nguyễn thị khánh huyền khảo sát sự biến đổi hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân từ hoa đu đủ đực hỏa chế

Cùng với đó, em không thể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp nếu không có

sự giúp đỡ nhiệt tình từ các bạn Đào Việt Quốc, Nguyễn Thị Hương Giang, Noknoy Phaengmixay, Dewlavanh, Winly, Hoàng Mai Anh, Ngô Thùy Dung, Phạm Thị Bích Đào cùng các em Trần Thu Trang và Phạm Thị Tuyết Cảm ơn các bạn, các em

rất nhiều vì đã cùng đồng hành, động viên, trao đổi kiến thức, giúp đỡ mình trong suốt quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn giúp đỡ, cổ vũ em vượt qua mọi khó khăn trong 5 năm học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức bản thân còn hạn chế nên khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý, chỉnh sửa của quý thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thị Khánh Huyền

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNGDANH MỤC CÁC HÌNHDANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG1.TỔNGQUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Đu đủ 2

1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại 2

1.6 Một số ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất quercetin 11

CHƯƠNG2.ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 12

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 12

2.2 Thuốc thử, hóa chất 13

2.3 Nội dung nghiên cứu 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực 16

CHƯƠNG3.THỰCNGHIỆM,KẾTQUẢVÀBÀNLUẬN 18

3.1 Kết quả định tính quercetin tạo ra khi thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng 18

3.1.1 Định tính quercetin bằng sắc ký lớp mỏng 18

3.2 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi

thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực 18

3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 18

3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực 19

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong hoa đu đủ đực 25

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế tới hàm lượng quercetin trong dịch chiết hoa đu đủ đực 25

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin sau khi thủy phân trong hoa đu đủ đực 26

4.1.1 Định tính quercetin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng: 32

4.1.2 Định lượng quercetin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 32

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra sau hỏa chế trong dịch chiết hoa đu đủ đực 32

4.2 Đề xuất 32

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Điều kiện sắc ký lớp mỏng định tính quercetin 9

Bảng 1.2 Điều kiện sắc ký lớp lỏng hiệu năng cao định lượng quercetin 10

Bảng 2.1 Các điều kiện khảo sát của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết tới HL quercetin tạo ra khi thủy phân 16

Bảng 3.1 Kết quả độ phù hợp hệ thống……….20

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 22

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác với quercetin 23

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng với quercetin 24

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hoa và quả của đu đủ đực, cái và lưỡng tính 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 1 số flavonoid trong hoa đu đủ đực 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của benzyl-β-D-glucoside 4

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của 1 số sterol trong hoa đu đủ đực 5

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid palmitic 6

Hình 1 6 Công thức cấu tạo của acid galic và vanillin 6

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của quercetin 9

Hình 2 1 Mẫu nghiên cứu hoa đu đủ đực……….12

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu thử (T), mẫu đối chiếu quercetin (C) quan sát dưới bước sóng 254nm (A), 366nm (B)……… 18

Hình 3.2 Phổ UV của chất đối chiếu quercetin 19

Hình 3.3 Sắc đồ cuả các mẫu trong KS độ phù hợp hệ thống 20

Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu đối chiếu quercetin (B), mẫu thử (C), mẫu thử thêm chất đối chiếu (D), kết quả chồng phổ quercetin (E) 21

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa diện tích pic và nồng độ chất đối chiếu quercetin và kaempferol 22

Hình 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến HL quercetin 25

Hình 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy đến hàm lượng quercetin 26

Hình 3.8 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm quercetin 27

Hình 3.9 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL đến hàm lượng quercetin 28

Hình 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nồng dộ ethanol đến hàm lượng quercetin 28

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

cholesterol

Cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

5 HPTLC High Performance Thin-layer

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

6 TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

concentration

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

cholesterol

Cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp

Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

10 mg GAE/g Milligrams of Gallic acid

equivalent per gram

mg đương lượng acid gallic trên mỗi gam chất khô

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đu đủ Carica papaya Linn thuộc họ Đu đủ (Papayaceae) là một loài cây ăn quả

có nguồn gốc từ vùng châu Mỹ Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng phổ biến ở khắp nơi và thường được biết đến với giá trị thực phẩm và giá trị trong y học

Các bộ phận khác nhau của cây đu đủ như thân, lá và quả được biết đến với công dụng trong hệ thống y học cổ truyền như điều trị sốt rét, sốt xuất huyết, vàng da, điều hòa miễn dịch và hoạt động kháng virus [13] Gần đây, người dân đã sử dụng hoa đu đủ đực để phòng và điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho, khản tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ em

Những năm gần đây, đã có những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của hoa đu đủ đực, trong đó có các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, glycosid, steroid… [6] Cao chiết giàu flavonoid đã được chứng minh tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư [37] Hợp chất quercetin là một flavonoid đã được phân lập trong hoa đu đủ đực có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, do đó có mối liên hệ đến tác dụng dược lý của hoa đu đủ đực [10], [25], [30]

Hiện nay, các nghiên cứu mới dừng lại ở xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong hoa đu đủ đực, chưa có tài liệu nghiên cứu nào xác định cụ thể hàm lượng của quercetin trong hoa đu đủ đực Bên cạnh đó, phương pháp hỏa chế là phương pháp chế biến sử dụng tác động của nhiệt độ trực tiếp hoặc gián tiếp qua các phụ liệu trung gian ở các mức nhiệt độ khác nhau, từ đó làm thay đổi hàm lượng các hoạt chất [1]

Điều chế cao dược liệu đang là xu hướng phát triển dược phẩm Để điều chế được cao giàu hàm lượng hoạt chất, việc khảo sát các thông số chiết xuất cũng như sử dụng phương pháp hỏa chế là điều cần thiết

Với các lý do nêu trên, đề tài “Khảo sát sự biến đổi hàm lượng quercetin tạo ra

khi thủy phân hoa đu đủ đực hỏa chế” đã được thực hiện hai mục tiêu:

Mục tiêu 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Mục tiêu 2 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới

hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Đu đủ

1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Carica papaya Linn [13]

- Tên khác: phiên qua thụ, phiên mộc, mác rẩu, mác vá, cà lào (Tày), má hống (Thái) [13]

- Theo hệ thống phân loại của Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009) [36], đu

đủ thuộc:

Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)

Bộ: Đu đủ (Caricales) Họ: Đu đủ (Caricaceae)

Chi: Đu đủ (Carica L.)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2 - 4m Thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn

Hoa màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc, cụm hoa đực dài, phân nhánh thành chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2 - 3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn

Quả mọng to, hình trứng ngược hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ, hạt nhiều màu đen

Mùa hoa quả: tháng 5 -10 [13]

1.1.3 Phân bố, sinh thái

Về phân bố:

Cây đu đủ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, Nam Mexico và các vùng Trung Mỹ [40] Vào thế kỷ XVI, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribe và một số nước Đông Nam Á Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanka, châu Đại Dương và châu Phi [13]

Cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Các tỉnh trồng nhiều cây đu đủ như Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam,

Vĩnh Phúc, Quảng Nam, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên với giống chủ yếu phổ biến hiện nay là giống đu đủ Đài Loan, một giống lai F1 được nhập từ Đài Loan [9]

Về sinh thái:

Đu đủ là loại cây trồng nhiệt đới, ưa khí hậu nóng và ẩm Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng là 21 – 33oC; lượng mưa hàng năm trên 1200 mm Cây sống được trên nhiều loại đất, song yêu cầu phải thoát nước nhanh Cây trồng từ hạt sau 4 – 5 tháng có thể ra hoa Hoa thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng, do đó, chúng dễ bị lai tạp ở thế hệ sau [13]

Thành phần hóa học trong hoa đu đủ đực (Carica papaya Linn.) gồm các nhóm

chất: flavonoid, phenolic, sterol, nhóm acid hữu cơ và dẫn xuất

1.2.1.1 Nhóm flavonoid

Trong phân đoạn chloroform của hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) đã phân lập

và xác định được cấu trúc của rutin (1) [12] và kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside

(2) [8]

Hình 1.1 Hoa và quả của đu đủ đực, cái và lưỡng tính (A) Hoa cái; (B) hoa lưỡng tính; (C) hoa đực; (D) quả cái; (E) quả lưỡng tính;

(F) cây đực [29]

Kaempferol (3) đã được phát hiện trên cả 2 phân đoạn ethyl acetat và chloroform

hoa cây đu đủ đực thu hái tại địa bàn tỉnh Quảng Nam [3], [8]

Trong dịch chiết hoa và lá cây đu đủ đực, Đỗ Thị Thúy Vân đã phân lập được

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của benzyl-β-D-glucoside

1.2.1.3 Nhóm sterol

Trong dịch chiết hoa, cuống lá đu đủ đực đã phát hiện các hợp chất:

Stigmast-4-en-3-on, β-sitosterol 3-O-β-glucopyranosid [38]; β-sitosterol glucoside (daucosterol) [12]; cholest-5-en-3β,7β-diol, saringosterol, stigmasterol, 3β,7α-dihydroxycholest-5-en [10]

Stigmast-4-en-3-on β-sitosterol 3-O- β-glucopyranosid

1.2.1.4 Nhóm acid hữu cơ và dẫn xuất

Acid palmitic được tìm thấy trong phân đoạn ethyl acetat hoa, cuống lá đu đủ đực [38]

1.2.1.5 Nhóm Phenolic

Các phenolic được tìm thấy trong hoa đu đủ đực là: acid gallic và vanillin [10]

Acid galic Vanillin

1.2.2 Tác dụng dược lý

Do số lượng nghiên cứu về tác dụng dược lý của hoa đu đủ đực còn hạn chế nên nội dung tổng quan về tác dụng dược lý dưới đây tiến hành thu thập các thông tin về tác dụng dược lý của hoa đu đủ (bao gồm cả các nghiên cứu không đề cập rõ giống đực)

1.2.2.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố nghiên cứu cao chiết ethanol của hoa cây đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (IC50 = 55,875 (µg/ml)) [41]

Năm 2020, Võ Thị Ngà và cộng sự đã xác định cao chiết ethanol của lá, hoa, rễ

cây đu đủ cái và cây đu đủ đực cùng các hợp chất stigmast-4-en-3-on,

benzyl-β-D-glucosid, uracil được phân lập từ hoa và cuống lá cây đu đủ đực thu hái tại Bình Định không có tác dụng gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư MCF-7, Hep-G2, HeLa, NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml [38]

Năm 2020, Phan Lê Thảo My và các cộng sự đã thử tác dụng của cao chiết siêu âm của hoa đu đủ đực chống lại tế bào ung thư Hep-G2 và cho thấy tác dụng với giá trị IC50 là 56,63 ± 1,25 μg/ml [37]

Năm 2020, Đỗ Thị Thúy Vân đã xác định có 19/24 hợp chất mới được phân lập có mức hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư ở người (A549, MCF-7 và Hep3B) với giá trị IC50 trong khoảng 26,72 ± 0,76 đến 93,07 ± 5,03 µg/ml [10] Có 7/9 hợp chất mới được phân lập được xác định có mức hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase với giá trị IC50trong khoảng 14,3 ± 2,7 đến 82,1 ± 3,6 µM [10]

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid palmitic

Hình 1 6 Công thức cấu tạo của acid galic và vanillin

1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2018, Sianipar Masria và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa của phân đoạn hexan cao chiết hoa đu đủ đực Kết quả cho thấy phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa với giá trị IC50 là 100,81±1,180 µg/ml [34] Giá trị IC50 thấp phản ánh hoạt tính chống oxy hóa cao

Năm 2020, Phan Lê Thảo My và cộng sự đã tối ưu hóa chiết xuất flavonoid hoa đu đủ đực Việt Nam sử dụng phương pháp siêu âm và thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa của cao chiết đã được tối ưu, cho kết quả với giá trị IC50 là 179,69 ± 0,03 µg/ml [37]

Năm 2022, Halder Shreyasi Dịch thử nghiệm cao chiết methanol của hoa đu đủ ở nồng độ 500 µg/ml cho thấy hoạt tính nhặt gốc tự do tốt với IC50 là 17,47 µg/ml Phân tích hóa thực vật cho thấy hàm lượng phenol cao với giá trị là 108,66 mg GAE/100 g (mg đương lượng acid gallic trên 100 gam chất khô) [24]

1.2.2.3 Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2021, Santoso Dimas Satria Putra và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng

của hoa đu đủ trên 2 chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus Trong

đó, cao chiết ethanol của hoa đu đủ đực được lắc phân bố lần lượt với n-hexan, ethyl acetat thu được lớp ethyl acetat đem đi thử tác dụng kháng khuẩn với 2 chủng vi khuẩn

là Escherichia coli và vi khuẩn Staphylococcus aureus Ở các nồng độ 2,5%, 5%, 10%, 20%, 40% cho thấy không có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Eschericia coli, trong khi ở nồng độ 5% có hoạt tính chống lại vi khuẩn Staphylococcus aureus [44]

Tương tự với kết quả nghiên cứu trên, năm 2021, Talukdar Nayan và cộng sự cũng xác định cao chiết nước hoa đu đủ đực được cho là có tác dụng kháng hai vi khuẩn

Escherichia coli và Staphylococcus aureus với kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là 8

mm và 7 mm [35]

Năm 2023, Anugraheni và các cộng sự thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn

Escherichia coli của cao chiết cồn của hoa đu đủ và hỗn hợp dịch chiết hoa đu đủ với

kháng sinh tetracyclin Kết quả cho thấy MIC của cao chiết ethanol hoa đu đủ là 2mg/ml Tác dụng kìm khuẩn của cao chiết đạt sau 0 - 24 giờ, trong khi kháng sinh tetracyclin và hỗn hợp kháng sinh tetracyclin với cao chiết có tác dụng diệt khuẩn sau 8-24 giờ [16]

Cũng trong năm 2023, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã xác định cao

nước hoa đu đủ đực thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Enterococcus faecalis với MIC 128 µg/ml, ức chế sự phát triển của nấm Candida albicans với MIC 128 µg/ml [11]

1.2.2.4 Tác dụng hạ đường huyết

Năm 2018, Wahyuni và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của cao chiết hoa đu đủ trên chuột nhắt trắng bị gây bệnh đái tháo đường bằng streptozotocin

Kết quả cho thấy ở cả mức liều 200, 400, 500 mg/kg cân nặng đều có tác dụng hạ đường huyết sau 7 ngày cho uống cao chiết Đặc biệt ở liều 400 mg/kg cân nặng và liều 500 mg/kg cân nặng có tác dụng tốt hơn so với chứng dương (glibenclamide) [46]

Năm 2019, Fitriani Dita và cộng sự đã xác định chiết xuất hoa đu đủ với liều 31, 62, 125 (mg/kg cân nặng) có thể làm tăng mức HDL trung bình và giảm mức LDL trung bình trong máu chuột một cách đáng kể (p <0,05) Tuy nhiên, liều càng lớn không ảnh hưởng đến mức HDL và LDL [42]

1.2.2.5 Tác dụng giảm đau

Năm 2020, Swingly Fidelik Manengkey thử nghiệm tác dụng giảm đau của cao chiết ethanol hoa đu đủ đực trên chuột nhắt trắng Chuột được gây đau bằng cách tiếp xúc với nước nóng 53,3oC trong 1 phút Chuột được uống cao chiết hoa đu đủ đực ở các mức liều 75, 150, 300 (mg/kg cân nặng) Sau 120 phút, cho thấy tác dụng giảm đau của cao chiết, trong đó mức giảm tốt nhất ở liều 300 mg/kg cân nặng [45]

Giải thích cho điều này là do chiết xuất hoa đu đủ đực có chứa flavonoid và tanin

có tác dụng giảm đau bằng cách ức chế enzym cyclooxygenase, do đó cản trở acid

arachidonic tổng hợp prostaglandin gây đau [45]

1.2.2.6 Tác dụng diệt côn trùng sinh học

Năm 2019, Iskandar Iwan và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng diệt ruồi của cao chiết ethanol của hoa đu đủ đực ở các nồng độ 25%, 50%, 75% Kết quả cho thấy ở nồng độ 25% có khả năng diệt ruồi với tỷ lệ chết là 76,67%, tỷ lệ tăng dần khi tăng nồng độ cao chiết hoa đu đủ Nồng độ cao chiết hoa đu đủ hiệu quả nhất là 75%, với tỷ lệ chết là 96,67% trong số 30 mẫu thử nghiệm sau khi được xử lý trong 3 giờ [43]

1.2.3 Tri thức sử dụng trong dân gian

Trong dân gian, hoa đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường hoặc đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm ống phổi, mất tiếng [7]

Tại Indonesia, hoa đu đủ thường được luộc ăn để cải thiện sự thèm ăn, chữa bệnh đái tháo đường và vàng da [46]

Tại Ấn Độ, hoa đu đủ được sử dụng để hạ sốt, chữa vàng da, các bệnh ở phổi [26] Bên cạnh đó, nước sắc hoa đu đủ đực còn được sử dụng làm giảm lượng insulin ở bệnh nhân tiểu đường, hỗ trợ giảm cân và tăng cường trao đổi chất [18]

Ở Bán Đảo Malaysia, hoa đực được tiêu thụ như một món rau ăn [21]

1.3 Về hợp chất quercetin

Quercetin đã được xác định có mặt trong hoa đu đủ đực [10] Quercetin có tính chất vật lý và tác dụng sinh học như sau:

Tính chất vật lý: - Khối lượng phân tử: 302,23 g/mol

- Bột kết tinh màu vàng [39], [15] - Nhiệt độ nóng chảy ở 316,5oC [20]

- Quercetin hầu như không tan trong nước, tan trong kiềm, rượu và lipid - Tan tốt trong ether, methanol; tan trong ethanol, aceton, pyridine, acetic acid [20]

Tác dụng sinh học:

- Chống dị ứng trong điều trị điều trị dị ứng đường hô hấp và thực phẩm [22], [20], [30]

- Chống viêm [20], [39] - Chống oxy hóa [25] - Chống virus [30] - Chống ung thư [30] - Bảo vệ tim mạch [20]

1.4 Các phương pháp xác định quercetin

Quercetin là flavonoid thuộc nhóm flavonoid aglycon Dưới tác động của enzym có sẵn trong dược liệu hoặc bởi acid, các flavonoid glycosid chứa phần aglycon là

quercetin sẽ thủy phân ra hai chất này

Do đó quá trình xử lý mẫu thường kèm theo phương pháp thủy phân bằng acid và dịch sau quá trình thủy phân được sử dụng để xác định hàm lượng quercetin

(nm)

TLTK

1 Toluene: ethyl acetat: formic acid (6 : 4 : 0,3) 366 [32]

2 Ethyl acetat - butan-2-on - acid formic - nước (5 :

1.4.2 Định lượng quercetin bằng HPLC

HPLC là phương pháp được ưu tiên sử dụng hơn HPTLC trong phân tích định lượng do ưu điểm về độ nhạy và độ phân giải cao Một số điều kiện sắc ký được dùng để định lượng quercetin được trình bày dưới bảng sau:

Bảng 1.2 Điều kiện sắc ký lớp lỏng hiệu năng cao định lượng quercetin

STT Cột Hệ pha động (tt/tt)

Tốc độ dòng

(ml/phút)

Thể tích tiêm

(µl)

Bước sóng quan sát

(nm)

Tài liệu tham

khảo

1 C18 (25cm x 4,6 mm x

5um)

Đẳng dòng: Methanol: dung dịch acid phosphoric 0,4 % (55 : 45)

2 C18 (250 x

4,6 mm; 5 µm)

Đẳng dòng: Acetonitril: đệm phosphat 0,025 M (pH 2,4) (25:75)

3 C18 (250 x

4,6 mm; 5 µm)

Gradient: Acetonitril : dung dịch đệm acid perchloric 0,2%

1.5 Phương pháp hỏa chế

1.5.1 Mục đích của phương pháp hỏa chế

Chế biến thuốc cổ truyền là phương pháp chế biến phức tạp, chủ yếu dựa vào các học thuyết cơ bản của y học cổ truyền Có ba phương pháp chế biến thuốc cổ truyền chính là: hỏa chế, thủy chế, thủy hỏa hợp chế và một số phương pháp khác [1]

Phương pháp hỏa chế là phương pháp chế biến sử dụng tác động của nhiệt độ trực tiếp hoặc gián tiếp qua các phụ liệu trung gian ở các mức nhiệt độ khác nhau [1]

Mục đích của hỏa chế bao gồm:

- Tăng tính ấm, giảm tính hàn của vị thuốc: lửa thuộc nhiệt, thuộc dương Hỏa chế

nghĩa là đưa thêm phần nhiệt, phần dương vào vị thuốc, làm giảm tính hàn cho vị thuốc

- Giảm độc tính, giảm tác dụng quá mạnh của vị thuốc: Thường nhiệt độ cao phân

hủy các chất gây độc của thuốc

- Ổn định hoạt chất trong vị thuốc - Giảm độ bền cơ học của vị thuốc ở nhiệt độ cao, các chất hữu cơ bị phân hủy,

các liên kết hữu cơ bị phá vỡ làm giảm độ bền của vị thuốc

- Tạo mùi thơm cho vị thuốc

1.5.2 Các phương pháp hỏa chế

➢ Các phương pháp hỏa chế như sao, nung, chế sương, lùi (vùi, ổi), nướng, hỏa phi [1]

➢ Một số phương pháp sao trực tiếp trong hỏa chế:

- Sao qua (vi sao): nhiệt độ khoảng 50 – 80oC Mục đích làm khô, làm thơm, tránh mốc mọt và ổn định thành phần hoạt chất

- Sao vàng: nhiệt độ khoảng 100-140oC, tăng mùi thơm, tăng tác dụng quy tỳ

- Sao vàng cháy cạnh: nhiệt độ khoảng 100-160oC Mục đích giảm bớt mùi vị khó chịu của thuốc

- Sao vàng hạ thổ: nhiệt độ khoảng 100-160oC Giúp cân bằng âm dương cho vị thuốc Hạ nhiệt nhanh, tránh sự ảnh hưởng tiếp theo của nhiệt độ

- Sao đen (hắc sao, sao tồn tính): nhiệt độ khoảng 180 – 240oC, tăng tác dụng tiêu thực, giảm tính mãnh liệt của vị thuốc

- Sao cháy, nhiệt độ khoảng 180-240oC, tăng tác dụng cầm máu

1.6 Một số ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất quercetin

Có sự khác nhau về sự thay đổi hàm lượng quercetin trong các loại hoa quả khác nhau, ví dụ với dâu tây nấu trong 30 phút, hàm lượng quercetin giảm đi Nhưng với cà chua được xử lý với các điều kiện chiên 5 phút; luộc 15 phút; vi sóng 1,3 phút đều làm tăng hàm lượng quercetin… [14]

Năm 2017, một nghiên cứu tiến hành khảo sát sự phân hủy các chất trong dịch

chiết loài Poincianella pyramidalis (Tul.), Khi được sấy ở ở các nhiệt độ từ 160-180oC, kết quả cho thấy ở 160oC, cho hàm lượng quercetin là cao nhất [31]

Một nghiên cứu khác đã chỉ ra, sấy khô bằng khí nóng trong các nhiệt độ từ 30 60oC, hàm lượng quercetin tăng lên [28] Tương tự, hàm lượng quercetin trong hành tím tăng lên khi tăng nhiệt độ sấy từ 50 – 90oC, và tăng thời gian sấy từ 2-4 giờ, hàm lượng quercetin đạt giá trị cao nhất ở sấy 90oC trong 4 giờ [4]

-CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Hoa đu đủ đực được thu hái tại huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình vào tháng 8/2023

Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Carica papaya Linn., họ Đu đủ (Caricaceae) đã được

giám định bởi ThS Nghiêm Đức Trọng – Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu bản: HNIP/18826/24 (Phụ lục 1,2)

Xử lý mẫu: Hoa đu đủ đực được rửa sạch, phơi khô, bảo quản trong túi kín, nơi khô ráo

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản): buồng cấp dung

môi LC-20AD, buồng ổn nhiệt cho cột CTO-10AS, cột sắc kí pha đảo C18, đầu dò UV-Vis SPD – M20A

- Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45 µm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc

syringe 0,45 µm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)

- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) - Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ) - Bể siêu âm Elmasonic S100H (Đức)

- Tủ sấy Memmert (Đức) - Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức) - Máy ly tâm Hermle Z207A

- Bếp hồng ngoại Sunhouse SHD 6011 điều chỉnh được công suất

Hình 2 1 Mẫu nghiên cứu hoa đu đủ đực

- Bình định mức, bình nón, ống sinh hàn, pipet chính xác các loại, micro pipet và

các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác cần cho quá trình phân tích

2.2 Thuốc thử, hóa chất - Chất đối chiếu: quercetin (ĐTK: 97%, CAS: 117-39-5) được mua của hãng

Macklin

- Các dung môi: methanol, acid hydrocloric, ethyl acetat đạt tiêu chuẩn phân tích

Các dung môi dùng cho HPLC được mua của hãng Merck

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 của hãng Merck

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xây dựng phương pháp định tính và định lượng quercetin tạo ra khi

thủy phân từ dịch chiết hoa đu đủ đực

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới

hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân từ dịch chiết hoa đu đủ đực

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Chuẩn bị mẫu thử: Dịch đem đi cô cạn còn khoảng 10 ml Cho 20 ml HCl 2N vào dịch chiết, thủy phân bằng đun hồi lưu ở 70oC trong 2 tiếng Dịch đã thủy phân trung hòa bằng Na2CO3đến pH 5-6 Dịch đã trung hòa đem đi lắc phân bố 2 lần với ethyl acetat, mỗi lần khoảng 20 ml ethylacetat Thu lấy lớp ethyl acetat (lớp trên) thu được dịch ethyl acetat, dịch đem cô cạn đến cắn

Thêm khoảng 8 ml dung môi methanol vào cắn, siêu âm Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm thu được dung dịch thử

2.4.1.2 Định tính quercetin bằng sắc ký lớp mỏng

Dung dịch mẫu thử: chuẩn bị như mục 2.4.1.1 Dung dịch mẫu đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu quercetin vào dung môi methanol để thu được dung dịch mẫu đối chiếu có nồng độ là 100 µg/ml

Chuẩn bị bản mỏng: Sử dụng bản mỏng silicagel 60GF254 (Merck) được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ

Pha động: Toluen: ethyl acetat: acid formic= 6:4:0,3 (v/v) Tiến hành chấm mẫu lên bản mỏng, triển khai sắc ký Lấy bản mỏng ra ngoài, để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát bản mỏng dưới bước sóng 254 nm và bước sóng 366 nm

2.4.1.3 Định lượng quercetin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chuẩn bị mẫu thử: Như mục 2.4.1.1 Thu thập các số liệu để tính toán hàm lượng quercetin: Hàm lượng quercetin trong dược liệu hoa đu đủ đực đều được tính theo công thức:

- b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ

quercetin và diện tích pic

- V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 10 ml) - a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ

quercetin và diện tích pic

- m: khối lượng dược liệu (g) - A: hàm ẩm của dược liệu (%)

2.4.1.4 Khảo sát và tìm điều kiện định lượng quercetin

- Cột sắc ký: Cột C18 Inertsustain GL Sciences (250 x 4,6 mm; 5 µm) - Chọn pha động: Tham khảo một số tài liệu như ở bảng 1.2, khảo sát các

hệ dung môi và lựa chọn hệ phù hợp

- Chọn tốc độ dòng - Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV của quercetin để xác định cực

đại hấp thụ

- Chọn thể tích tiêm: 30 µL

2.4.1.5 Thẩm định phương pháp định lượng quercetin trong dược liệu hoa đu đủ đực

Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [17] về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên

2.4.1.5.1 Tính phù hợp hệ thống

Độ phù hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý

Cách xác định: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và 6 lần dung dịch thử đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: Hệ thống được coi là thích hợp nếu RSD ≤ 2,0% với cả thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết

Yêu cầu: - Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn: Pic của chất phân tích cần phân tách hoàn toàn khỏi các pic khác và có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

- Sắc ký đồ của mẫu trắng: Không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

- Hệ số chồng phổ UV – Vis của pic thu được trong sắc ký đồ của mẫu thử so với pic tương ứng thu được trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn phải đạt từ 99,0% trở lên 2.4.1.5.3 Độ tuyến tính

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Kết quả được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số xác định R2

Tiến hành: Pha một dãy dung dịch chuẩn quercetin ở các nồng độ thích hợp Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện được chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ quercetin trong các dung dịch chuẩn

Yêu cầu: R2 ≥ 0,99 2.4.1.5.4 Độ chính xác

- Độ lặp lại trong ngày:

Tiến hành: Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập theo quy trình phân tích Tính toán giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng quercetin của 6 mẫu

- Độ chính xác trung gian:

Tiến hành: Phân tích mẫu trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi triển khai sắc ký Độ chính xác trung gian được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích trong 2 ngày

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của kết quả định lượng ≤ 5,3% với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1%

2.4.1.5.5 Độ đúng

Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực Tiến hành: Thêm một lượng đã biết chất chuẩn hoặc chất đối chiếu tương ứng với 25%, 50% và 75% vào mẫu thử ở mức 50% để thu được dung dịch với các nồng độ quercetin bằng 75%, 100%, 125% so với nồng độ quercetin trong mẫu thử Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và khai triển sắc ký theo điều kiện được chọn, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần Xác định tỷ lệ thu hồi (%) so với nồng độ ban đầu

Công thức tính độ thu hồi:

R (%) = m chất đối chiếu thu hồi

m chất đối chiếu thêm x 100

Yêu cầu: Với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1%, tỷ lệ thu hồi đạt 90,0 – 107,0% ở mỗi mức nồng độ

2.4.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực

Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực được khảo sát bao gồm:

+ Chế biến hỏa chế: nhiệt độ sấy, thời gian sấy + Điều kiện chiết xuất: thời gian chiết, nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi và dược liệu

Phương pháp xử lý mẫu được tiến hành theo quy trình đã trình bày ở mục 2.4 Các điều kiện khảo sát được trình bày theo bảng dưới đây:

Bảng 2.1 Các điều kiện khảo sát của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết tới HL

quercetin tạo ra khi thủy phân

Khảo sát

Tỷ lệ dung môi/ dược liệu (ml/g)

Nồng độ ethanol (%)

Thời gian chiết (phút)

Thời gian sấy (phút)

Nhiệt độ sấy (oC)

180;200

Chú thích: (x) không khảo sát

Khảo sát

Tỷ lệ dung môi/ dược liệu (ml/g)

Nồng độ ethanol (%)

Thời gian chiết (phút)

Thời gian sấy (phút)

Nhiệt độ sấy (oC)

Tỷ lệ dung môi/ dược liệu (ml/g)

10/1; 16/1;18/1; 20/1; 24/1;

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả định tính quercetin tạo ra khi thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng

3.1.1 Định tính quercetin bằng sắc ký lớp mỏng

Kết quả được trình bày ở hình 3.1 dưới đây:

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu thử (T), mẫu đối chiếu quercetin (C) quan sát dưới

bước sóng 254nm (A), 366nm (B) Nhận xét:

Quan sát ở bước sóng 254 nm và 366 nm đều cho thấy: trên sắc ký đồ của dung dịch thử xuất hiện vết có màu sắc và Rf tương đương với vết quercetin đối chiếu Hợp chất quercetin có Rf ≈ 0,44 tách ra khỏi các vết khác trên sắc ký đồ

Hình 3.1 thể hiện sắc ký đồ TLC cho thấy, hệ dung môi này có thể sử dụng để định tính quercetin trong hoa đu đủ đực

3.2 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực

3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Tham khảo các chương trình rửa giải đã nêu ở mục 1.4.2, điều chỉnh và tìm ra hệ dung môi pha động methanol : dung dịch acid phosphoric 0,1% (55:45) Kết quả triển khai sắc ký cho thấy hệ dung môi này có khả năng tách tốt pic quercetin, cho các pic cân đối, thời gian lưu hợp lý và tiết kiệm dung môi Do đó hệ này được chọn làm pha động trong nghiên cứu