Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực ..... Kết quả khảo sát ảnh hưởng c
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Đu đủ
1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
- Tên khoa học: Carica papaya Linn [13]
- Tên khác: phiên qua thụ, phiên mộc, mác rẩu, mác vá, cà lào (Tày), má hống (Thái) [13]
- Theo hệ thống phân loại của Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009) [36], đu đủ thuộc:
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)
Bộ: Đu đủ (Caricales) Họ: Đu đủ (Caricaceae) Chi: Đu đủ (Carica L.)
Cây nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2 - 4m Thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống rất dài, xẻ 5 - 7 thuỳ hình mác, mép có răng cưa to, nhọn, gốc có 2 tuyến hình mác hẹp Hoa hình chuông, màu vàng tươi, mọc thành chùm ở đầu cành, dài khoảng 10cm Quả nang, hình trứng rộng, dài 2 - 3cm, có 10 cạnh dọc, chứa nhiều hạt.
7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn
Hoa màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc, cụm hoa đực dài, phân nhánh thành chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2 -
3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn
Quả mọng to, hình trứng ngược hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ, hạt nhiều màu đen
Cây đu đủ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, Nam Mexico và các vùng Trung Mỹ [40] Vào thế kỷ XVI, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribe và một số nước Đông Nam Á Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanka, châu Đại Dương và châu Phi [13]
Cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Các tỉnh trồng nhiều cây đu đủ như Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam,
3 Vĩnh Phúc, Quảng Nam, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên với giống chủ yếu phổ biến hiện nay là giống đu đủ Đài Loan, một giống lai F1 được nhập từ Đài Loan [9]
về sinh thái, đu đủ là loài cây nhiệt đới, ưa nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 21-33 độ C, lượng mưa năm trên 1200 mm Đu đủ có thể trồng trên nhiều loại đất, nhưng yêu cầu đất thoát nước tốt Sau 4-5 tháng trồng từ hạt, đu đủ có thể ra hoa Hoa thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng nên dễ bị lai tạp ở thế hệ sau.
Cây đu đủ cung cấp các bộ phận sau đây dùng làm thuốc: quả đu đủ xanh và chín, hạt đu đủ, hoa đu đủ, nhựa đu đủ, lá, rễ [7], [13].
Tổng quan về hoa Đu đủ đực
Thành phần hóa học trong hoa đu đủ đực (Carica papaya Linn.) gồm các nhóm chất: flavonoid, phenolic, sterol, nhóm acid hữu cơ và dẫn xuất
Trong phân đoạn chloroform của hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) đã phân lập và xác định được cấu trúc của rutin (1) [12] và kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside
Hình 1.1 Hoa và quả của đu đủ đực, cái và lưỡng tính
(A) Hoa cái; (B) hoa lưỡng tính; (C) hoa đực; (D) quả cái; (E) quả lưỡng tính;
4 Kaempferol (3) đã được phát hiện trên cả 2 phân đoạn ethyl acetat và chloroform hoa cây đu đủ đực thu hái tại địa bàn tỉnh Quảng Nam [3], [8]
Trong dịch chiết hoa và lá cây đu đủ đực, Đỗ Thị Thúy Vân đã phân lập được các hợp chất: kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (4), kaempferol-3-O-α-L- arabinopyranoside (5), quercetin (6), quercitrin (7), quercetin 3-O-β-D- galactopyranoside (8), myricitrin (9) [10]
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 1 số flavonoid trong hoa đu đủ đực
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của benzyl-β-D-glucoside
Trong dịch chiết hoa, cuống lá đu đủ đực đã phát hiện các hợp chất:
Stigmast-4-en-3-on, β-sitosterol 3-O-β-glucopyranosid [38]; β-sitosterol glucoside (daucosterol) [12]; cholest-5-en-3β,7β-diol, saringosterol, stigmasterol, 3β,7α-dihydroxycholest-5-en [10]
Stigmast-4-en-3-on β-sitosterol 3-O- β-glucopyranosid
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của 1 số sterol trong hoa đu đủ đực
1.2.1.4 Nhóm acid hữu cơ và dẫn xuất
Acid palmitic được tìm thấy trong phân đoạn ethyl acetat hoa, cuống lá đu đủ đực [38]
Các phenolic được tìm thấy trong hoa đu đủ đực là: acid gallic và vanillin [10]
Do số lượng nghiên cứu về tác dụng dược lý của hoa đu đủ đực còn hạn chế nên nội dung tổng quan về tác dụng dược lý dưới đây tiến hành thu thập các thông tin về tác dụng dược lý của hoa đu đủ (bao gồm cả các nghiên cứu không đề cập rõ giống đực)
1.2.2.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư
Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố nghiên cứu cao chiết ethanol của hoa cây đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (IC50 = 55,875 (àg/ml)) [41]
Năm 2020, Võ Thị Ngà và cộng sự đã xác định cao chiết ethanol của lá, hoa, rễ cây đu đủ cái và cây đu đủ đực cùng các hợp chất stigmast-4-en-3-on, benzyl-β-D- glucosid, uracil được phân lập từ hoa và cuống lá cây đu đủ đực thu hái tại Bình Định không có tác dụng gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư MCF-7, Hep-G2, HeLa, NCI-H460 ở nồng độ 100 àg/ml [38]
Năm 2020, Phan Lê Thảo My và các cộng sự đã thử tác dụng của cao chiết siêu âm của hoa đu đủ đực chống lại tế bào ung thư Hep-G2 và cho thấy tác dụng với giá trị
Năm 2020, Đỗ Thị Thúy Vân đã xác định có 19/24 hợp chất mới được phân lập có mức hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư ở người (A549, MCF-7 và Hep3B) với giỏ trị IC50 trong khoảng 26,72 ± 0,76 đến 93,07 ± 5,03 àg/ml [10] Cú 7/9 hợp chất mới được phân lập được xác định có mức hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase với giá trị IC50 trong khoảng 14,3 ± 2,7 đến 82,1 ± 3,6 àM [10]
Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid palmitic
Hình 1 6 Công thức cấu tạo của acid galic và vanillin
1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2018, Sianipar Masria và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa của phân đoạn hexan cao chiết hoa đu đủ đực Kết quả cho thấy phân đoạn có tác dụng chống oxy húa với giỏ trị IC50 là 100,81±1,180 àg/ml [34] Giỏ trị IC50 thấp phản ỏnh hoạt tính chống oxy hóa cao
Năm 2020, Phan Lê Thảo My và cộng sự đã tối ưu hóa chiết xuất flavonoid hoa đu đủ đực Việt Nam sử dụng phương pháp siêu âm và thử nghiệm tác dụng chống oxy húa của cao chiết đó được tối ưu, cho kết quả với giỏ trị IC50 là 179,69 ± 0,03 àg/ml [37]
Năm 2022, Halder Shreyasi Dịch thử nghiệm cao chiết methanol của hoa đu đủ ở nồng độ 500 àg/ml cho thấy hoạt tớnh nhặt gốc tự do tốt với IC50 là 17,47 àg/ml Phõn tích hóa thực vật cho thấy hàm lượng phenol cao với giá trị là 108,66 mg GAE/100 g (mg đương lượng acid gallic trên 100 gam chất khô) [24]
Năm 2021, Santoso Dimas Satria Putra và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của hoa đu đủ trên 2 chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus Trong đó, cao chiết ethanol của hoa đu đủ đực được lắc phân bố lần lượt với n-hexan, ethyl acetat thu được lớp ethyl acetat đem đi thử tác dụng kháng khuẩn với 2 chủng vi khuẩn là Escherichia coli và vi khuẩn Staphylococcus aureus Ở các nồng độ 2,5%, 5%, 10%, 20%, 40% cho thấy không có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Eschericia coli, trong khi ở nồng độ 5% có hoạt tính chống lại vi khuẩn Staphylococcus aureus [44]
Tương tự với kết quả nghiên cứu trên, năm 2021, Talukdar Nayan và cộng sự cũng xác định cao chiết nước hoa đu đủ đực được cho là có tác dụng kháng hai vi khuẩn
Escherichia coli và Staphylococcus aureus với kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là 8 mm và 7 mm [35]
Năm 2023, Anugraheni và các cộng sự thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn
Chiết xuất cồn từ hoa đu đủ có khả năng ức chế vi khuẩn Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 2mg/ml Tác dụng này được quan sát thấy sau 0-24 giờ, trong khi kháng sinh tetracycline phải mất 8-24 giờ mới diệt được vi khuẩn Khi kết hợp chiết xuất hoa đu đủ với tetracycline, tác dụng diệt khuẩn diễn ra nhanh hơn, trong khoảng 8-24 giờ.
Cũng trong năm 2023, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã xác định cao nước hoa đu đủ đực thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Enterococcus faecalis với MIC
128 àg/ml, ức chế sự phỏt triển của nấm Candida albicans với MIC 128 àg/ml [11]
1.2.2.4 Tác dụng hạ đường huyết
Năm 2018, Wahyuni và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu để đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao chiết hoa đu đủ trên mô hình chuột nhắt trắng bị gây bệnh tiểu đường bằng streptozotocin.
8 Kết quả cho thấy ở cả mức liều 200, 400, 500 mg/kg cân nặng đều có tác dụng hạ đường huyết sau 7 ngày cho uống cao chiết Đặc biệt ở liều 400 mg/kg cân nặng và liều 500 mg/kg cân nặng có tác dụng tốt hơn so với chứng dương (glibenclamide) [46]
Năm 2019, Fitriani Dita và cộng sự đã xác định chiết xuất hoa đu đủ với liều 31,
Về hợp chất quercetin
Quercetin đã được xác định có mặt trong hoa đu đủ đực [10] Quercetin có tính chất vật lý và tác dụng sinh học như sau:
- Khối lượng phân tử: 302,23 g/mol
- Bột kết tinh màu vàng [39], [15]
- Quercetin hầu như không tan trong nước, tan trong kiềm, rượu và lipid
- Tan tốt trong ether, methanol; tan trong ethanol, aceton, pyridine, acetic acid [20]
- Chống dị ứng trong điều trị điều trị dị ứng đường hô hấp và thực phẩm [22], [20], [30]
Các phương pháp xác định quercetin
Quercetin là flavonoid thuộc nhóm flavonoid aglycon Dưới tác động của enzym có sẵn trong dược liệu hoặc bởi acid, các flavonoid glycosid chứa phần aglycon là quercetin sẽ thủy phân ra hai chất này
Quá trình xử lý mẫu trước khi xác định hàm lượng quercetin thường phải qua thủy phân axit Sau khi thủy phân, dịch thu được sẽ dùng để đánh giá hàm lượng quercetin.
Một số điều kiện sắc ký TLC tham khảo được được tổng hợp ở bảng 1.1 dưới đây:
Bảng 1.1 Điều kiện sắc ký lớp mỏng định tính quercetin
STT Thành phần pha động (tt/tt)
Bước sóng quan sát (nm)
1 Toluene: ethyl acetat: formic acid (6 : 4 : 0,3) 366 [32]
2 Ethyl acetat - butan-2-on - acid formic - nước (5 :
4 Toluene: ethyl acetate: acid formic (7 : 3 : 0,5) 254 [27]
Hình 1.7 Công thức cấu tạo của quercetin
1.4.2 Định lượng quercetin bằng HPLC
HPLC là phương pháp được ưu tiên sử dụng hơn HPTLC trong phân tích định lượng do ưu điểm về độ nhạy và độ phân giải cao Một số điều kiện sắc ký được dùng để định lượng quercetin được trình bày dưới bảng sau:
Bảng 1.2 Điều kiện sắc ký lớp lỏng hiệu năng cao định lượng quercetin
STT Cột Hệ pha động (tt/tt)
Bước sóng quan sát
Methanol: dung dịch acid phosphoric 0,4 % (55 : 45)
Acetonitril : dung dịch đệm acid perchloric 0,2%
Phương pháp hỏa chế
1.5.1 Mục đích của phương pháp hỏa chế
Chế biến thuốc cổ truyền là phương pháp chế biến phức tạp, chủ yếu dựa vào các học thuyết cơ bản của y học cổ truyền Có ba phương pháp chế biến thuốc cổ truyền chính là: hỏa chế, thủy chế, thủy hỏa hợp chế và một số phương pháp khác [1]
Phương pháp hỏa chế là kỹ thuật chế biến sử dụng nhiệt độ trực tiếp hoặc gián tiếp để tác động vào thực phẩm, nhằm biến đổi tính chất, hình dạng và bảo quản thực phẩm ở các mức nhiệt độ khác nhau.
Mục đích của hỏa chế bao gồm:
- Tăng tính ấm, giảm tính hàn của vị thuốc: lửa thuộc nhiệt, thuộc dương Hỏa chế nghĩa là đưa thêm phần nhiệt, phần dương vào vị thuốc, làm giảm tính hàn cho vị thuốc
- Giảm độc tính, giảm tác dụng quá mạnh của vị thuốc: Thường nhiệt độ cao phân hủy các chất gây độc của thuốc
- Ổn định hoạt chất trong vị thuốc
- Giảm độ bền cơ học của vị thuốc ở nhiệt độ cao, các chất hữu cơ bị phân hủy, các liên kết hữu cơ bị phá vỡ làm giảm độ bền của vị thuốc
- Tạo mùi thơm cho vị thuốc
1.5.2 Các phương pháp hỏa chế
➢ Các phương pháp hỏa chế như sao, nung, chế sương, lùi (vùi, ổi), nướng, hỏa phi [1]
➢ Một số phương pháp sao trực tiếp trong hỏa chế:
- Sao qua (vi sao): nhiệt độ khoảng 50 – 80 o C Mục đích làm khô, làm thơm, tránh mốc mọt và ổn định thành phần hoạt chất
- Sao vàng: nhiệt độ khoảng 100-140 o C, tăng mùi thơm, tăng tác dụng quy tỳ
- Sao vàng cháy cạnh: nhiệt độ khoảng 100-160 o C Mục đích giảm bớt mùi vị khó chịu của thuốc
- Sao vàng hạ thổ: nhiệt độ khoảng 100-160 o C Giúp cân bằng âm dương cho vị thuốc Hạ nhiệt nhanh, tránh sự ảnh hưởng tiếp theo của nhiệt độ
- Sao đen (hắc sao, sao tồn tính): nhiệt độ khoảng 180 – 240 o C, tăng tác dụng tiêu thực, giảm tính mãnh liệt của vị thuốc
- Sao cháy, nhiệt độ khoảng 180-240 o C, tăng tác dụng cầm máu.
Một số ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất quercetin
Có sự khác nhau về sự thay đổi hàm lượng quercetin trong các loại hoa quả khác nhau, ví dụ với dâu tây nấu trong 30 phút, hàm lượng quercetin giảm đi Nhưng với cà chua được xử lý với các điều kiện chiên 5 phút; luộc 15 phút; vi sóng 1,3 phút đều làm tăng hàm lượng quercetin… [14]
Năm 2017, một nghiên cứu cho thấy rằng khi chiết xuất Poincianella pyramidalis (Tul.) được sấy ở nhiệt độ 160 độ C, hàm lượng quercetin đạt mức cao nhất.
Một nghiên cứu khác đã chỉ ra, sấy khô bằng khí nóng trong các nhiệt độ từ 30 -
60 o C, hàm lượng quercetin tăng lên [28] Tương tự, hàm lượng quercetin trong hành tím tăng lên khi tăng nhiệt độ sấy từ 50 – 90 o C, và tăng thời gian sấy từ 2-4 giờ, hàm lượng quercetin đạt giá trị cao nhất ở sấy 90 o C trong 4 giờ [4]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
Hoa đu đủ đực được thu hái tại huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình vào tháng 8/2023 Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Carica papaya Linn., họ Đu đủ (Caricaceae) đã được giám định bởi ThS Nghiêm Đức Trọng – Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu bản: HNIP/18826/24 (Phụ lục 1,2)
Xử lý mẫu: Hoa đu đủ đực được rửa sạch, phơi khô, bảo quản trong túi kín, nơi khô ráo
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản) bao gồm buồng cấp dung môi LC-20AD, buồng ổn nhiệt cho cột CTO-10AS, cột sắc ký pha đảo C18 và đầu dò UV-Vis SPD – M20A Các thiết bị này phối hợp với nhau để thực hiện quá trình phân tích HPLC, giúp tách và định lượng các hợp chất trong mẫu một cách hiệu quả và chính xác.
- Hệ thống lọc chõn khụng, màng lọc 0,45 àm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc syringe 0,45 àm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)
- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản)
- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ)
- Bể siêu âm Elmasonic S100H (Đức)
- Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức)
- Bếp hồng ngoại Sunhouse SHD 6011 điều chỉnh được công suất
Hình 2 1 Mẫu nghiên cứu hoa đu đủ đực
Bình định mức, bình nón, ống sinh hàn, pipet chính xác, micro pipet cùng các dụng cụ thủy tinh chuyên dụng là những trang thiết bị không thể thiếu trong quá trình thực hiện phân tích hóa học Các vật dụng này hỗ trợ đắc lực cho các thao tác như chuẩn bị dung dịch, đong đếm thể tích chính xác, làm nguội hơi nóng và khử trùng các loại mẫu.
Thuốc thử, hóa chất
- Chất đối chiếu: quercetin (ĐTK: 97%, CAS: 117-39-5) được mua của hãng Macklin
- Các dung môi: methanol, acid hydrocloric, ethyl acetat đạt tiêu chuẩn phân tích Các dung môi dùng cho HPLC được mua của hãng Merck
- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 của hãng Merck.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xây dựng phương pháp định tính và định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân từ dịch chiết hoa đu đủ đực
Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân từ dịch chiết hoa đu đủ đực.
Phương pháp nghiên cứu
Sau khi thu hái dược liệu, người ta sẽ phơi khô và trải đều ra các khay đựng Tiếp theo, dược liệu được đưa vào tủ sấy ở nhiệt độ và thời gian nhất định để làm khô hoàn toàn Quá trình sấy dược liệu nhằm loại bỏ độ ẩm, bảo quản được lâu hơn và vẫn giữ nguyên dược tính.
Chiết xuất: Dược liệu được xay nhỏ đến bột thô Cân chính xác khoảng 3,0000g bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài Thêm 72 ml ethanol 90%, sau đó chiết trong bể siêu âm trong 30 phút Lọc nóng qua bông thu được dịch chiết
Dịch đem đi cô cạn còn khoảng 10 ml Cho 20 ml HCl 2N vào dịch chiết, thủy phân bằng đun hồi lưu ở 70 o C trong 2 tiếng Dịch đã thủy phân trung hòa bằng Na2CO3 đến pH 5-6 Dịch đã trung hòa đem đi lắc phân bố 2 lần với ethyl acetat, mỗi lần khoảng
20 ml ethylacetat Thu lấy lớp ethyl acetat (lớp trên) thu được dịch ethyl acetat, dịch đem cô cạn đến cắn
Thêm khoảng 8 ml dung môi methanol vào cắn, siêu âm Chuyển hỗn hợp thu được vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển dịch trong ống ly tâm vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc syringe 0,45 àm thu được dung dịch thử
2.4.1.2 Định tính quercetin bằng sắc ký lớp mỏng
Dung dịch mẫu thử: chuẩn bị như mục 2.4.1.1
Dung dịch mẫu đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu quercetin vào dung môi methanol để thu được dung dịch mẫu đối chiếu cú nồng độ là 100 àg/ml
Chuẩn bị bản mỏng: Sử dụng bản mỏng silicagel 60GF254 (Merck) được hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ
14 Pha động: Toluen: ethyl acetat: acid formic= 6:4:0,3 (v/v)
Tiến hành chấm mẫu lên bản mỏng, triển khai sắc ký Lấy bản mỏng ra ngoài, để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát bản mỏng dưới bước sóng 254 nm và bước sóng 366 nm
2.4.1.3 Định lượng quercetin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chuẩn bị mẫu thử: Như mục 2.4.1.1
Thu thập các số liệu để tính toán hàm lượng quercetin:
Hàm lượng quercetin trong dược liệu hoa đu đủ đực đều được tính theo công thức:
- X: hàm lượng quercetin trong dịch chiết sau khi thủy phân (%)
- S: diện tích pic quercetin trong sắc ký đồ (mAU.s)
- b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ quercetin và diện tích pic
- V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 10 ml)
- a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ quercetin và diện tích pic
- A: hàm ẩm của dược liệu (%)
2.4.1.4 Khảo sát và tìm điều kiện định lượng quercetin
- Cột sắc ký: Cột C18 Inertsustain GL Sciences (250 x 4,6 mm; 5 àm)
- Chọn pha động: Tham khảo một số tài liệu như ở bảng 1.2, khảo sát các hệ dung môi và lựa chọn hệ phù hợp
- Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV của quercetin để xác định cực đại hấp thụ
- Chọn thể tớch tiờm: 30 àL
2.4.1.5 Thẩm định phương pháp định lượng quercetin trong dược liệu hoa đu đủ đực
Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [17] về sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên
2.4.1.5.1 Tính phù hợp hệ thống Độ phù hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý
15 Cách xác định: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và 6 lần dung dịch thử đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích
Yêu cầu: Hệ thống được coi là thích hợp nếu RSD ≤ 2,0% với cả thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết
Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá chính xác chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác, bao gồm tạp chất và các chất cản trở Khả năng này rất quan trọng trong phân tích định tính và định lượng, giúp xác định thành phần và nồng độ của chất trong mẫu, thậm chí trong môi trường phức tạp Nhờ đó, các nhà hóa học có thể phân biệt chất cần phân tích với các chất tương tự hoặc các chất có tính chất hóa học tương tự hiệu quả.
Tiến hành: Triển khai sắc ký lần lượt với các mẫu: mẫu trắng (dung môi pha mẫu), dung dịch chuẩn quercetin, dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn So sánh các sắc ký đồ thu được
- Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn: Pic của chất phân tích cần phân tách hoàn toàn khỏi các pic khác và có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
- Sắc ký đồ của mẫu trắng: Không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
- Hệ số chồng phổ UV – Vis của pic thu được trong sắc ký đồ của mẫu thử so với pic tương ứng thu được trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn phải đạt từ 99,0% trở lên 2.4.1.5.3 Độ tuyến tính Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Kết quả được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số xác định R 2
Tiến hành: Pha một dãy dung dịch chuẩn quercetin ở các nồng độ thích hợp Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện được chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ quercetin trong các dung dịch chuẩn
- Độ lặp lại trong ngày:
Tiến hành: Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập theo quy trình phân tích Tính toán giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng quercetin của 6 mẫu
- Độ chính xác trung gian:
Tiến hành: Phân tích mẫu trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi triển khai sắc ký Độ chính xác trung gian được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích trong 2 ngày
16 Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của kết quả định lượng ≤ 5,3% với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1%
2.4.1.5.5 Độ đúng Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực
Tiến hành: Thêm một lượng đã biết chất chuẩn hoặc chất đối chiếu tương ứng với 25%, 50% và 75% vào mẫu thử ở mức 50% để thu được dung dịch với các nồng độ quercetin bằng 75%, 100%, 125% so với nồng độ quercetin trong mẫu thử Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và khai triển sắc ký theo điều kiện được chọn, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần Xác định tỷ lệ thu hồi (%) so với nồng độ ban đầu
Công thức tính độ thu hồi:
R (%) = m chất đối chiếu thu hồi m chất đối chiếu thêm x 100 Yêu cầu: Với các chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1%, tỷ lệ thu hồi đạt 90,0 – 107,0% ở mỗi mức nồng độ
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả định tính quercetin tạo ra khi thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng
3.1.1 Định tính quercetin bằng sắc ký lớp mỏng
Kết quả được trình bày ở hình 3.1 dưới đây:
Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu thử (T), mẫu đối chiếu quercetin (C) quan sát dưới bước sóng 254nm (A), 366nm (B) Nhận xét:
Quan sát ở bước sóng 254 nm và 366 nm đều cho thấy: trên sắc ký đồ của dung dịch thử xuất hiện vết có màu sắc và Rf tương đương với vết quercetin đối chiếu Hợp chất quercetin có Rf ≈ 0,44 tách ra khỏi các vết khác trên sắc ký đồ
Hình 3.1 thể hiện sắc ký đồ TLC cho thấy, hệ dung môi này có thể sử dụng để định tính quercetin trong hoa đu đủ đực
3.2 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực
3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Tham khảo các chương trình rửa giải đã nêu ở mục 1.4.2, điều chỉnh và tìm ra hệ dung môi pha động methanol : dung dịch acid phosphoric 0,1% (55:45) Kết quả triển khai sắc ký cho thấy hệ dung môi này có khả năng tách tốt pic quercetin, cho các pic cân đối, thời gian lưu hợp lý và tiết kiệm dung môi Do đó hệ này được chọn làm pha động trong nghiên cứu
3.2.1.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện
Phõn tớch mẫu đối chiếu quercetin với nồng độ 100 àg/ml, quột phổ trong khoảng
190 - 400 nm Kết quả cho thấy quercetin hấp phụ cực đại ở bước sóng 370 nm Vì vậy, lựa chọn bước sóng 370 nm để định lượng quercetin
3.2.1.2 Lựa chọn tốc độ dòng
Dựa theo tài liệu tham khảo ở mục 1.4.2 lựa chọn tốc độ dòng 1,0 ml/phút Tốc độ dòng này cho sắc ký đồ với các giá trị thời gian lưu, pic cân đối và kết quả tách tốt
Qua khảo sát, điều kiện sắc ký lựa chọn để định lượng quercetin trong dịch chiết hoa đu đủ đực như sau:
➢ Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 àm)
➢ Pha động: methanol: dung dịch acid phosphoric 0,1% = 55:45
➢ Tốc độ dòng: 1 ml/phút
➢ Detector DAD với bước sóng 370 nm
➢ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL
3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực
3.2.2.1 Tính phù hợp hệ thống sắc ký
Kết quả tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch thử và 6 lần dung dịch đối chiếu quercetin lần lượt cú nồng độ là 100 àg/ml và 12,5àg/ml được thể hiện ở bảng 3.1
Hình 3.2 Phổ UV của chất đối chiếu quercetin
Bảng 3.1 Kết quả độ phù hợp hệ thống
Mẫu đối chiếu Quercetin Mẫu thử
Nhận xét : Kết quả khảo sát cho thấy: RSD của thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết của các mẫu thử và 2 mẫu đối chiếu đều nhỏ hơn 2,0%; chứng tỏ hệ thống sắc ký có độ tương thích hệ thống tốt, phù hợp để định quercetin trong dịch chiết hoa đu đủ đực
Hình ảnh các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu đối chiếu quercetin, mẫu thử, mẫu thử thêm chất đối chiếu và phổ UV được trình bày ở hình 3.2
Hình 3.3 Sắc đồ cuả các mẫu trong KS độ phù hợp hệ thống
- Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic quercetin trong mẫu đối chiếu
- Sắc ký đồ của mẫu thử có pic có thời gian lưu tương ứng với pic quercetin trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn đối chiếu
- Khi thêm chất đối chiếu quercetin vào mẫu thử thì diện tích và chiều cao pic quercetin trong mẫu thử ban đầu tăng lên và không có pic lạ
- Phổ của pic trên sắc ký đồ của mẫu đối chiếu và pic tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu thử cho kết quả hệ số chồng phổ đạt (Hệ số MatchQuercetin =0,9961>0,99) Vậy phương pháp định lượng quercetin có độ đặc hiệu cao min mAU
Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu đối chiếu quercetin (B), mẫu thử (C), mẫu thử thêm chất đối chiếu (D), kết quả chồng phổ quercetin (E) min mAU
3.2.2.3 Xác định khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
Tiến hành sắc ký với dãy dung dịch chuẩn quercetin có nồng độ tương ứng từ 25-800 µg/ml Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ quercetin (x) và diện tích pic (y) Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được ghi lại trong Bảng 3.6 và Hình 3.7.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
STT Chất đối chiếu Quercetin
Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic (mAU.s)
Khoảng tuyến tớnh (àg/ml) 25 – 800
Nhận xét : Kết quả khảo sát cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ quercetin và diện tích pic, với hệ số xác định R 2 lần lượt là 0,9976 và 0,9999 (R 2 ≥ 0,99) Như vậy, đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao, đảm bảo phép phân tích định lượng quercetin y = 82978x + 106 R² = 0.9976
Nồng độ Quercetin (ug/ml)
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa diện tích pic và nồng độ chất đối chiếu quercetin và kaempferol
Tiến hành phân tích mẫu thử trong 2 ngày, mỗi ngày 6 lần để đánh giá độ chính xác của phương pháp phân tích được xây dựng Sử dụng đường chuẩn khảo sát ở mục 3.3.2.3 Hàm ẩm của mẫu dược liệu là 10,45
Kết quả độ chính xác được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác với quercetin
Hàm lượng trung bình 2 ngày 0,0481
Theo Hiệp hội Hóa học và Phân tích Nông nghiệp (AOAC), hàm lượng của quercetin trong dịch chiết hoa đu đủ đực cần có độ lệch chuẩn tương đối RSD không vượt quá 5,3%.
Các giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của mỗi ngày và cả hai ngày đều ≤ 5,3%, đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp
Các mẫu đánh giá độ đúng được chuẩn bị như sau:
Chuẩn bị dung dịch đối chiếu quercetin:
Cân chính xác khoảng 9 mg chất đối chiếu quercetin, hòa tan và pha loãng vừa đủ với methanol vào bình định mức 25 ml để thu được dung dịch đối chiếu gốc có nồng độ quercetin là 0,3600 mg/ml
Tiếp theo, lần lượt hút chính xác 1,0 ml, 2,0 ml và 3,0 ml dung dịch đối chiếu gốc vào các bình nón có chứa sẵn chính xác khoảng 1,5000 g dược liệu Tiến hành chuẩn
Ở mỗi mức nồng độ đã chuẩn bị, tiến hành song song 03 lần thử để kiểm định độ đúng Kết quả thu được trình bày chi tiết trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng với quercetin
Mẫu nồng độ so với mẫu thử n
Lượng quercetin trong mẫu thử (mg)
Lượng chất đối chiếu quercetin thêm vào (mg)
Nhận xét : Ở 3 mức nồng độ khác nhau, tỷ lệ thu hồi chất đối chiếu quercetin nằm trong khoảng 90 – 107% với độ lệch chuẩn tương đối về tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ đều ≤ 5,3 % cho thấy phương pháp đảm bảo độ đúng định lượng quercetin phù hợp theo quy định của AOAC
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong hoa đu đủ đực
Tiến hành chiết xuất hoa đu đủ đực theo quy trình đã trình bày ở mục 2.4
Trong quá trình nghiên cứu, các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng quercetin trong quá trình chiết xuất được khảo sát bao gồm: nhiệt độ sấy, thời gian sấy, thời gian chiết xuất, nồng độ ethanol và tỷ lệ dung môi/dược liệu Mỗi yếu tố này được đánh giá bằng hàm lượng quercetin tạo ra sau quá trình thủy phân.
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế tới hàm lượng quercetin trong dịch chiết hoa đu đủ đực
3.3.1.1 Khảo sát nhiệt độ sấy
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dược liệu với các giá trị lần lượt
80 o C, 100 o C, 120 o C, 140 o C, 160 o C, 180 o C, 200 o C Các thông số khác được cố định là thời gian sấy 15 phút, thời gian chiết 60 phút, tỷ lệ dung môi/ dược liệu 20/1 (ml/g), nồng độ ethanol 60% Kết quả xử lý dược liệu được thể hiện ở hình 3.5
Khi thay đổi nhiệt độ sấy từ 80 – 200 o C, hàm lượng quercetin có xu hướng tăng dần đến một mức sau đó giảm dần
Hàm lượng quercetin có xu hướng tăng cao hơn khi tăng nhiệt độ và hàm lượng cao hơn trong dược liệu nguyên trạng
Hàm lượng quercetin đạt giá trị cao nhất tại 160 o C là 512,32 μg/mg Tại nhiệt độ
160 o C tương ứng với khoảng sao đen/sao cháy trong y học cổ truyền Tương tự, một nghiên cứu đã khảo sát hàm lượng quercetin trong khoảng nhiệt độ sấy từ 160 - 180 o C, cho kết quả ở 160 o C cho hàm lượng quercetin là cao nhất [31]
Hình 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến HL quercetin
3.3.1.2 Khảo sát thời gian sấy
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy dược liệu với các giá trị lần lượt
15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút Các thông số khác được cố định là: nhiệt độ sấy 100 o C, thời gian chiết 60 phút, tỷ lệ dung môi/ dược liệu 20/1 ml/g, nồng độ ethanol 60% Kết quả được trình bày trong hình 3.6 dưới đây
Khi thời gian sấy dược liệu thay đổi từ 15 đến 90 phút, hàm lượng của quercetin có xu hướng tăng sau đó giảm Thời gian sấy là 60 phút cho hàm lượng cao nhất So với dược liệu chưa qua xử lý, hàm lượng quercetin tăng lên khoảng 1,8 lần Do đó, thời gian sấy là một thông số nên được tối ưu để cải thiện việc gia tăng hàm lượng hoạt chất
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin sau khi thủy phân trong hoa đu đủ đực
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết xuất tới hàm lượng của quercetin với các mức và thông số khác được cố định như sau:
- Các mức thời gian chiết xuất: 30 phút; 45 phút; 60 phút; 75 phút; 90 phút; 120 phút
- Thông số cố định: Dược liệu không xử lý, tỷ lệ dung môi và dược liệu - 20/1 (ml/g), nồng độ ethanol - 60%
- Kết quả được thể hiện trong hình 3.7 dưới đây:
Hình 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy đến hàm lượng quercetin
Trong khoảng 30-60 phút đầu, nồng độ hoạt chất đạt đỉnh điểm ở phút thứ 30 và sau đó giảm dần Tuy nhiên, đến phút thứ 75, nồng độ hoạt chất lại tăng lên, sau đó tiếp tục giảm dần trong khoảng 75-120 phút.
Giải thích cho điều này, do phương pháp sử dụng là phương pháp siêu âm, khó kiểm soát nhiệt độ chiết, thời gian chiết càng lâu nhiệt độ trong bể siêu âm càng gia tăng Cùng với đó, khảo sát được tiến hành cùng một lúc với 6 mẫu
Sau 75 phút chiết xuất, nhiệt độ gia tăng làm tăng tốc độ hòa tan hoạt chất vào dung môi nên làm tăng hàm lượng quercetin Mặc dù có sự kết hợp của nhiệt độ trong thời gian 75 phút, nhưng tại thời điểm 30 phút hàm lượng quercetin vẫn đạt giá trị cao nhất
3.3.2.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi và dược liệu (tỷ lệ DM/DL)
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và dược liệu tới hàm lượng của quercetin với các mức và thông số khác được cố định như sau:
- Mức khảo sát: Tỷ lệ dung môi và dược liệu: 10/1; 16/1; 18/1; 20/1; 24/1; 32/1 (ml/g)
- Thông số cố định: Dược liệu không xử lý, thời gian chiết xuất - 60 phút, nồng độ ethanol - 60%
- Kết quả được thể hiện trong hình 3.8 dưới đây:
Hình 3.8 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm quercetin
Khi tăng tỷ lệ dung môi / dược liệu từ 10/1 đến 32/1 (ml/g) hàm lượng quercetin tăng và đạt giá trị hàm lượng cao nhất tại tỷ lệ dung môi / dược liệu là 24/1 (ml/g)
Khi tăng tỷ lệ dung môi / dược liệu lượng hoạt chất được hòa tan tăng nên tăng hàm lượng Tuy nhiên đến một giới hạn, lượng hoạt chất sẽ không tăng do đạt trạng thái cân bằng Bên cạnh đó dùng nhiều dung môi làm lượng dịch chiết loãng ra, lẫn nhiều tạp hơn
3.3.2.3 Khảo sát nồng độ ethanol
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol tới hàm lượng của quercetin với các mức và thông số khác được cố định như sau:
- Các mức khảo sát: Nồng độ ethanol: 60, 80, 90, 96 %
- Thông số cố định: Dược liệu không xử lý, thời gian chiết xuất - 60 phút, tỷ lệ dung môi và dược liệu: 20/1(ml/g)
Kết quả được trình bày dưới hình 3.9 dưới đây:
Hình 3.9 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL đến hàm lượng quercetin
Hình 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nồng dộ ethanol đến hàm lượng quercetin
Tỷ lệ DM/DL (ml/g)
Hàm lượng quercetin đạt giá trị cao nhất lần lượt là 473,69 μg/ml tương ứng với nồng độ ethanol là 90% Khi tăng nồng độ ethanol đến 96%, hàm lượng hoạt chất giảm, nguyên nhân có thể do ethanol 96% có khả năng làm đông tụ các protein và polysaccharid trên bề mặt tế bào làm hạn chế khả năng thấm của dung môi chiết xuất vào trong tế bào và làm giảm tốc độ khuếch tán hoạt chất
Tổng kết kết quả các thông số cho hàm lượng quercetin cao nhất như sau:
- Tỷ lệ dung môi/ dược liệu: 20/1 ml/g
Bàn luận
3.4.1 Về phương pháp định lượng quercetin sau thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực
Hiện nay, đã có các nghiên cứu về phân lập các hoạt chất trong hoa đu đủ đực, tuy nhiên nghiên cứu về phương pháp định lượng các hoạt chất này vẫn còn hạn chế
Dịch chiết siêu âm đã được tối ưu hóa hàm lượng flavonoid đã được chứng minh tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư [37] Tiếp cận từ hướng tác dụng dược lý chống oxy hóa, chống ung thư, nghiên cứu tiến hành lựa chọn đối tượng là các flavonoid bao gồm quercetin Hợp chất này đã được chứng minh các tác dụng dược lý trên Bên cạnh đó, lựa chọn hợp chất quercetin cũng phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm
Về xử lý mẫu: Do quercetin là aglycon nên trong quá trình xử lý mẫu thường kèm thêm giai đoạn thủy phân Các hợp chất glycosid có trong hoa đu đủ đực có khung quercetin như rutin, quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside, quercetrin khi thủy phân sẽ tạo ra quercetin Sau thủy phân được trung hòa bằng muối Na2CO3 đến pH 5-6 để chuyển dạng muối của quercetin bền vững hơn Tiếp tục lắc với ethylacetat để loại tạp
Về phương pháp định lượng: phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu định lượng quercetin do đây phương pháp phổ biến sử dụng trong định lượng các hợp chất thiên nhiên, có độ nhạy cao và kết quả chính xác
Dựa trên tài liệu tham khảo kết hợp với điều chỉnh các thông số, đề tài đã tìm ra điều kiện sắc ký để định lượng:
- Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; 5 àm)
- Pha động: methanol: dung dịch acid phosphoric 0,1% = 55:45
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Detector DAD với bước sóng 370 nm
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL
Quá trình thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực đạt về tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng đều đạt giới hạn yêu cầu Điều này cho thấy các điều kiện sắc ký được lựa chọn là phù hợp
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực
➢ Về phương pháp chiết xuất:
- Phương pháp chiết xuất sử dụng phương pháp siêu âm Trong nghiên cứu [37], đã so sánh ảnh hưởng của các phương pháp chiết tới hàm lượng flavonoid toàn phần trong hoa đu đủ đực Kết quả cho thấy phương pháp chiết siêu âm cho hàm lượng flavonoid cao hơn các phương pháp khác như trích ly có hỗ trợ enzyme (EAE: Enzyme- assisted extraction), phương pháp enzyme có hỗ trợ siêu âm (ultrasound-assisted enzyme extraction - UAEE) và phương pháp chiết nóng
Phương pháp siêu âm được ưa chuộng trong phòng thí nghiệm nhờ tính đơn giản và phù hợp Tuy nhiên, khi áp dụng ở quy mô công nghiệp, phương pháp này còn nhiều hạn chế, chưa đáp ứng được nhu cầu mở rộng sản xuất hàng loạt.
➢ Về dung môi chiết xuất:
Dung môi chiết xuất: Tiến hành khảo sát sơ bộ, lựa chọn dung môi ethanol – nước để chiết xuất do đây là dung môi an toàn, dễ kiếm, sử dụng phổ biến trong công nghiệp Khảo sát dung môi ethanol – nước, kết quả sơ bộ cho thấy dung môi ethanol 90% cho hàm lượng quercetin chiết được cao nhất, phù hợp với độ tan của quercetin – tan trong dung môi ít phân cực, ít tan trong nước
➢ Về thời gian chiết xuất:
Quá trình chiết hoạt chất diễn ra theo cơ chế khuếch tán, đòi hỏi thời gian để hoạt chất hòa tan từ dược liệu vào môi trường chiết Khi nồng độ hoạt chất trong môi trường chiết đạt trạng thái cân bằng, quá trình khuếch tán ngừng lại Nếu kéo dài thời gian chiết, hàm lượng hoạt chất chiết được không tăng thêm; ngược lại, hàm lượng tạp chất gia tăng, làm giảm nồng độ hoạt chất trong sản phẩm chiết.
Thời gian chiết xuất cho thấy với khi chiết xuất 30 phút cho hàm lượng quercetin cao nhất Khảo sát chưa cố định nhiệt độ chiết nên nhiệt độ chiết là tác nhân làm thay đổi hàm lượng các chất chiết được trong dịch chiết
Các thông số cho giá trị cao nhất có sự tương đồng với nghiên cứu trước đó của
Lê Thảo My và cộng sự, khi lựa chọn các thông số để tối ưu hóa chiết xuất flavonoid [37]
➢ Về chế biến hỏa chế:
31 Đối với các mẫu dược liệu đã qua hỏa chế, hàm lượng quercetin thay đổi rất nhiều, đa số có xu hướng tăng đến một mức nhiệt độ nhất định sau đó giảm
Kết quả có sự tương đồng với kết quả của đề tài tốt nghiệp dược sĩ của Khương Thị Mai Lan “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến flavonoid trong hòe hoa” Khi tăng nhiệt độ hàm lượng rutin giảm, hàm lượng quercetin tăng lên Điều này có thể giải thích do ở điều kiện nhiệt độ xử lý, độ bền cơ học của tế bào dược liệu giảm, chất nguyên sinh bị đông vón nên dung môi dễ dàng thấm vào và khuếch tán hoạt chất ra khỏi tế bào thuận lợi hơn [5]
Hàm lượng quercetin đạt giá trị cao nhất khi hỏa chế dược liệu ở mức nhiệt tương ứng với khoảng sao đen/sao cháy (160-180 o C) Kết quả có sự tương đồng với nghiên cứu trước đó [31]
Trong quá trình chế biến dược liệu bằng phương pháp hỏa chế, điều kiện chiết xuất và chế biến (nhiệt độ sấy, thời gian sấy) đóng vai trò quan trọng nhất đối với hàm lượng hoạt chất Nhiệt độ và thời gian sấy có thể làm tăng đáng kể hàm lượng quercetin trong dược liệu, nhưng ngược lại cũng làm giảm một số chất khác Do đó, phương pháp hỏa chế có thể được ứng dụng để điều chỉnh hàm lượng các hoạt chất mong muốn hoặc giảm các chất không mong muốn, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm trong công nghiệp dược liệu.