độ đúng
Tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng từ 97 – 103%
3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng
Khảo sát lần lược các yếu tố: Nhiệt độ sấy, thời gian sấy, thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, nồng độ ethanol với thông số đánh giá là hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng (%)
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế đến cao đặc lá chè vằng
3.2.1.1 Khảo sát nhiệt độ sấy
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy dược liệu với các giá trị lần lượt
Chiết nóng với 100ml ethanol 70% ở 60 o C trong 30 phút Chiết 2 lần Kết quả được thể hiện ở hình 3.4 dưới đây:
Hình 3.4 Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy
Khi tăng nhiệt độ sấy, hàm lượng kaempferol trong cao đặc cũng tăng lên Khi tăng nhiệt độ từ 100 – 140 o C, tương ứng với khoảng sao vàng, hàm lượng kaempferol tăng lên không nhiều, nhưng vẫn cao hơn trong cao của dược liệu không sấy
Khi tăng từ 160 - 200 o C, tương ứng với khoảng sao đen/sao cháy trong y học cổ truyền, hàm lượng kaempferol tăng lên đáng kể và đạt giá trị cao nhất ở 200 o C
3.2.1.2 Khảo sát thời gian sấy
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy dược liệu với các giá trị lần lượt
Sấy trong 120 o C Sau đó, chiết nóng với 100ml ethanol 70% ở 60 o C trong 30 phút Chiết 2 lần
Kết quả được thể hiện ở hình 3.5 dưới đây:
Khảo sát nhiệt độ sấy
Khi thời gian sấy dược liệu thay đổi từ 10 – 20 phút, hàm lượng kaempferol trong cao đặc tăng lên và cao hơn cao của dược liệu không sấy Hàm lượng kaempferol đạt giá trị cao nhất ở thời gian sấy 20 phút (0,087%)
Nhưng khi tăng nhiệt độ từ 30 – 90 phút, hàm lượng kaempferol giảm đột ngột
Có thể giải thích sấy ở thời gian dài khiến cho hoạt chất bị phân hủy nên làm giảm hàm lượng
3.2.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết xuất dược liệu với các giá trị lần lượt 30, 60, 90, 120, 180 (phút)
Điều chế cao đặc lá chè vằng giàu flavonoid
3.3.1 Kết quả điều chế cao đặc lá chè vằng giàu flavonoid
Từ các kết quả khảo sát trên, các thông số được lựa chọn để điều chế cao đặc mẻ 50g lá chè vằng như sau:
• Phương pháp chiết: Chiết nóng
Kết quả hiệu suất điều chế cao đặc chè vằng không hỏa chế và có hỏa chế được trình bày dưới bảng 3.6
Khảo sát nồng độ ethanol
Bảng 3.6 Kết quả hiệu suất điều chế cao đặc lá chè vằng
Dược liệu Khối lượng dược liệu (g)
Khối lượng cao thu được (g)
Hiệu suất điều chế cao (%)
3.3.2 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc điều chế được
Nhận xét: Mẫu cao là khối đặc quánh đồng nhất, màu nâu vàng đến đen, có mùi đặc trưng của chè vằng
3.3.2.2 Mất khối lượng do làm khô
- Mẫu nghiên cứu: Mẫu cao đặc với dược liệu không hỏa chế và hỏa chế theo các thông số đã lựa chọn
- Kết quả được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô
Khối lượng cao trước khi sấy (g)
Khối lượng cao sau khi sấy (g) Độ ẩm (%) Độ ẩm trung bình (%)
Hình 3.9 Hình ảnh cao đặc điều chế được
Nhận xét: Mẫu cao đặc đã qua hỏa chế có hàm ẩm thấp hơn so với mẫu cao đặc chưa qua hỏa chế Cả 2 mẫu cao đặc đều đạt chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô (< 20%)
3.3.2.3 Định tính kaempferol trong cao đặc lá chè vằng bằng sắc ký lớp mỏng
Tiến hành chuẩn bị như mục 2.4.3.3 với mẫu cao đặc đã qua hỏa chế
Kết quả thu được trong hình 3.10
A Quan sát dưới ánh sáng thường
B Quan sát dưới bước sóng 254 nm
C Quan sát dưới bước sóng 366 nm
Quan sát ở ánh sáng thường, ở bước sóng 254 nm và 366 nm đều cho thấy: trên sắc ký đồ của dung dịch thử của mẫu cao đặc hỏa chế đều xuất hiện vết có màu sắc và
Rf tương đương với vết kaempferol đối chiếu Hợp chất kaempferol có Rf ≈ 0,67 và tách ra khỏi các vết khác trên sắc ký đồ
Hình 3.10 thể hiện sắc ký đồ TLC cho thấy, hệ dung môi này có thể sử dụng để định tính kămpferol trong cao đặc lá chè vằng
3.3.2.4 Định lượng kaempferol trong cao đặc
- Mẫu nghiên cứu: Mẫu cao đặc điều chế hỏa chế và không hỏa chế
- Kết quả được trình bày trong bảng 3.7
Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC của cao đặc chè vằng (T) và chất đối chiếu kaempferol (C)
Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng kaempferol trong 2 mẫu cao đặc
Lần Hàm lượng kaempferol trong cao đặc (%)
Hỏa chế Không hỏa chế
Nhận xét: Với dược liệu không hỏa chế, hàm lượng kaempferol trong cao đặc là
0,1160% Với dược liệu hỏa chế với điều kiện tối ưu đã khảo sát, hàm lượng kaempferol trong cao đặc là 0,2169% (kl/kl) Hàm lượng kaempferol trong cao đã qua chế biến hỏa chế cao gấp khoảng 1,88 lần so với trong cao đặc không chế biến hỏa chế.
Bàn luận
3.4.1 Về phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng
Kaempferol đã được xác định có trong lá chè vằng liên quan đến tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn của chè vằng [12]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến dùng để định lượng các hợp chất do độ nhạy, độ phát hiện cao Do đó sử dụng phương pháp này để định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng
Tham khảo các tài liệu, tiến hành khảo sát và kết quả điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:
• Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 àm)
• Pha động: Acetonitril: dung dịch đệm acid phosphat 0,1% = 35: 65
• Tốc độ dòng: 1,2 mL/ phút
• Detector DAD với bước sóng 366 nm
• Thể tớch tiờm mẫu: 30 àL
Quá trình thẩm định phương pháp định lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng về tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng đều đạt giới hạn yêu cầu Điều này cho thấy các điều kiện sắc ký được lựa chọn là phù hợp
3.4.2 Về điều chế cao đặc giàu flavonoid từ chè vằng
Lựa chọn phương pháp chiết nóng do cách tiến hành, thiết bị đơn giản, dễ nâng cấp quy mô công nghiệp
32 Tuy nhiên hạn chế của phương pháp chiết là [9]:
+ Năng suất thấp, thao tác thủ công
+ Nếu chỉ chiết 1 lần không được hoạt chất trong dược liệu
+ Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi và thời gian chiết
Dung môi ethanol được chọn do độ an toàn với con người và môi trường, dễ kiếm, giá rẻ Tiến hành khảo sát các nồng độ ethanol từ 0% đến 80%, không khảo sát ethanol cao độ hơn, do ethanol cao độ dễ gây cháy nổ và gia tăng giá thành
Kết quả sơ bộ cho thấy ethanol 70% cho hàm lượng kaempferol trong cao đặc là cao nhất, do có độ phân cực gần nhất với kaempferol
Khi tăng nhiệt độ chiết xuất, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi giảm, từ đó tăng tính thấm dung môi và dược liệu, tăng độ tan, tăng tốc độ chiết và tăng hiệu suất chiết
Bên cạnh đó, nhiệt độ chiết xuất cao quá làm tăng chi phí sản xuất, làm phân hủy cấu trúc hoạt chất Nhiệt độ cao cũng làm bay hơi 1 phần dung môi ethanol, làm giảm hiệu suất chiết
Với cao đặc lá chè vằng, khi tăng nhiệt độ làm giảm hàm lượng kaempferol, nguyên nhân có thể tăng lượng tạp chất được chiết ra làm giảm hàm lượng
Quá trình chiết hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu ra ngoài môi trường Khi đạt đến cân bằng, quá trình khuếch tán dừng lại Tăng thời gian chiết, hàm lượng hoạt chất chiết ra không tăng nhưng lượng tạp tăng, từ đó làm giảm hàm lượng hoạt chất
Khảo sát thời gian chiết xuất ở các mức 30 – 60 – 90 – 120 – 180 phút cho kết quả ở 120 phút hàm lượng kaempferol chiết được là cao nhất Thời gian chiết xuất 120 phút tuy cho hàm lượng cao nhưng có điểm hạn chế là thời gian kéo dài, gây hao phí năng lượng
❖ Lựa chọn nhiệt độ sấy dược liệu
- Các mẫu dược liệu đã qua hỏa chế đều có xu hướng tăng tỷ lệ thuận với nhiệt độ sấy Ở điều kiện nhiệt độ xử lý, độ bền cơ học của tế bào dược liệu giảm, chất nguyên sinh bị đông vón nên dung môi dễ dàng thấm vào và khuếch tán hoạt chất ra khỏi tế bào thuận lợi hơn
- Ở nhiệt độ 200 o C tương ướng với khoảng sao cháy cho hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng là cao nhất
- Do điều kiện phòng thí nghiệm nên không thể tăng nhiệt độ cao hơn để khảo sát Nhưng sấy ở 200 o C thích hợp với quy mô khảo sát ở phòng thí nghiệm,
33 không thích hợp quy mô công nghiệp do ở sấy ở nhiệt độ cao dễ gây cháy nổ, tốn kém chi phí
❖ Lựa chọn thời gian sấy dược liệu
- Khi sấy dược liệu chè vằng ở các thời gian khác nhau như 10, 20, 30, 45, 60,
90 phút cho thấy sấy ở 20 phút cho hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng là cao nhất
- Có thể 20 phút là thời gian dược liệu giảm độ bền cơ học làm cho dung môi dễ thấm vào dược liệu, tăng lượng chất được chiết ra
- Khi tăng thời gian, hoạt chất bị phân hủy làm giảm hàm lượng
3.4.3 Về kết quả điều chế cao đặc lá chè vằng chứa flavonoid
• Về kết quả điều chế cao đặc lá chè vằng quy mô 50g dược liệu/mẻ theo các thông số quy tình đã lựa chọn sau khi khảo sát:
- Tiến hành điều chế song song 2 mẫu cao đặc không hỏa chế và hỏa chế theo các thông số tối ưu đã lựa chọn Kết quả cho thấy hàm lượng kaempferol trong cao đặc lá chè vằng không hỏa chế thấp hơn so với cao đặc đã hỏa chế, tuy nhiên hiệu suất điều chế cao đặc đã qua hỏa chế thấp hơn so với cao đặc không hỏa chế có thể do hỏa chế trải qua nhiều giai đoạn nên các chất trong cao chịu tác động bởi nhiều yếu tố nên làm giảm lượng cao đặc điều chế được
