dewlavanh douangsonthi nghiên cứu điều chế cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực từ đó điều chế cao đặc mẻ 50g theo các thông số quy trình đã khảo sát: ..... Tuy nhiên, cho

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây đu đủ

1.1.1 Tổng quan về thực vật học

- Tên khoa học: Carica papaya Linn [6]

- Theo “Flowering Plants” (2009) của Takhtajan, cây đu đủ có vị trí phân loại của loài thực vật được tóm tắt như sau :

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)

Bộ: Đu đủ (Caricales) Họ: Đu đủ (Caricaceae) Chi: Đu đủ (Carica L.)

- Tên khoa học khác : Carica peltata Hook & Arn., Carica pyriformis Willd…[4]

- Tên Việt Nam: Thù đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua,…[6], [8]

- Tên nước ngoài : Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào)…[6]

1.1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái, phân bố và sinh thái

Cây nhỏ cao từ 2-4 m, thân thẳng, không phân nhánh Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1) Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [3], [4], [6], [8]

Cây đu đủ có nguồn gốc Châu Mỹ Họ đu đủ trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [11], [26] phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam có một chi và một loài Ở nước ta, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Các tỉnh trồng nhiều cây đu đủ như Hà Nội, Hưng Yên,

Hà Nam, Vĩnh Phúc, Quảng Nam, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên [8]

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của loài Carica papaya Linn [18]

Ghi chú: (A) Hoa cái; (B) Hoa lưỡng tính; (C) Hoa đực; (D) Quả và cây cái

(E) Quả lưỡng tính; (F) Cây đực

1.1.2 Tổng quan về thành phần hoá học

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành và xác định được thành phần hóa học của hoa đu đủ đực Carica papaya Linn bao gồm flavonoid, glycosid, acid phenolic và một số hợp chất khác Flavonoid là một trong những thành phần quan trọng chiếm tỷ khá cao so với các thành phần còn lại [19]

Trong hoa đu đủ đực đã phân lập được các hợp chất flavonoid như là rutin [9], kaempferol, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside [7], kaempferol-3-O-α-L- rhamnopyranoside, kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside, quercetin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside, myricitrin [9]

Hình 1 2 Khung cấu trúc của một số flavonoid gặp trong loài C papaya Linn

Ngoài ra còn một số hợp chất hóa học khác trong hoa đu đủ đực thuộc nhóm glycosid, sterol, nhóm phenolic [9]

1.1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2018, Sianipar Masria và cộng sự đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của phõn đoạn hexan cao chiết hoa đu đủ đực, với giỏ trị IC50 là 100,81±1,180 àg/ml [24]

Năm 2019, Richelle và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết từ hoa của loài C papaya Linn bằng phương pháp bắt gốc tự DPPH cho thấy cao chiết có tác dụng rất tốt với và trong nghiên cứu cũng xác định được trong cao chiết xuất hiện một số hợp chất thuộc nhóm flavonoid như kaempferol, 5-methyl kaempferol, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosid, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid, kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranosid, rutin, quercetin Nghiên cứu đã chỉ ra rằng do trong cao có nhóm flavanol và flavon là nhóm hợp chất chính có chịu trách nghiệm cho tác dụng chống oxy hóa [17]

Năm 2022, Muhamad và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và CUPRAC của cao chiết ethanol của quả (vỏ, thịt và hạt) thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh Đối với phương pháp DPPH có IC50 là 1,91àg/mL, đối với phương phỏp CUPRAC cú IC50 là 1,28 àg/mL và ngoài ra trong nghiên cứu đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần có khoảng 57,57mg/100g cao chiết [10]

1.1.3.2 Tác dụng sinh học khác

Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng kháng ung thư, kháng viêm,

Năm 2013, nghiên cứu của Senthilvel và cộng sự đã chứng minh cây đu đủ có tác dụng kháng virus sốt xuất huyết thông qua việc ức chế enzym NS2B-NS3 protease

(enzym rất quan trọng trong quá trình nhân lên của virus), nghiên cứu đã cho thấy do trong cây đu đủ có chứa hợp chất flavonoid như quercetin, kaempferol, rutin, do chúng tạo phức hợp với các enzym trên làm giảm sự nhân lên của virus [23]

Cây đu đủ (quả, lá, hoa) đã chứng minh có tác dụng kháng ung thư gan, ung thư biểu mô, ung thư đại tràng, ung thư phổi, ung thư đại trực tràng là do có nhóm hợp chất rutin, quercetin, myricetin, isorhamnetin, kaempferol [20]

Năm 2013, các nhà khoa học Nigeria đã công bố cao chiết lá cây đu đủ bằng nước được sử dụng để chống viêm và giảm đau, được thử nghiệm trên chuột Kết quả cho thấy cao chiết với liều lượng sử dụng 100 và 200 mg/kg trọng lượng cơ thể đã làm giảm nhẹ các khối viêm đồng thời có tác dụng giảm đau rõ rệt trên trên chuột [21]

Tổng quan về hợp chất Rutin

- Khối lượng phân tử : 610,52 đvC

Theo sự phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl thì hợp chất rutin được xếp vào nhóm flavonol thuộc nhóm Euflavonoid [14], có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1 3 Công thức cấu trúc hóa học của hợp chất rutin

Hình 1.4 Bột rutin (nguồn Underextract.vn)

− Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc màu vàng hơi lục, để ra ánh sáng có thể màu hơi sẫm lại Kết tinh hình kim vàng nhạt trong nước Rutin khan rất dễ hút ẩm, biến màu nâu ở 125 o C, dẻo ở 195-197 o C và phân hủy ở nhiệt độ 214-215 o C

− Độ tan: dễ tan trong pyridine, tan trong MeOH, EtOH và các dung dịch kiềm loãng, hơi tan trong glycerin, khó tan trong isopropanol, thực tế không tan trong nước, aceton, ether, chloroform, benzen Điểm chảy 210 o C kèm theo phân hủy

− Phổ hấp thụ tử ngoại của hợp chất rutin trong EtOH có cực đại hấp thụ ở bước sóng 259±1nm và 362,5±1nm, trong MeOH là 359nm

- Rutin có cấu trúc là một glycosid nên rất dễ bị phân huỷ bởi enzym trong dược liệu là rhamnodistase hoặc môi trường acid, nhiệt độ cao, dung dịch kiềm đặc ở nhiệt độ cao

- Phản ứng với FeCl3 cho màu xanh lục

- Phản ứng với H2SO4 đậm đặc cho màu vàng đậm

1.2.2 Tác dụng sinh học của rutin [16]

1.2.3 Các phương pháp xác định

- Đo phổ IR của rutin chế phẩm, so sánh với phổ IR của rutin chuẩn

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng:

- Bằng phương pháp chuẩn độ [1]

- Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao: [15], [22], [5].

Phương pháp điều chế cao đặc

Theo Dược điển Việt Nam V, cao thuốc là những chế phẩm được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định dịch chiết thu được từ dược liệu, thực vật hay động vật với dung môi thích hợp Theo thể chất, cao dược liệu được phân thành 3 loại:

7 Cao lỏng, cao đặc và cao khô Trong đó, cao đặc có thể chất đặc quánh Tỉ lệ dung môi còn lại trong cao đặc thường không quá 20% [1]

1.3.2 Kỹ thuật điều chế cao đặc

Bao gồm các bước như sau [2]:

- Chuẩn bị dược liệu, dung môi

- Điều chỉnh hàm lượng hoạt chất

1.3.3 Các phương pháp chiết xuất

Có nhiều cách phân loại, dựa vào những yếu tố khác nhau [2]:

- Dựa vào nhiệt độ: chiết nóng, chiết nguội (chiết ở nhiệt độ thường)

- Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha: ngâm, ngấm kiệt

- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp siêu âm, tạo dòng xoáy, mạch nhịp…

Về phương pháp chiết nóng (ngâm nóng):

• Là phương pháp ngâm có kết hợp với nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thường

• Tiến hành: Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút dịch chiết (lọc, gạn ) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp

• Ưu điểm: Là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền

- Năng suất thấp, thao tác thủ công

- Nếu chỉ chiết 1 lần không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu

- Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi và thời gian chiết

1.3.4 Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất:

Một số yếu tố thuộc về kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất như là dung môi chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết [2]:

Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất đó là: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt

Về độ phân cực của dung môi, dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và ngược lại

Về độ nhớt và sức căng bề mặt: dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt nhỏ thì dung môi dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại

Nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong dược liệu, nhưng nếu thời gian dài quá, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Cần phải lựa chọn thời gian chiết sao cho phù hợp với thành phần dược liệu, dung môi, phương pháp chiết xuất

Khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây ra 1 số bất lợi cho quá trình chiết xuất như phá hủy hợp chất kém bền với nhiệt, dịch chiết nhiều tạp, dung môi dễ bay hơi…

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị

- Dược liệu được nghiên cứu là bộ phận hoa đu đủ đực được thu hái tại Huyện Vilabuly, Tỉnh Savannakhet, CHDCND Lào

- Dược liệu được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng – Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 1) với tên khoa học là Carica papaya L., họ Đu đủ (Caricaceae), mã giám định HNIP/18809/240

- Khối lượng dược liệu tươi: 4 Kg

- Mẫu Hoa đu đủ đực được rửa sạch, phơi sấy ở 55 o C trong 24h

- Khối lượng dược liệu khô: 2 Kg

- Hàm ẩm của dược liệu hoa đu đủ đực được xác định là 10,45%

- Nghiền thành bột, rây qua rây kích thước 1-2mm, bảo quản trong túi sạch kín, sử dụng để nghiên cứu thành phần hóa học

Bảng 2.1 Hoá chất, dung môi thí nghiệm

Danh mục Tên hóa chất Nơi sản xuất/nước sản xuất

Rutin Chất chuẩn Hàm lượng: 98,19%,

Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd (Trung Quốc)

Dung môi pha chế, chiết xuất, tráng rửa

Nước cất Phòng cung cấp nước cất của trường Đại học Dược Hà Nội Ethanol 96%

17 Danh mục Tên hóa chất Nơi sản xuất/nước sản xuất

Methanol Công ty cổ phần Tập đoàn Hóa chất Đức Giang

Dung môi triển khai sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hãng Fisher Mỹ Methanol (HPLC)

Nước cất (HPLC) Phòng cung cấp nước cất của trường Đại học Dược Hà Nội

Các hóa chất khác Trung quốc

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ và thiết bị sử dụng

STT Dụng cụ và thiết bị Nơi sản xuất/nước sản xuất

1 Tủ sấy Shellab, Tủ sấy Memmert Đức

2 Bếp cách thủy Memmert Đức

3 Bếp bảo ôn model WHM12014 Hàn Quốc

4 Tủ hút phòng thí nghiệm Fume hood Việt Nam

5 Máy ly tâm HermLe Z207A Đức

6 Bể siêu âm Elmasonic S 100H Đức

7 Máy cô quay chân không Đức

8 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC-10AD Nhật bản

9 Máy xay dược liệu DQF-200 Trung quốc

10 Máy ly tâm Hermle Z207A Đức

11 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S Nhật bản

Tủ lạnh bảo quản mẫu, bếp từ, các dụng cụ bằng thủy tinh

(bình nón, phễu lọc, bình cầu, bình định mức thể tích khác nhau), Các dụng cụ đo lường (cồn kế,nhiệt kế, pipet, thước mét, …), bông lọc, giấy lọc, giấy bạc, các dụng cụ lưu mẫu và lấy mẫu khác

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực

Thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao của hoa đu đủ đực bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trên các chỉ tiêu độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, sự phù hợp của hệ thống, độ lặp lại, độ chính xác và độ đúng

2.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa Đu đủ đực

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT):

- Thời gian chiết xuất (phút)

- Nồng độ EtOH trong dung môi chiết xuất (%) (tt/tt)

Thông số đánh giá: Hàm lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực (%)

2.2.3 Điều cao đặc giàu rutin từ hoa Đu đủ đực quy mô 50g/mẻ dựa trên các thông số đã khảo sát

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực

Hoa đu đủ đực sau khi thu hái được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 55 o C trong 24h Sau đó dược liệu được nghiền nhỏ đến bột thô rây qua rây kích thước 1-2mm Cân chính xác khoảng 10,0000 g dược liệu cho vào bình nón nút mài Thêm 100 mL dung môi khảo sát, dùng đũa thủy tinh trộn đều cho dược liệu thấm đều dung môi trong thời gian 5 phút, đậy nắp và chiết trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định bằng phương pháp chiết nóng Lọc lấy dịch chiết, đem cô và sấy ở 50 – 60 o C cho đến cao đặc

Cân chính xác 0,1000g cao đặc vào bình nón có nút mài khô, thêm chính xác 10mL dung môi MeOH Chiết siêu âm 20 phút Cân khối lượng lại và thêm dung môi đến khối lượng ban đầu Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch trong cho vào bình định mức 10mL Bổ sung dung mụi MeOH vào đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm, thu được dung dịch thử

Hàm lượng rutin trong cao được tính theo công thức:

- X: hàm lượng rutin trong cao đặc (%)

- S: diện tích pic rutin trong sắc ký đồ (mAU.s)

- b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ rutin và diện tích pic

- V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 10 mL)

- a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ rutin và diện tích pic

2.3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: Cột C18 Inertsustain GL Sciences (250 ì 4,6 mm; 5 àm)

- Chọn pha động: Tham khảo 1 số tài liệu [15], [22]

- Chọn tốc độ dòng: tiến hành khảo sát trong khoảng 1mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu

- Chọn bước sóng phát hiện: tham khảo tài liệu [5] lựa chọn bước sóng 257nm

- Chọn thể tớch tiờm: 20 àL

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng

Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [25] về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên

➢ Kiểm tra độ đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác)

Trong HPLC, tính đặc hiệu thể hiện: trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chất cần phân tích trong mẫu đối chiếu và mẫu thử Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp

Tiến hành: tiêm lần lượt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu và dung dịch thử thêm chất đối chiếu vào hệ thống sắc ký, so sánh các sắc ký đồ thu được

Yêu cầu: tại thời gian lưu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền

➢ Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký Độ phù hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý

20 Tiến hành: tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và 6 lần dung dịch thử đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

➢ Kiểm tra độ tuyến tính và khoảng xác định Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Kết quả được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r

Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tớnh) Khảo sỏt nồng độ từ 1 àg/mL đến 1000 àg/mL

Tiến hành: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính

➢ Kiểm tra độ chính xác Độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu, ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

Tiến hành: tiến hành phân tích trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích của các mẫu trong cùng 1 ngày và liên ngày

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của kết quả định lượng ≤ 3,7% với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1%

➢ Kiểm tra độ đúng Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực Tiến hành: pha mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu thử, thêm vào mẫu thử những lượng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tỉnh rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất đối chiếu tìm được so với lượng chất đối chiếu thêm vào

21 Yêu cầu: Với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1%, tỷ lệ thu hồi đạt 95 – 105%

2.3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực

2.3.3.1 Lựa chọn yếu tố khảo sát và thông số đánh giá

Các yếu tố khảo sát:

➢ Thời gian chiết xuất: 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút

➢ Nồng độ EtOH (tt/tt): Nước, 40%, 50%, 60%, 70%

Hàm lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực (%) cũng được tính theo công thức đã trình bày ở mục 2.3.1.1

Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)

Các yếu tố thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, nồng độ EtOH lần lượt được khảo sát bằng cách thay đổi các mức giá trị khác nhau của một yếu tố Các yếu tố còn lại sẽ được giữ cố định, không thay đổi giữa các thí nghiệm

2.3.3 Điều chế cao đặc theo các thông số quy trình

2.3.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc giàu rutin

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký

Mẫu được tiến hành chiết như được trình bày ở 2.3.1 và chạy HPLC với hệ acetonitril: acid phosphoric 0,1% (18:82) môi triển khai kết quả được đánh giá qua thời gian lưu (t), hệ số kéo đuôi (Tf) khoảng bằng 1

Nhận xét: Với hệ dung môi này pic chính tách đều nhau Thời gian lưu của rutin

15,57 phút, Tf = 0,987 Nên nhóm nghiên cứu quyết định chọn hệ dung môi này cho chương trình dung môi chạy HPLC

Qua khảo sát, điều kiện sắc lựa chọn để định lượng rutin trong hoa Đu đủ đực như sau:

➢ Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 àm)

➢ Pha động: acetonitril: dung dịch acid phosphoric 0,1% = 18 : 82 (khai triển đẳng dòng)

➢ Tốc độ dòng: 1 ml/ phút

➢ Detector DAD với bước sóng 257nm

➢ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL

Thẩm định phương pháp định lượng rutin toàn phần trong dược liệu

Hình ảnh các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu đối chiếu rutin, mẫu thử cao đặc hoa đu đủ đực và mẫu thử cao đặc hoa đu đủ đực thêm đối chiếu được trình bày ở hình3.1 min mAU

(a) mẫu trắng (b) mẫu đối chiếu min mAU

(c) mẫu thử (d) mẫu thử thêm chuẩn min mAU

- Các pic rutin trong mẫu đối chiếu, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn đều cân xứng

- Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic rutin trong mẫu đối chiếu

- Sắc ký đồ của mẫu thử có pic có thời gian lưu tương đương với pic rutin trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu Ngoài ra, pic rutin tách hoàn toàn khỏi pic tạp

- Khi thêm mẫu đối chiếu rutin vào mẫu thử thì diện tích và chiều cao pic rutin tăng và không có pic lạ

- Phổ của pic trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và pic tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu thử cho kết quả hệ số chồng phổ đạt (0,9986>0,99)

Vậy có thể kết luận phương pháp định lượng rutin có độ đặc hiệu cao.

3.2.2 Sự phù hợp của hệ thống

Kết quả thời gian lưu và diện tích pic của 6 lần tiêm mẫu chuẩn rutin vào hệ thống sắc ký, trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự phù hợp của hệ thống

Hình 3 1 Kết quả độ đặc hiệu

Nhận xét : Độ lệch chuẩn (RSD) tương đối của thời gian lưu, diện tích và hệ số đĩa lý thuyết của rutin lần lượt là 0,14%, 0,96% và 1,18% và của mẫu thử có giá trị RSD lần lượt là 0,61%, 1,30% và 1,40% Các giá trị RSD thu được đều ≤ 2,0%, do, do hệ thống sắc ký có độ tương thích hệ thống tốt, phù hợp để định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực

Diện tích pic và phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ rutin đối chiếu và diện tích pic được trình bày ở bảng 3.2 ở bảng và hình 3.2

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính

STT Nồng độ rutin (àg/mL) Thời gian lưu (phỳt) Diện tớch pic (mAU.s)

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 36342x - 20687

R 2 = 0,9999 (r = 0,9999) trong đó: y: Diện tích pic (mAU.s) x: nồng độ rutin (àg/mL) Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ rutin và diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sỏt từ 5 àg/mL đến 160 àg/mL

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của rutin

Diện tích pic và nồng độ rutin có sự tương quan tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số xác định R 2 = 0,9999 (r = 0,9999), thỏa mãn điều kiện 0,99 ≤ R 2 ≤ 1 theo yêu cầu của AOAC

Kết quả diện tích pic và hàm lượng rutin trong cao đặc trong 2 ngày, mỗi ngày khảo sát 6 mẫu, với hàm ẩm là 9,35% được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian của rutin

Hàm lượng rutin trung bình từ 12 lần định lượng của 2 ngày: 0,1061%; RSD = 2,92%

Từ kết quả ở bảng 3.3, giá trị RSD của rutin của mỗi ngày định lượng và của cả 2 ngày đều ≤ 3,7%, đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC [13] Như vậy, phương pháp định y = 36342x - 20687 R² = 0.9999

Nồng độ rutin (àg/mL)

27 lượng rutin toàn trong dược liệu hoa đu đủ đựcđực bằng HPLC đạt yêu cầu về độ lặp lại và độ chính xác

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng rutin toàn phần trong dược liệu hoa đu đủ đựcđực được trình bày bảng 3.3

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng

Lượng trong mẫu thử (mg)

Lượng chất đối chiếu thêm vào (mg)

Lượng trong mẫu thử thêm chuẩn (mg)

Nhận xét : Ở 3 nồng độ khác nhau, % tìm lại chất chuẩn rutin dao động tử 99,4% đến 103,96% Độ thu hồi này có cao hơn so với yêu cầu của AOAC đối với phương pháp thẩm định này (95 – 105%) [13]

Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng rutin toàn phần trong cao đặc hoa đu đủ đực trong bảng 3.4

Bảng 3.5 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực

Tiêu chuẩn Kết quả Độ đặc hiệu Pic rutin cân xứng

Pic ở mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm đối chiếu có tR giống nhau, mẫu thử thêm đối chiếu có diện tích pic lớn hơn mẫu đối chiếu

Sự phù hợp của hệ thống

Hệ số đĩa lý thuyết: RSD = 1,18%

Hệ số đĩa lý thuyết: RSD = 1,40% Độ tuyến tính y = 36342x – 20687

R 2 = 0,9999 (r = 0,9999) Độ chính xác Giữa các ngày : RSD = 2,92%

Ngày 2: RSD = 3,17% Độ đúng Tỷ lệ thu hồi 99,40% đến 103,96% nằm trong khoảng từ 95% đến

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, sự phù hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác và độ đúng.

Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

Khảo sát ảnh hưởng của lần lượt 3 yếu tố nồng độ EtOH, nhiệt độ chiết xuất và thời gian chiết xuất đến quá trình chiết xuất bằng phương pháp OFAT Thông số đánh giá là hàm lượng rutin (%) trong cao đặc hoa đu đủ đựcđực

Kết quả khảo sát các yếu tố như sau :

3.3.1 Khảo sát nồng độ dung môi ethanol

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết ethanol với các giá trị lần lượt 0, 40, 50, 60, 70 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 (g/ml), nhiệt độ chiết ở 70 C, thời gian chiết trong 30 phút, chết 1 lần

29 Kết quả được trình bày ở hình 3.3

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn khả năng chiết rutin theo nồng độ EtOH

Nồng độ EtOH tăng dần từ 0% đến 70%, hàm lượng rutin tăng dần từ 0,059% - 0,111% Ở các nồng độ EtOH 0% đến 40%, khả năng chiết rutin rất thấp và tăng không đáng kể, điều này có thể do dung môi EtOH ở các nồng độ 0% đến 40% có độ phân cực lớn và không phù hợp với độ phân cực của rutin Từ các dung môi EtOH có nồng độ 50% đến 70%, khả năng chiết hoạt chất rutin tăng mạnh, với EtOH 70% cho thấy khả năng chiết rutin tốt nhất

Kết quả trên có thể được giải thích theo độ hòa tan của rutin, do rutin tan tốt trong EtOH và không tan trong nước nên khi tăng dần tỷ lệ EtOH : nước trong dung môi chiết thì độ phân cực của dung môi chiết cũng giảm dần và gần với độ phân cực của rutin trong hoa đu đủ đực Thêm vào đó EtOH cao độ cũng hạn chế chiết các tạp chất thân nước, giúp làm tăng nồng độ rutin trong cao đặc Hơn nữa, ethanol 70% cũng là một dung môi rất dễ thu hồi, do đó được lựa chọn làm dung môi chiết

3.3.2 Khảo sát nhiệt độ chiết

Tiến hành khảo sát nhiệt độ chiết xuất với các giá trị lần lượt là 40°C, 50°C, 60°C, 70°C và 80°C Các thông số khác được cố định bao gồm: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 (g/ml), dung môi chiết xuất là ethanol 70%, thời gian chiết 30 phút, chiết 1 lần

Kết quả được thể hiện ở hình 3.4 dưới đây

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn khả năng chiết rutin theo nhiệt độ

Kết quả phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng rutin cho thấy, rutin trong cao đặc tăng nhanh khi tăng nhiệt độ từ 40C đến 70C và đạt cực đại ở nhiệt độ 70C (0,111%) Thí nghiệm của Azahar và cộng sự [12] cũng giải thích rằng hiện tượng này do nhiệt độ cao các phần tử chuyển động nhanh hơn làm cho mô thực vật bị vỡ và do đó cho phép dung môi hòa tan cao hơn cho đến khi nhiệt độ đạt đến khoảng nhiệt độ tối ưu thì dừng lại Tuy nhiên ở nhiệt độ 80C thì rutin có xu hướng giảm đi, có thể nhiệt độ cao làm phân hủy rutin Vì vậy, nhiệt độ chiết thích hợp được chọn ở đây là 70C cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.3 Khảo sát thời gian chiết

Tiến hành khảo sát thời gian chiết xuất với các giá trị lần lượt là 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75phút và 90phút Các thông số khác được cố định bao gồm: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10, dung môi chiết xuất là ethanol 70%, nhiệt độ chiết xuất 70 o C, chiết 1 lần

Kết quả được thể hiện ở hình 3.5 dưới đây:

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn khả năng chiết rutin theo thời gian chiết

Quan sát kết quả nghiên cứu cho thấy kéo dài thời gian chiết xuất đến 30 phút thì rutin trong dung môi có hàm lượng cao nhất (0,110%) Tuy nhiên, khi thời gian chiết trên

30 phút thì hàm lượng flavonoid có xu hướng giảm dần Điều này cũng có thể giải thích rằng thời gian chiết càng dài thì hàm lượng sản phẩm thu nhận được càng cao, nhưng đến một thời điểm nhất định thì hàm lượng sản phẩm thu được tăng lên không đáng kể hoặc có thể giảm đi, do có thể một số hợp chất bị phân hủy Bên cạnh đó việc kéo dài thời gian trích ly sẽ tốn chi phí, tốn thời gian và có thể ảnh hưởng đến hoạt chất flavonoid Do đó, trong khóa luận này thời gian chiết 30 phút sẽ được chọn là điều kiện tốt để chiết xuất.

Kết quả điều chế cao đặc hoa đu đủ đực giàu rutin

Từ các kết quả khảo sát trên, các thông số được lựa chọn để điều chế cao đặc mẻ 50g hoa Đu đủ đực như sau:

➢ Nhiệt độ sấy: 50oC, thời gian sấy: 24h

➢ Kích thước bột dược liệu : 1-2mm

➢ Phương pháp chiết: Chiết nóng

3.4.1 Kết quả hiệu suất điều chế cao đặc hoa đu đủ đực

Bảng 3.6 Kết quả tính hiệu suất điều chế cao

Dược liệu Khối lượng dược liệu (g)

Khối lượng cao thu được (g)

Hiệu suất điều chế cao (%)

Hàm ẩm dược liệu = 10,45%, hàm ẩm cao = 9,35%

3.4.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc điều chế được

Hình 3.6 Hình ảnh cao đặc điều chế được

Nhận xét: Thể chất cao mịn, đặc quánh, có màu nâu đen, có mùi thơm và vị đắng chát

3.4.2.2 Mất khối lượng do làm khô

Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 dưới đây:

Bảng 3.7 Kết quả chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô

Lần đo Khối lượng cao trước khi sấy (g)

Khối lượng cao sau khi sấy (g) Độ ẩm (%) Độ ẩm trung bình (%)

Nhận xét: Mẫu cao đạt chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô (9,35% < 20%)

3.4.2.3 Định tính rutin trong cao bằng sắc ký lớp mỏng

Kết quả thu được trong hình 3.7

Hình 3.7 Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254nm (A), 366nm (B)

Nhận xét: Quan sát ở bước sóng 254 nm và 366 nm đều cho thấy: trên sắc ký đồ của dung dịch thử của mẫu cao đều xuất hiện vết có màu sắc và Rf tương đương với vết rutin đối chiếu Hợp chất rutin có Rf ≈ 0,55 và tách ra khỏi các vết khác trên sắc ký đồ

=> Hệ dung môi này có thể sử dụng để định tính rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực

3.4.2.4 Định lượng rutin trong cao đặc

Kết quả được trình bày trong bảng dưới đây

Bảng 3.8 Kết quả định lượng rutin trong cao đặc hoa đu đủ đực mẻ 50g

Lần Khối lượng cao (g) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng rutin (%)

34 Nhận xét: Khi tăng quy mô tạo cao từ mẻ 10g đến 50g, hàm lượng rutin trong cao thay đổi từ 0,110% với mẻ 10g và 0,1034% với mẻ 50g Khi điều chế cao ở mẻ 50g, hàm lượng rutin chiếm 94% so với mẻ 10g Chứng tỏ tăng quy mô tạo cao, hàm lượng rutin bị ảnh hưởng 1 phần.

Bàn luận

3.5.1 Về phương pháp định lượng rutin từ hoa đu đủ đực

Tham khảo các tài liệu, tiến hành khảo sát và kết quả điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:

• Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 àm)

• Pha động: Acetonitril: dung dịch acid phosphoric 0,1% = 18: 82

• Tốc độ dòng: 1mL/ phút

• Detector DAD với bước sóng 257 nm

• Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL

Quá trình thẩm định phương pháp định lượng rutin trong cao hoa đu đủ đực về tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng đều đạt giới hạn yêu cầu Điều này cho thấy các điều kiện sắc ký được lựa chọn là phù hợp

3.5.2 Về nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất rutin toàn phần từ hoa Đu đủ đực

❖ Nồng độ ethanol trong dung môi

Về lựa chọn dung môi chiết xuất, ethanol là dung môi có giá thành phù hợp, có thể thu hồi và được ứng dụng nhiều trong công nghiệp Mặt khác, ethanol có thể được điều chỉnh độ phân cực phù hợp với hoạt chất cần chiết bằng cách thay đổi tỷ lệ ethanol và nước

Do đó, nghiên cứu đã lựa chọn ethanol làm dung môi khảo sát

Thành phần tạp chất trong dược liệu có cấu trúc phức tạp với nhiều hợp chất khác nhau, nghiên cứu nồng độ ethanol để tìm ra dung môi có khoảng phân cực thích hợp với cấu trúc và tỷ lệ các thành phần trong tạp chất trong hoa đu đủ đực, giúp chiết xuất hoạt chất tối đa và tạp chất tối thiểu

Nghiên cứu chỉ khảo sát đến nồng độ ethanol 70% do ở nồng độ ethanol cao hơn khó ứng dụng quy mô công nghiệp vì khả năng gây cháy nổ và gia tăng giá thành

Tăng nhiệt độ chiết xuất có tác dụng làm giảm độ nhớt và sức căng bề mặt, từ đó tăng tính thấm dung môi vào tế bào dược liệu, đồng thời tăng độ tan và tốc độ khuếch tán

35 hoạt chất từ dược liệu ra môi trường, giúp tăng tốc độ chiết và tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên, nhiệt độ tăng gây một số bất lợi như phá hủy hoạt chất kém bền với nhiệt, đồng thời tăng độ tan tạp chất khiến địch chiết nhiều tạp Bên cạnh đó, nhiệt độ cao làm bay hơi dung môi ethanol (mặc dù chiết bằng bình thủy tỉnh có đậy nắp kín nhưng vẫn bay hơi dung môi và đọng ở nắp), làm giảm độ tan hoạt chất và giảm hiệu suất chiết Trong sản xuất công nghiệp với dung môi có ethanol, nhiệt độ chiết xuất càng cao thì thiết bị cần có yêu cầu kỹ thuật phức tạp để đảm bảo an toàn

Vì vậy, nhiệt độ chiết xuất có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, nên được chọn là một trong những yếu tố để nghiên cứu ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất Kết quả là, tại nhiệt độ 70°C, hiệu suất chiết rutin từ hoa Đu đủ đực là cao nhất, khi tăng nhiệt độ lên 80°C, hiệu suất chiết giảm Kết quả này phù hợp với lý thuyết đã được trình bày ở trên

Thông thường, hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu ra môi trường Khi đạt cân bằng chiết (hàm lượng hoạt chất trong dược liệu cân bằng với môi trường) quá trình khuếch tán sẽ dừng lại Lúc này, hiệu suất chiết sẽ cao nhất Ngoài ra, hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn tạp chất nên khuếch tán nhanh hơn và đạt cân bằng chiết sớm hơn Nên nếu thời gian chiết quá lâu, hàm lượng hoạt chất chiết được không tăng mà còn tăng tỉ lệ tạp chất, đồng thời tăng nguy cơ phân hủy hoạt chất kém bền, gây ảnh hưởng đến chất lượng cao

Do đó, cần khảo sát thời gian chiết xuất tối ưu để thu được cao đặc có hàm lượng và chất lượng cao Kết quả cho thấy, thời gian chiết xuất 30 phút cho hiệu suất chiết rutin toàn phần cao nhất, kéo dài thời gian chiết hiệu suất chiết giảm, phù hợp với lý thuyết

❖ Về kích thước dược liệu:

Ngoài ra, kích thước dược liệu cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chiết rutin toàn phần Chia nhỏ được liệu làm tăng diện tích tiếp xúc giữa được liệu và dung môi, làm giảm quãng đường khuếch tán, tăng tỉ lệ tế bào bị phá vỡ để tăng tốc độ chiết xuất Vì vậy, kích thước dược liệu nhỏ giúp giảm thời gian chiết, tăng hiệu suất chiết và tiết kiệm dung môi Tuy nhiên, được liệu quá mịn dễ bết dính và vón cục, khó thẩm dung môi, khó khuấy trộn và khó rút dịch chiết, dẫn đến giảm hiệu suất chiết

Trong thực tế, dược liệu hoa Đu đủ đực có thể chất giòn rất dễ nghiền nhỏ, tạo thành bột nữa thô Việc xay để tạo kích thước mịn vừa tốn công vừa gây bất lợi trong quá trình chiết xuất và thu dịch chiết Do đó, đề tài không khảo sát ảnh hưởng của kích thước được liệu đến hiệu suất chiết rutin toàn phần mà sử dụng kích thước bột nửa thô để tiến hành khảo sát

3.5.3 Về kết quả điều chế cao đặc giàu rutin từ hoa đu đủ đực

Tiến hành điều chế cao giàu rutin từ hoa đu đủ đực với mẻ 50g đã đạt các chỉ tiêu về tính chất, mất khối lượng do làm khô, định tính Kết quả định lượng cho thấy khi nâng cấp quy mô từ mẻ 10g lên 50g, hàm lượng rutin giảm đi và bị ảnh hưởng