dewlavanh douangsonthi nghiên cứu điều chế cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực từ đó điều chế cao đặc mẻ 50g theo các thông số quy trình đã khảo sát: ..... Tuy nhiên, cho

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các Thầy Cô giáo, các nhà khoa học cùng bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS Phạm Lê Minh và ThS

Phạm Thái Hà Văn, những người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và hỗ trợ

em hết mình trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo em trong 5 năm học qua cũng như tạo điều kiện cho lưu học sinh Lào chúng em được tham gia bảo vệ khóa luận tốt nghiệp

Cũng cảm ơn bạn bè trong nhóm nghiên cứu, đó là các bạn Khánh Huyền, Noknoy,

Winly và Hương Giang Cảm ơn các bạn vì mình sẽ không thể hoàn thành được khóa luận

nếu không có sự giúp đỡ nhiệt tình từ các bạn Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, người thân đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, Ngày 25 tháng 05 năm 2024 Sinh viên

Dewlavanh Douangsonthi

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH

1.3.2 Kỹ thuật điều chế cao đặc 7

1.3.3 Các phương pháp chiết xuất 7

1.3.4 Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất: 7

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực 18

2.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa Đu đủ đực 18

2.2.3 Điều cao đặc giàu rutin từ hoa Đu đủ đực quy mô 50g/mẻ dựa trên các thông số đã khảo sát 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực 18

2.3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ

hoa đu đủ đực 21

2.3.3 Điều chế cao đặc theo các thông số quy trình 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký 23

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng rutin toàn phần trong dược liệu 23

3.3 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 28

3.3.1 Khảo sát nồng độ dung môi ethanol 28

3.3.2 Khảo sát nhiệt độ chiết 29

3.3.3 Khảo sát thời gian chiết 30

3.4 Kết quả điều chế cao đặc hoa đu đủ đực giàu rutin 31

3.4.1 Kết quả hiệu suất điều chế cao đặc hoa đu đủ đực 32

3.4.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc điều chế được 32

3.5 Bàn luận 34

3.5.1 Về phương pháp định lượng rutin từ hoa đu đủ đực 34

3.5.2 Về nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất rutin toàn phần từ hoa Đu đủ đực 34

3.5.3 Về kết quả điều chế cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực 36

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

4.1 Kết luận 37

4.1.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong hoa đu đủ đực 37

4.1.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực từ đó điều chế cao đặc mẻ 50g theo các thông số quy trình đã khảo sát: 37

4.1.3 Khảo sát 1 số chỉ tiêu cao đặc hoa đu đủ đực đã điều chế được: 37

4.2 Đề xuất 37

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DPPH 2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50 Half-maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% đối tượng

thử mg QE/g dry

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự phù hợp của hệ thống 24

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 25

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian của rutin 26

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng 27

Bảng 3.5 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực 28

Bảng 3.6 Kết quả tính hiệu suất điều chế cao 32

Bảng 3.7 Kết quả chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô 32

Bảng 3.8 Kết quả định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực mẻ 50g 33

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của loài Carica papaya Linn [18] 3

Hình 1 2 Khung cấu trúc của một số flavonoid gặp trong loài C papaya Linn 3

Hình 1 3 Công thức cấu trúc hóa học của hợp chất rutin 5

Hình 1.4 Bột rutin (nguồn Underextract.vn) 5

Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu……… 16

Hình 3 1 Kết quả độ đặc hiệu………24

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của rutin 26

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn khả năng chiết rutin theo nồng độ EtOH 29

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn khả năng chiết rutin theo nhiệt độ 30

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn khả năng chiết rutin theo thời gian chiết 31

Hình 3.6 Hình ảnh cao đặc điều chế được 32

Hình 3.7 Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254nm (A), 366nm (B) 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây đu đủ có tên khoa học là Carica papaya L thuộc họ Đu đủ (Caricaceae) gồm

có ba loại: loại đu đủ cái cho quả, loại đu đủ đực cho hoa và loại đu đủ lưỡng tính cho cả hoa và quả Trong đó, hoa đu đủ đực là một dược liệu quý được sử dụng từ lâu trong

y học cổ truyền với công dụng trị ho khan, ho có đờm, ho gà, ho nhiều về đêm và theo

GS TS Đỗ Tất Lợi cũng đưa hoa đu đủ đực vào trong cuốn sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” [6]

Trong nghiên cứu của Dwivedi và công sự (2020), kết quả đã cho thấy hoa đu đủ đực có flavonoid toàn phần khoảng 1,53 mg QE/g của dược liệu khô và có hàm lượng flavonoid cao hơn các bộ phận khác [13] Bên cạnh đó, hợp chất rutin thuộc nhóm flavonoid đã được chứng minh có mặt trong hoa đu đủ đực [9] và nó cũng có những tác dụng liên quan mật thiết đến tác dụng của hoa đu đủ đực như chống oxy hóa, chống viêm [13], [16]

Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào định lượng cụ thể rutin trong hoa đu đủ đực cũng như khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất tới hàm lượng chất này Hiện nay, điều chế cao đang là xu hướng của phát triển dược liệu, do đó việc nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết xuất như thời gian chiết, nhiệt độ chiết và dung môi chiết là rất quan trọng, để từ đó chọn ra thông số tối ưu điều chế cao giàu hoạt chất

Như vậy đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực”

được thực hiện với mục tiêu như sau : 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ

đực 2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất từ đó điều chế cao đặc

chứa rutin từ hoa đu đủ đực

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây đu đủ

1.1.1 Tổng quan về thực vật học

1.1.1.1 Vị trí phân loại

- Tên khoa học: Carica papaya Linn [6]

- Theo “Flowering Plants” (2009) của Takhtajan, cây đu đủ có vị trí phân loại của loài

thực vật được tóm tắt như sau : Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)

Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Bộ: Đu đủ (Caricales)

Họ: Đu đủ (Caricaceae)

Chi: Đu đủ (Carica L.)

- Tên khoa học khác : Carica peltata Hook & Arn., Carica pyriformis Willd…[4]

- Tên Việt Nam: Thù đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua,…[6], [8] - Tên nước ngoài : Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào)…[6]

1.1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái, phân bố và sinh thái

Cây nhỏ cao từ 2-4 m, thân thẳng, không phân nhánh Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1) Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [3], [4], [6], [8]

Cây đu đủ có nguồn gốc Châu Mỹ Họ đu đủ trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [11], [26] phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam có một chi và một loài Ở nước ta, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Các tỉnh trồng nhiều cây đu đủ như Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Quảng Nam, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên [8]

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của loài Carica papaya Linn [18]

Ghi chú: (A) Hoa cái; (B) Hoa lưỡng tính; (C) Hoa đực; (D) Quả và cây cái

(E) Quả lưỡng tính; (F) Cây đực

1.1.2 Tổng quan về thành phần hoá học

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành và xác định được thành phần hóa học của

hoa đu đủ đực Carica papaya Linn bao gồm flavonoid, glycosid, acid phenolic và một

số hợp chất khác Flavonoid là một trong những thành phần quan trọng chiếm tỷ khá cao so với các thành phần còn lại [19]

Trong hoa đu đủ đực đã phân lập được các hợp chất flavonoid như là rutin [9], kaempferol, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside [7], kaempferol-3-O-α-L-

rhamnopyranoside, kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside, quercetin, quercitrin,

quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside, myricitrin [9]

(A) Khung flavonol (B) Khung flavon

Hình 1 2 Khung cấu trúc của một số flavonoid gặp trong loài C papaya Linn

Ngoài ra còn một số hợp chất hóa học khác trong hoa đu đủ đực thuộc nhóm glycosid, sterol, nhóm phenolic [9]

1.1.3 Tác dụng dược lý 1.1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2018, Sianipar Masria và cộng sự đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của phân đoạn hexan cao chiết hoa đu đủ đực, với giá trị IC50 là 100,81±1,180 µg/ml [24]

Năm 2019, Richelle và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết

từ hoa của loài C papaya Linn bằng phương pháp bắt gốc tự DPPH cho thấy cao chiết

có tác dụng rất tốt với và trong nghiên cứu cũng xác định được trong cao chiết xuất hiện một số hợp chất thuộc nhóm flavonoid như kaempferol, 5-methyl kaempferol, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosid, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid, kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranosid, rutin, quercetin Nghiên cứu đã chỉ ra rằng do

trong cao có nhóm flavanol và flavon là nhóm hợp chất chính có chịu trách nghiệm cho tác dụng chống oxy hóa [17]

Năm 2022, Muhamad và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và CUPRAC của cao chiết ethanol của quả (vỏ, thịt và hạt) thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh Đối với phương pháp DPPH có IC50 là 1,91µg/mL, đối với phương pháp CUPRAC có IC50 là 1,28 µg/mL và ngoài ra trong nghiên cứu đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần có khoảng 57,57mg/100g cao chiết [10]

1.1.3.2 Tác dụng sinh học khác

Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng kháng ung thư, kháng viêm,

Năm 2013, nghiên cứu của Senthilvel và cộng sự đã chứng minh cây đu đủ có tác

dụng kháng virus sốt xuất huyết thông qua việc ức chế enzym NS2B-NS3 protease

(enzym rất quan trọng trong quá trình nhân lên của virus), nghiên cứu đã cho thấy do trong cây đu đủ có chứa hợp chất flavonoid như quercetin, kaempferol, rutin, do chúng tạo phức hợp với các enzym trên làm giảm sự nhân lên của virus [23]

Cây đu đủ (quả, lá, hoa) đã chứng minh có tác dụng kháng ung thư gan, ung thư biểu mô, ung thư đại tràng, ung thư phổi, ung thư đại trực tràng là do có nhóm hợp chất rutin, quercetin, myricetin, isorhamnetin, kaempferol [20]

Năm 2013, các nhà khoa học Nigeria đã công bố cao chiết lá cây đu đủ bằng nước được sử dụng để chống viêm và giảm đau, được thử nghiệm trên chuột Kết quả cho thấy cao chiết với liều lượng sử dụng 100 và 200 mg/kg trọng lượng cơ thể đã làm giảm nhẹ các khối viêm đồng thời có tác dụng giảm đau rõ rệt trên trên chuột [21]

1.2 Tổng quan về hợp chất Rutin

1.2.1 Công thức, tính chất

❖ Công thức cấu tạo

- Công thức phân tử: C17H30O19 - Khối lượng phân tử : 610,52 đvC

Theo sự phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl thì hợp chất rutin được xếp vào nhóm flavonol thuộc nhóm Euflavonoid [14], có công thức cấu tạo như sau:

(A) Cấu trúc 2D (B) Cấu trúc 3D

Hình 1 3 Công thức cấu trúc hóa học của hợp chất rutin

Hình 1.4 Bột rutin (nguồn Underextract.vn)

❖ Tính chất [14]

• Tính chất vật lý

− Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc màu vàng hơi lục, để ra ánh sáng có thể màu hơi sẫm lại Kết tinh hình kim vàng nhạt trong nước Rutin khan rất dễ hút ẩm, biến màu nâu ở 125oC, dẻo ở 195-197oC và phân hủy ở nhiệt độ 214-215oC

− Năng suất quay cực [α]23

D = +13,82o − Độ tan: dễ tan trong pyridine, tan trong MeOH, EtOH và các dung dịch kiềm

loãng, hơi tan trong glycerin, khó tan trong isopropanol, thực tế không tan trong nước, aceton, ether, chloroform, benzen Điểm chảy 210oC kèm theo phân hủy − Phổ hấp thụ tử ngoại của hợp chất rutin trong EtOH có cực đại hấp thụ ở bước

sóng 259±1nm và 362,5±1nm, trong MeOH là 359nm

• Tính chất hóa học

- Rutin có cấu trúc là một glycosid nên rất dễ bị phân huỷ bởi enzym trong dược

liệu là rhamnodistase hoặc môi trường acid, nhiệt độ cao, dung dịch kiềm đặc ở

nhiệt độ cao

- Phản ứng với FeCl3 cho màu xanh lục

- Phản ứng với H2SO4 đậm đặc cho màu vàng đậm

1.2.2 Tác dụng sinh học của rutin [16]

- Chống oxy hóa - Kháng khuẩn - Chống viêm - Chống ung thư - Chống đái tháo đường - Chống dị ứng

1.3 Phương pháp điều chế cao đặc

1.3.1 Khái niệm

Theo Dược điển Việt Nam V, cao thuốc là những chế phẩm được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định dịch chiết thu được từ dược liệu, thực vật hay động vật với dung môi thích hợp Theo thể chất, cao dược liệu được phân thành 3 loại:

Cao lỏng, cao đặc và cao khô Trong đó, cao đặc có thể chất đặc quánh Tỉ lệ dung môi còn lại trong cao đặc thường không quá 20% [1]

1.3.2 Kỹ thuật điều chế cao đặc

Bao gồm các bước như sau [2]:

- Chuẩn bị dược liệu, dung môi - Chiết xuất hoạt chất

- Loại bớt tạp chất - Cô đặc, sấy khô - Điều chỉnh hàm lượng hoạt chất - Hoàn chỉnh chế phẩm

1.3.3 Các phương pháp chiết xuất

Có nhiều cách phân loại, dựa vào những yếu tố khác nhau [2]:

- Dựa vào nhiệt độ: chiết nóng, chiết nguội (chiết ở nhiệt độ thường) - Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha: ngâm, ngấm kiệt

- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp siêu âm, tạo dòng xoáy,

mạch nhịp…

Về phương pháp chiết nóng (ngâm nóng):

• Là phương pháp ngâm có kết hợp với nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thường • Tiến hành: Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu

trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút dịch chiết (lọc, gạn ) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp

• Ưu điểm: Là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền • Nhược điểm:

- Năng suất thấp, thao tác thủ công - Nếu chỉ chiết 1 lần không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu - Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi và thời gian chiết

1.3.4 Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất:

Một số yếu tố thuộc về kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất như là dung môi chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết [2]:

➢ Dung môi chiết

Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất đó là: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt

Về độ phân cực của dung môi, dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và ngược lại

Về độ nhớt và sức căng bề mặt: dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt nhỏ thì dung môi dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại

➢ Thời gian chiết

Nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong dược liệu, nhưng nếu thời gian dài quá, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Cần phải lựa chọn thời gian chiết sao cho phù hợp với thành phần dược liệu,

dung môi, phương pháp chiết xuất ➢ Nhiệt độ chiết

Khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây ra 1 số bất lợi cho quá trình chiết xuất như phá hủy hợp chất kém bền với nhiệt, dịch

chiết nhiều tạp, dung môi dễ bay hơi…

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

- Dược liệu được nghiên cứu là bộ phận hoa đu đủ đực được thu hái tại Huyện

Vilabuly, Tỉnh Savannakhet, CHDCND Lào

- Dược liệu được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng – Khoa Dược

liệu – Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 1) với tên khoa

học là Carica papaya L., họ Đu đủ (Caricaceae), mã giám định HNIP/18809/240

- Khối lượng dược liệu tươi: 4 Kg - Mẫu Hoa đu đủ đực được rửa sạch, phơi sấy ở 55oC trong 24h

- Khối lượng dược liệu khô: 2 Kg - Hàm ẩm của dược liệu hoa đu đủ đực được xác định là 10,45% - Nghiền thành bột, rây qua rây kích thước 1-2mm, bảo quản trong túi sạch kín, sử

dụng để nghiên cứu thành phần hóa học

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Bảng 2.1 Hoá chất, dung môi thí nghiệm

Danh mục Tên hóa chất Nơi sản xuất/nước sản xuất

Chất đối chiếu

Rutin Chất chuẩn Hàm lượng: 98,19%, Số lô CAS:153-18-4

Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd (Trung Quốc)

Dung môi pha chế, chiết xuất, tráng rửa

Nước cất Phòng cung cấp nước cất của trường

Đại học Dược Hà Nội Ethanol 96%

Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu

Danh mục Tên hóa chất Nơi sản xuất/nước sản xuất

Methanol Công ty cổ phần Tập đoàn Hóa chất

Đức Giang

Dung môi triển khai sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

H3PO4 (HPLC)

Hãng Fisher Mỹ Methanol (HPLC)

Acetonitril (HPLC) Nước cất (HPLC) Phòng cung cấp nước cất của trường

Đại học Dược Hà Nội

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ và thiết bị sử dụng STT Dụng cụ và thiết bị Nơi sản xuất/nước

sản xuất

8 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC-10AD Nhật bản

11 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S Nhật bản

Khác

Tủ lạnh bảo quản mẫu, bếp từ, các dụng cụ bằng thủy tinh (bình nón, phễu lọc, bình cầu, bình định mức thể tích khác nhau), Các dụng cụ đo lường (cồn kế,nhiệt kế, pipet, thước mét, …), bông lọc, giấy lọc, giấy bạc, các dụng cụ lưu mẫu và lấy mẫu khác

Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực

Thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao của hoa đu đủ đực bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trên các chỉ tiêu độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, sự phù hợp của hệ thống, độ lặp lại, độ chính xác và độ đúng

2.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa Đu đủ đực

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT): - Thời gian chiết xuất (phút)

- Nhiệt độ chiết xuất (oC) - Nồng độ EtOH trong dung môi chiết xuất (%) (tt/tt) Thông số đánh giá: Hàm lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực (%)

2.2.3 Điều cao đặc giàu rutin từ hoa Đu đủ đực quy mô 50g/mẻ dựa trên các thông số đã khảo sát

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực

2.3.1.1 Xử lý mẫu

Hoa đu đủ đực sau khi thu hái được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 55oC trong 24h Sau đó dược liệu được nghiền nhỏ đến bột thô rây qua rây kích thước 1-2mm Cân chính xác khoảng 10,0000 g dược liệu cho vào bình nón nút mài Thêm 100 mL dung môi khảo sát, dùng đũa thủy tinh trộn đều cho dược liệu thấm đều dung môi trong thời gian 5 phút, đậy nắp và chiết trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định bằng phương pháp chiết nóng Lọc lấy dịch chiết, đem cô và sấy ở 50 – 60oC cho đến cao đặc

Cân chính xác 0,1000g cao đặc vào bình nón có nút mài khô, thêm chính xác 10mL dung môi MeOH Chiết siêu âm 20 phút Cân khối lượng lại và thêm dung môi đến khối lượng ban đầu Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch trong cho vào bình định mức 10mL Bổ sung dung môi MeOH vào đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm, thu được dung dịch thử

Hàm lượng rutin trong cao được tính theo công thức:

X(%) = (S−b).V

a.m.(100−A)x 100 Trong đó:

- X: hàm lượng rutin trong cao đặc (%) - S: diện tích pic rutin trong sắc ký đồ (mAU.s) - b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ rutin và

diện tích pic

- V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 10 mL) - a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ rutin và

- Chọn tốc độ dòng: tiến hành khảo sát trong khoảng 1mL/phút để xác định tốc độ dòng

phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu

- Chọn bước sóng phát hiện: tham khảo tài liệu [5] lựa chọn bước sóng 257nm - Chọn thể tích tiêm: 20 µL

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng

Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [25] về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên

➢ Kiểm tra độ đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác)

Trong HPLC, tính đặc hiệu thể hiện: trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chất cần phân tích trong mẫu đối chiếu và mẫu thử Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp

Tiến hành: tiêm lần lượt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu và dung dịch thử thêm chất đối chiếu vào hệ thống sắc ký, so sánh các sắc ký đồ thu được

Yêu cầu: tại thời gian lưu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền

➢ Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký

Độ phù hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng

Tiến hành: tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và 6 lần dung dịch thử đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSD ≤ 2%

➢ Kiểm tra độ tuyến tính và khoảng xác định

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Kết quả được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r

Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính) Khảo sát nồng độ từ 1 µg/mL đến 1000 µg/mL

Tiến hành: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính

Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 (r > 0,995)

➢ Kiểm tra độ chính xác

Độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu, ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

Tiến hành: tiến hành phân tích trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích của các mẫu trong cùng 1 ngày và liên ngày

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của kết quả định lượng ≤ 3,7% với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1%

➢ Kiểm tra độ đúng

Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực Tiến hành: pha mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu thử, thêm vào mẫu thử những lượng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tỉnh rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất đối chiếu tìm được so với lượng chất đối chiếu thêm vào

Yêu cầu: Với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1%, tỷ lệ thu hồi đạt 95 – 105%

2.3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực

2.3.3.1 Lựa chọn yếu tố khảo sát và thông số đánh giá

Các yếu tố khảo sát:

➢ Nhiệt độ chiết xuất: 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C ➢ Thời gian chiết xuất: 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút ➢ Nồng độ EtOH (tt/tt): Nước, 40%, 50%, 60%, 70%

Thông số đánh giá:

Hàm lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực (%) cũng được tính theo công thức đã trình bày ở mục 2.3.1.1

2.3.3.2 Phương pháp khảo sát

Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)

Các yếu tố thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, nồng độ EtOH lần lượt được khảo sát bằng cách thay đổi các mức giá trị khác nhau của một yếu tố Các yếu tố còn lại sẽ được giữ cố định, không thay đổi giữa các thí nghiệm

2.3.3 Điều chế cao đặc theo các thông số quy trình

2.3.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc giàu rutin

Quy trình điều chế cao đặc hoa Đu đủ đực giàu rutin áp dụng các thông số quy trình lựa chọn áp dụng với quy mô sử dụng 50 g dược liệu

Tiến hành: sấy dược liệu ở nhiệt độ 55oC trong 24h Dược liệu được nghiền nhỏ đến bột thô rây qua rây có kích thước 1-2mm Cân chính xác khoảng 50 g dược liệu cho vào bình nón có nút mài Chiết siêu âm với dung môi ethanol 500mL, trong thời gian và nhiệt độ đã lựa chọn từ khảo sát 2.3.3.1 Lọc thu lấy dịch chiết, đem cô và sấy ở 50 – 60oC cho đến cao đặc

2.3.3.2 Xác định hiệu suất điều chế cao đặc:

Hiệu suất điều chế cao H (%):

H(%)= Khối lượng cao x (100−Hàm ẩm cao)

Khối lượng dược liệu x (100− Hàm ẩm dược liệu ) x 100 Trong đó: Khối lượng (g), Hàm ẩm cao (%), Hàm ẩm dược liệu ban đầu đem chiết (%)

2.3.3.3 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc hoa Đu đủ đực

➢ Tính chất

Mô tả mẫu cao đặc hoa đu đủ về thể chất, màu sắc, mùi vị

➢ Mất khối lượng do làm khô

Cân chính xác khoảng 1,0000 g cao đặc và tiến hành như phụ lục 9.6 DĐVN V bằng

phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Mỗi mẫu cao đặc xác định 3 lần

Yêu cầu: Độ ẩm không quá 20%

➢ Định tính rutin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành như phần xử lý mẫu 2.3.1.1 - Mẫu đối chiếu: Hòa tan rutin 1mg với MeOH 10mL thu được nồng độ 0,1 mg/mL - Chuẩn bị bản mỏng: Sử dụng bản mỏng silicagel 60GF254 (Merck) được hoạt hóa

ở 110oC trong 1 giờ

- Pha động: n-Butanol – acid acetic – nước (4 : 1 : 5 v/v) [1]

- Tiến hành: chấm mẫu lên bản mỏng, triển khai sắc ký Lấy bản mỏng ra ngoài, để

khô ở nhiệt độ phòng Quan sát bản mỏng ở 2 mức: dưới bước sóng 254 nm, bước sóng 366 nm

➢ Định lượng rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Tiến hành chuẩn bị mẫu và chạy sắc ký theo phương pháp đã được thẩm định ở mục 2.3.1.3

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký

Mẫu được tiến hành chiết như được trình bày ở 2.3.1 và chạy HPLC với hệ acetonitril: acid phosphoric 0,1% (18:82) môi triển khai kết quả được đánh giá qua thời gian lưu (t), hệ số kéo đuôi (Tf) khoảng bằng 1

Nhận xét: Với hệ dung môi này pic chính tách đều nhau Thời gian lưu của rutin

15,57 phút, Tf = 0,987 Nên nhóm nghiên cứu quyết định chọn hệ dung môi này cho chương trình dung môi chạy HPLC

Qua khảo sát, điều kiện sắc lựa chọn để định lượng rutin trong hoa Đu đủ đực như sau:

➢ Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 µm) ➢ Pha động: acetonitril: dung dịch acid phosphoric 0,1% = 18 : 82 (khai triển

đẳng dòng) ➢ Tốc độ dòng: 1 ml/ phút ➢ Detector DAD với bước sóng 257nm ➢ Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng rutin toàn phần trong dược liệu

3.2.1 Độ đặc hiệu

Hình ảnh các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu đối chiếu rutin, mẫu thử cao đặc hoa đu đủ đực và mẫu thử cao đặc hoa đu đủ đực thêm đối chiếu được trình bày ở hình3.1

minmAU

025

0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.50

10203040

minmAU

0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.50

10203040

Diện tích pic (µAU.s)

Số đĩa lý thuyết

Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic (µAU.s)

Số đĩa lý thuyết

0255075100125150175200225

Rutin chuẩn Mẫu thử

x: nồng độ rutin (µg/mL)

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ rutin và diện tích pic trong khoảng

nồng độ khảo sát từ 5 µg/mL đến 160 µg/mL