lê thị mai linh nghiên cứu chiết xuất và đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú mcf 7 của hoa đu đủ đực carica papaya l

Đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn .... Kết quả đánh giá đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của

BỘ Y TẾ

-🙞🙜🕮🙞🙜 -

LÊ THỊ MAI LINH

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCF-7 CỦA HOA ĐU

ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày những nội dung trong khóa luận tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn đồng hành, giúp đỡ và động viên em hoàn thành nghiên cứu của mình một cách tốt nhất

Em xin được gửi lời cảm ơn tới và PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn – Giảng viên bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, người hướng dẫn và định hướng

cho em trong những ngày đầu tiên em nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược liệu

Em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn tới PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng – Trưởng khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu, người đã dành nhiều thời gian,

tâm huyết để hướng dẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp Cô còn chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm và truyền cho em niềm đam mê với nghiên cứu khoa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trần Thị Hồng Vân, TS Lê Thành Nghị cùng các anh chị tại khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu đã giúp đỡ tận

tình và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong quá trình thực nghiệm tại khoa cũng như hoàn thiện khóa luận này

Nhân dịp này, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy luôn nhiệt huyết truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, quan tâm và là chỗ dựa vững chắc khi em gặp khó khăn trong học tập và cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Lê Thị Mai Linh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về hoa Đu đủ đực 2

1.1.1 Vị trí, phân loại và đặc điểm thực vật của cây Đu đủ 2

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Thành phần hóa học 3

1.1.4 Công dụng trong dân gian 6

1.1.5 Tính vị quy kinh, công năng, chủ trị [7] 6

1.1.6 Tác dụng dược lý 6

1.2.Phương pháp chiết xuất 9

1.2.1 Các phương pháp chiết xuất hoa Đu đủ đực trong các nghiên cứu trước đây 9

1.2.2 Phương pháp bào chế cao tổng quát 10

1.3.Một số cơ chế tác dụng chống ung thư của các nhóm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên 101.3.1 Tác dụng theo cơ chế ức chế hoặc cảm ứng enzym 11

1.3.2 Tác dụng theo cơ chế ức chế tăng sinh tế bào ung thư 11

1.3.3 Tác dụng theo cơ chế gây nhiễu chu kỳ tế bào 12

1.3.4 Tác dụng theo cơ chế cảm ứng gây chết tế bào theo chương trình 12

1.3.5 Tác dụng theo cơ chế chống oxy hóa 12

1.3.6 Tác dụng theo cơ chế ngăn ngừa quá trình tạo mạch 12

1.3.7 Tác dụng theo cơ chế qua kênh PgP 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1.Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Hóa chất, dung môi 14

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 15

2.1.4 Dòng tế bào 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 17

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 19

2.4 Xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 22

3.1 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 22

3.1.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần 22

3.2 Tiến hành chiết phân đoạn 25

3.2 Đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn 26

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 29

4.1 Về mô hình nghiên cứu 29

4.1.1 Về đối tượng nghiên cứu 29

4.1.2 Về dòng tế bào lựa chọn để đánh giá tác dụng gây độc tính 29

4.1.3 Về lựa chọn các yếu tố trong quy trình chiết xuất cao toàn phần 29

4.2.Về kết quả nghiên cứu 31

4.2.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 31

4.2.2 Kết quả đánh giá đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của cao toàn phần và các cao phân đoạn 31

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33

DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ABTS 2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid)

ADN Acid deoxyribonucleic

COX Enzym xúc tác cho sự chuyển đổi acid arachidonic thành

prostaglandin (Cyclooxygenase)

DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

FBS Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

GLOBOCAN Tổ chức Ghi nhận Ung thư toàn cầu (Global Cancer Observatory)

HR-ESI-MS Ion hóa phun điện tử khối phổ phân giải cao (High-resolution

electrospray ionisation mass spectrometry)

IC50

Nồng độ ức chế tối đa 50% (Half maximal inhibitory concentration)

MAE Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ của vi sóng (Microwave

assisted extraction)

MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú, được nghiên cứu bởi quỹ ung thư

Michigan (Michigan Cancer Foundation-7)

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration)

MRP Protein đa kháng thuốc (Multidrug resistance protein)

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide

NMR Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic

resonance)

OD Mật độ quang (Optical density)

PBS Dung dịch đệm phosphat (Phosphate-Buffered Saline)

PIP3 Phosphoinositid 3-kinase

PTK Protein tyrosin kinase

ROS Nhóm oxy hoạt động (Reactive oxygen species)

SPF Yếu tố chống nắng (Sun protection factor)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 IC50 của cao chiết và các phân đoạn từ hoa Đu đủ đực trên dòng tế bào

ung thư vú MCF-7 [63] 7

Bảng 1.2 IC50 của các hợp chất trong hoa Đu đủ đực trên enzym tyrosinase 8

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất trong nghiên cứu 14

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ, thiết bị trong nghiên cứu 15

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết xuất cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực 22

Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm hợp chất bằng phản ứng hóa học trong cao chiết bằng phương pháp ngâm, siêu âm, hồi lưu 23

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình chiết xuất cao từ hoa Đu đủ đực quy mô 100g 24

Bảng 3.4 Khối lượng và hiệu suất chiết cao phân đoạn hoa Đu đủ đực 26

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các cao chiết hoa Đu đủ đực đối với khả năng sống sót của tế bào MCF-7 thể hiện qua % tế bào sống sót 27

Bảng 3.6 Kết quả IC50 của các cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn với chứng dương được sử dụng là tamoxifen 27

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Một số hình ảnh về cây Đu đủ [6], [9] 3

Hình 1.3 Một số alcaloid có hoạt tính sinh học trong hoa Đu đủ đực [61] 4

Hình 1.4 Một số flavonoid có trong hoa Đu đủ đực [85] 5

Hình 1.5 Caricapapayol [47] 5

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình bào chế cao tổng quát [2] 10

Hình 2.1 Một số hình ảnh hoa Đu đủ đực 14

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu của khóa luận 17

Hình 2.4 (A) Công thức cấu tạo của MTT và sản phẩm khử formazan; (B) phổ hấp thụ MTT và MTT formazan trong cùng nồng độ 20

Hình 3.1 Hiệu suất chiết cao toàn phần theo phương pháp chiết 22

Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực 24

Hình 3.3 Sơ đồ chiết các cao phân đoạn hoa Đu đủ đực 26

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo số liệu thống kê của GLOBOCAN 2022, ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn cầu, chiếm 24,5% tổng số ca ung thư mới được chẩn đoán ở phụ nữ và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư ở phụ nữ với 685.000 ca tử vong trong năm 2020 [78] Phương pháp điều trị ung thư chủ yếu hiện nay là phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp nội tiết [41] Tuy nhiên, ngay cả khi bệnh nhân ung thư vú ở giai đoạn đầu được điều trị bằng các phương pháp điều trị nêu trên, 30 - 40% bệnh nhân vẫn bị tái phát và di căn [25] và thường dẫn đến các tác dụng không mong muốn [55] Bên cạnh đó, chi phí trực tiếp điều trị ung thư vú tại Việt Nam năm 2019, tổng chi phí trực tiếp trung bình lên đến 135.289.000 VNĐ [1] Trong đó các nhóm chi phí tiền túi hộ gia đình chiếm tỷ trọng lớn [1] Nghiên cứu phân tích giữa mối tương quan giữa chi phí – hiệu quả cho thấy chi phí điều trị ung thư vú với các phương pháp trên khá cao, trở thành gánh nặng kinh tế với người bệnh và cả xã hội [17] Việc nghiên cứu và sử dụng thảo dược và phát triển thành thuốc chống ung thư đang được một số quốc gia giàu tài nguyên thực vật đặc biệt chú trọng, trong đó có Việt Nam [52]

Với sự phổ biến, được trồng trên khắp cả nước, hoa Đu đủ đực từ lâu được sử dụng để điều trị ho, vàng da và hạ sốt [85] Mặc dù, khả năng kháng ung thư của các hợp chất tách ra từ hoa Đu đủ đực chưa được nghiên cứu, nhưng một trong số những hợp chất này là quercetin đã được chứng minh là có tính chất chống oxy hóa, bảo vệ tế bào, kháng virus và kháng khuẩn Chất này có nhiều tác dụng chống oxy hóa và tăng cường biệt hóa tế bào Một số dẫn xuất của quercetin cũng có tác dụng gây độc cho tế bào ung thư vú [27], [30]

Để khảo sát tiềm năng chống ung thư của hoa Đu đủ đực làm cơ sở cho các nghiên

cứu xa hơn, đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào

ung thư vú MCF-7 của hoa Đu đủ đực (Carica papaya L.)” được thực hiện với hai

mục tiêu như sau: 1 Xây dựng quy trình chiết xuất cao từ hoa Đu đủ đực 2 Đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của cao chiết toàn phần

và các cao phân đoạn từ hoa Đu đủ đực

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hoa Đu đủ đực

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây Đu đủ

Vị trí phân loại: Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya (L.) [9], được

phân loại thực vật học như sau [79]:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Sổ (Dilleniidae)

Bộ Đu đủ (Caricales)

Họ Đu đủ (Caricaceae)

Chi Carica

Loài Carica papaya L

Đặc điểm thực vật: Cây Đu đủ cao từ 3 đến 7 m, thân thẳng, đôi khi có phân nhánh Vỏ mang rất nhiều sẹo của cuống lá Lá mọc so le ở ngọn cây, phiến lá to rộng chia làm 6-9 thùy, thùy hình trứng nhọn, mép có răng cưa không đều, cuống lá rỗng và dài 30-50cm Hoa trắng nhạt hay xanh nhạt, khác gốc Hoa đực mọc ở kẽ lá thành chùy có cuống rất dài Hoa cái có tràng dài hơn tràng của hoa đực, mọc thành chùy ở kẽ lá Quả thịt, hình trứng to, dài 20-30cm, đường kính 15- 20cm Thịt quả dày, lúc đầu có màu xanh lục, sau ngả màu vàng cam Trong ruột quả có rất nhiều hạt đen to bằng hạt tiêu, xung quanh có lớp nhầy Mùa hoa quả từ tháng 5 đến tháng 10 [9], [16] Đặc điểm sinh thái: Đu đủ là loại cây trồng nhiệt đới, ưa khí hậu nóng và ẩm Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng là 21-33°C, lượng mưa hàng năm ˃ 1200 mm Cây sống được trên nhiều loại đất, song yêu cầu phải thoát nước nhanh Đu đủ không chịu được ngập úng quá 20 giờ Ở Việt Nam, cây không trồng được ở vùng núi cao lạnh (trên 1500m) Đu đủ là cây sinh trưởng nhanh Cây trồng từ hạt sau 4 - 5 tháng có thể ra hoa [16]

Hình 1.1 Một số hình ảnh về cây Đu đủ [6], [9]

1.1.2 Phân bố

Đu đủ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ song nguồn gốc xuất hiện các giống trồng trọt vẫn chưa được rõ ràng Đu đủ chủ yếu được trồng ở các nước vùng nhiệt đới như Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Myanma, Malaysia, Indonesia (Châu Á); Uganda (châu Phi); Brasil, Equado, Hoa Kỳ (châu Mỹ); Úc, New Zealand (châu Đại Dương) [14]

Ở Việt Nam, Đu đủ là cây trồng khá lâu đời và chưa xác định được cụ thể thời gian cây được nhập vào Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Tuy nhiên chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa [14]

1.1.3.1 Alcaloid

Theo nghiên cứu của Mukhaimin và cộng sự (2019), chiết xuất hoa Đu đủ đực bằng phương pháp chiết xuất rắn-lỏng, chiết lỏng-lỏng và phương pháp chiết dưới sự hỗ trợ của vi sóng (MAE) Tổng hàm lượng alcaloid cao nhất là 0,02981 mg/g Các alcaloid bao gồm carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain, được tìm thấy trong cao chiết MeOH 80% từ hoa Đu đủ đực [60]

1 Carpain 2 Pseudocarpain 3 Dehydrocarpain

Hình 1.3 Một số alcaloid có hoạt tính sinh học trong hoa Đu đủ đực [60]

1.1.3.2 Flavonoid

Theo Van và cộng sự (2020), các loại flavonoid có trong hoa Đu đủ đực là

quercetin, quercitrin, quercetin 3-O-(6''-galloyl)-β-D-galactopyranosid, myricitrin,

kaempferol, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosid, kaempferol glucopyranosid và kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranosid [84]

3-O-β-D-1 Quercetin 2 Quercitrin 3 Quercetin

3-O-(6''-galloyl)-β-D-galactopyranosid

4 Myricitrin 5 Kaempferol 6 Kaempferol

3-O-α-L-rhamnopyranosid

7 Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid 8 Kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranosid

Hình 1.4 Một số flavonoid có trong hoa Đu đủ đực [84]

1.1.4 Công dụng trong dân gian

Theo những cách sử dụng trong dân gian, hoa Đu đủ đực được sử dụng để điều trị ho, vàng da và hạ sốt [85] Hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa ho, viêm phổi, mất tiếng [16]

1.1.5 Tính vị quy kinh, công năng, chủ trị [7]

Hoa Đu đủ đực có: + Tính bình, vị đắng + Quy kinh phế, tỳ + Công năng: Ích phế trừ đàm + Chủ trị: Khái thấu

1.1.6 Tác dụng dược lý

Hoa Đu đủ đực chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có tác dụng dược lý, bao gồm khả năng chống oxy hóa, gây độc với tế bào ung thư, kháng khuẩn, hạ đường huyết, giảm đau, hạ lipid máu, diệt trừ sâu, ức chế tyrosinase và chống tia UV [67]

- Các cao chiết methanol 99,8%, cloroform, n-hexan được đánh giá bằng phương

pháp DPPH. Cao chiết có khả năng khử gốc tự do DPPH cao nhất là cao chiết n-hexan

với khả năng khử gốc tự do DPPH là 64,07% [36];

- Cao chiết EtOH 70% từ hoa Đu đủ đực (100 ppm): được đánh giá bằng khả năng trung hòa gốc tự do ABTS.+ với IC₅₀ là 4,8946 ppm thu được khi hoạt động chống oxy hóa được đánh giá phương pháp xác định khả năng trung hòa gốc tự do ABTS+

(acid 2,2 – azinobis – 3 ethyl benzothiazolin – 6 – sulfonic) [82]

1.1.6.2 Độc tính trên tế bào

- Trên dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng ở người (WiDr Cell):

+ Cao chiết chiết EtOH 96% phân đoạn n-hexan được đánh giá tính ức chế tế bào theo

phương pháp MTT, cho thấy cao chiết có độc tính với tế bào với IC50 = 64,105 µg/ml [75]

+ Cao chiết EtOH 96% phân đoạn hexan (8, 16, 24 và 32 μg/ml) được đánh giá bằng phương pháp dòng chảy tế bào cho thấy có tác dụng chặn chu kỳ tế bào trong các pha G0-G1, S và G2-M [90]

- Trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7: Cao chiết EtOH 96% và các cao phân

đoạn n-hexan, phân đoạn ethyl acetat, phân đoạn nước của hoa Đu đủ đực thu hái tại

tỉnh Bắc Sumatra, Indonesia đã được đánh giá khả năng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 theo phương pháp MTT với IC₅₀ trong bảng dưới đây [62]

Bảng 1.1 IC50 của cao chiết và các phân đoạn từ hoa Đu đủ đực trên dòng tế bào

ung thư vú MCF-7 [62]

Cao chiết EtOH 96% IC₅₀ = 55,875 μg/ml

Phân đoạn n-hexan IC₅₀ = 101,282 μg/ml

Phân đoạn etylacetat IC₅₀ = 148,692 μg/ml

- Trên dòng tế bào ung thư biểu mô gan Hep-G2: Cao chiết chiết xuất siêu âm

có độc tính trên tế bào ung thư gan Hep-G2 với IC₅₀ là 56,63 ± 1,25 μg/ml [50]

1.1.6.3 Tính kháng khuẩn

- Escherichia coli: Cao chiết methanol 99,8% của hoa Đu đủ đực được đánh giá bằng

phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy bán kính của vùng ức chế là 4,00 ± 0,08

mm [36]

- Staphylococcus aureus: Theo kết quả phương pháp định lượng MIC, phân đoạn etyl

acetat của cao chiết ethanol 70% từ hoa Đu đủ đực có khả năng ức chế tối thiểu đối với vi khuẩn ở nồng độ 5% [93]

1.1.6.4 Tác dụng hạ đường huyết

- Trên mô hình gây đái tháo đường ở chuột Wistar bằng Alloxan: Liều 260 mg/kgBW cao chiết EtOH 96% hoa Đu đủ đực có thể làm giảm lượng đường trong máu ở chuột gây tăng đường huyết bởi alloxan [81]

- Trên mô hình gây đái tháo đường ở chuột đực Balb/C bằng chất cảm ứng Streptozocin: Liều 400 và 500 mg/kgBW của cao chiết EtOH 96% hoa Đu đủ đực có tác dụng hạ đường huyết tốt hơn so với chứng dương Glibenclamid [86]

1.1.6.5 Tác dụng giảm đau

Trên mô hình gây đau bằng phương pháp mâm nóng ở chuột nhắt trắng: Liều 75, 150 và 300 mg/KgBW cao chiết EtOH 70% từ hoa Đu đủ đực đã được chứng minh là có hiệu quả như một thuốc giảm đau ở chuột trong thời gian 12 phút với chứng dương là Paracetamol [58]

1.1.6.6 Hạ mỡ máu

Trên mô hình gây béo phì ở chuột đực Sprague dawley: Cao chiết EtOH 96% với liều 31, 62, 125 mg/KgBW làm tăng đáng kể HDL trung bình và giảm mức LDL trung bình [38]

1.1.6.7 Ức chế L-tyrosine

Các hợp chất trong hoa Đu đủ đực cho thấy hoạt tính ức chế tyrosinase với các giá trị IC₅₀ được trình bày ở bảng 1.2 với chứng dương là acid kojic có IC50 = 11,3 ± 1,6 μM [45]

Bảng 1.2 IC50 của các hợp chất trong hoa Đu đủ đực trên enzym tyrosinase

Caricapapayol

Thử nghiệm in vitro: Kem có chứa cao chiết ethanol ở nồng độ 5%, 10%, 15%

Giá trị SPF của mỗi công thức tương ứng là 15,04; 18,75 và 22,12 Giá trị SPF cho thấy khả năng bảo vệ chống lại tia UV [21]

1.1.6.9 Khả năng diệt côn trùng

Thử nghiệm cao chiết ethanol 25%, 50% và 75% trên các lô ruồi, mỗi lô gồm 30 con cho thấy tỷ lệ tử vong do ruồi thấp nhất là 76,67% (23 con ruồi) với nồng độ 25% và cao nhất là 97% (28 con ruồi) với nồng độ 75% [43]

1.2 Phương pháp chiết xuất

1.2.1 Các phương pháp chiết xuất hoa Đu đủ đực trong các nghiên cứu trước đây

Một vài phương pháp chiết xuất hoa Đu đủ đực được sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học:

- Chưng bột hoa Đu đủ đực trong nước cất một lần ở nhiệt độ 100°C với các tỉ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10/1; 20/1; 40/1; 60/1; 80/1; 100/1 (v/w) trong các khoảng thời gian 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 giờ thu được các cao chiết nước tương ứng Sau đó, tiến hành cô quay chân không các cao chiết nước đến khối lượng không đổi thu được các cao nước với khối lượng tương ứng [15]

- Phương pháp chiết sử dụng siêu âm: Qua tối ưu hóa các thông số chiết siêu âm bằng RSM, trong điều kiện chiết xuất tối ưu bao gồm thời gian chiết xuất 33 phút, công suất siêu âm 240 W, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 27:1 ml/g và nhiệt độ chiết xuất là 46oC, hàm lượng flavonoid thu được là 10,648 ± 0,228 mg QE/g [50]

- Phương pháp chiết kết hợp xử lý enzym: Qua tối ưu hóa, điều kiện chiết xuất được tìm thấy là ở pH 7 với 1,5 mg/ml cellulase, tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:10 (g/ml),

thời gian chiết là 4 giờ và ở nhiệt độ chiết là 65oC Năng suất chiết xuất papain đã đạt tới 3,8018 μmol với 2,0910 đơn vị/ml trong mẫu dược liệu xử lý enzym [94]

1.2.2 Phương pháp bào chế cao

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các cao chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp [4]

Cao thuốc được chia làm 3 loại [4]: Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc

Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Dưới đây là sơ đồ tổng quát mô tả quy trình bào chế cao [2]:

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình bào chế cao tổng quát [2] 1.3 Một số cơ chế tác dụng chống ung thư của các nhóm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên

Ung thư vú là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán ở phụ nữ [76] Các yếu tố tiên lượng bao gồm: Tuổi, kích thước u nguyên phát, tình trạng di căn hạch nách, loại mô học và độ mô học [11]

Mối liên hệ giữa ung thư và stress oxy hóa lần đầu được công bố bởi Warburg (1956) [88] Theo đó, khi sản xuất dư thừa, các gốc tự do làm thay đổi cấu trúc của các chất sinh học trong cơ thể con người như protein, lipid, lipoprotein và ADN Những thay đổi này dẫn đến một loạt các hoạt động tiền ung thư của tế bào như thúc đẩy chu kỳ tế bào, lão hóa, hoại tử tế bào và sự loại bỏ lẫn nhau của các tế bào [63] Từ đó, hướng nghiên cứu về sự tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào đã được chú ý đến nhiều hơn [5]

Thành phần hóa học có trong các thảo dược như flavonoid, alcaloid, terpenoid, coumarin, saponin đã được biết đến với các đặc tính chống ung thư Bằng cách gây nhiễu chu kỳ tế bào, gây chết theo chương trình, thay đổi chương trình chuyển hóa tế bào, ức chế sự kết dính, tăng sinh và di chuyển của tế bào, đồng thời ngăn chặn các con đường truyền tín hiệu quan trọng đối với sự tiến triển của ung thư, các dược liệu có thể hỗ trợ phòng ngừa và điều trị ung thư vú [44], [65], [68] Tuy nhiên, một số chất có hoạt tính sinh học như phytoestrogen (hợp chất phenol có cấu trúc tương tự như estrogen) và isoflavonoid có thể đóng vai trò là chất gây rối loạn nội tiết, thường là nguyên nhân dẫn đến ung thư vú [23]

1.3.1 Tác dụng theo cơ chế ức chế hoặc cảm ứng enzym

Cơ chế quan trọng mà flavonoid có thể phát huy tác dụng là thông qua sự ức chế các enzym chuyển hóa giai đoạn I Các enzym này chuyển hóa các chất gây ung thư thành chất trung gian phản ứng có thể tương tác với các nucleophil tế bào và dẫn đến ung thư Flavonoid ức chế hoạt động của một số isoenzym P450 như CYP1A1 và CYP1A2 [48], [49]

Một cơ chế khác là cảm ứng các enzym chuyển hóa giai đoạn II như S-transferase, quinon reductase và UDP-glucuronyl transferase [26], [77], theo đó các chất gây ung thư được thải trừ, dễ dàng bị loại bỏ khỏi cơ thể

glutathione-Aromatase – enzym tổng hợp estrogen từ androgen Ức chế aromatase là một cách tiếp cận quan trọng để giảm tác dụng của estrogen trong ung thư vú phụ thuộc hormone Do đó, flavonoid có thể được coi là tác nhân tiềm năng chống lại ung thư vú thông qua việc ức chế mạnh aromatase [31], [87]

1.3.2 Tác dụng theo cơ chế ức chế tăng sinh tế bào ung thư

Phòng ngừa ung thư thường liên quan đến ức chế, đảo ngược hoặc chậm tăng sinh tế bào Hầu hết các flavonoid ức chế sự tăng sinh trong nhiều loại dòng tế bào ung

thư ở người, nhưng ít/không có độc hại đối với các tế bào bình thường [47], [66], [89]

Flavonoid đặc biệt hiệu quả trong việc ức chế xanthin oxidase [29], COX hoặc LOX [61] do đó ức chế sự tăng sinh khối u

Ornithin decarboxylase là một enzym tăng tốc độ trong sinh tổng hợp polyamin, tốc độ tổng hợp ADN và tăng sinh tế bào ở một số mô Một số thí nghiệm cho thấy flavonoid có thể ức chế ornithin decarboxylase gây ra bởi các chất kích thích khối u, và do đó gây ra sự giảm polyamin sau đó và ức chế tổng hợp ADN/protein [56] cũng có hiệu quả trong việc ức chế các enzym truyền tín hiệu, ví dụ, protein tyrosin kinase (PTK) [37], protein kinase C (PKC) [53] và phosphoinositid 3-kinase (PIP3) [71]

Ngoài ra, các saponin có thể nhận ra các tế bào ung thư, bởi vì các tế bào ung thư có màng tế bào và cấu trúc khác với các tế bào bình thường Màng tế bào ung thư chứa nhiều hợp chất hơn như cholesterol Saponin có thể liên kết cholesterol có trong màng tế bào ung thư, do đó phá vỡ tính thấm của màng[68]

1.3.3 Tác dụng theo cơ chế gây nhiễu chu kỳ tế bào

Tín hiệu phân bào đảm bảo các tế bào lần lượt bước vào chu kỳ tế bào Tổng hợp ADN (pha S) và tách hai tế bào con (pha M) là những đặc điểm chính của sự tiến triển chu kỳ tế bào Thời gian giữa các pha S và M được gọi là pha G2 Giai đoạn này rất quan trọng để cho phép các tế bào sửa chữa các lỗi xảy ra trong quá trình sao chép ADN, ngăn chặn sự lan truyền của các lỗi này sang các tế bào con Ngược lại, pha G1 đại diện cho giai đoạn cam kết tiến triển chu kỳ tế bào tách các pha M và S khi các tế bào chuẩn bị sao chép ADN dựa trên tín hiệu phân bào Do đó, các chất ức chế hoặc điều biến sẽ được quan tâm để khám phá như các tác nhân điều trị mới trong bệnh ung thư [72], [73] Các điểm kiểm tra ở cả G1/S và G2/M của chu kỳ tế bào trong các dòng tế bào ung thư nuôi cấy đã được tìm thấy bị nhiễu loạn bởi các flavonoid như silymarin, genistein, quercetin, daidzein, luteolin, kaempferol, apigenin và epigallocatechin 3-gallat [27], [30], [92]

1.3.4 Tác dụng theo cơ chế cảm ứng gây chết tế bào theo chương trình

Flavonoid đã được chứng minh là gây ra apoptosis ở một số dòng tế bào ung thư, không gây độc trên các tế bào bình thường Một số cơ chế có thể liên quan, bao gồm ức chế hoạt động của ADN topoisomerase I / II [22], [59], giảm các loại oxy phản ứng (ROS) [51], điều hòa biểu hiện protein sốc nhiệt [70]

1.3.5 Tác dụng theo cơ chế chống oxy hóa

Flavonoid có thể chống lại ung thư thông qua việc hạn chế các phản ứng oxy hóa gây hại trong tế bào, có thể dẫn đến sự phát triển của ung thư Flavonoid với các nhóm

hydroxyl hoạt động như chất chống oxy hóa trong nuôi cấy tế bào in vitro; khử anion

superoxid, gốc peroxy lipid hoặc ổn định các gốc tự do thông qua quá trình hydro hóa [35]

1.3.6 Tác dụng theo cơ chế ngăn ngừa quá trình tạo mạch

Các chất ức chế sự hình thành mạch như flavonoid, có thể can thiệp vào các bước khác nhau của quá trình tạo mạch, như phá hủy các mạch máu, tăng sinh và di chuyển các tế bào nội mô, hoặc sự hình thành lumen Do đó, các hợp chất này có thể có tiềm năng điều trị các khối u rắn [83]

Saponin cũng làm giảm sự xuất hiện của các loại oxy phản ứng như H2O2 và ức chế các con đường tín hiệu phosphatidyl inositol-3 kinase, ngừa tổn thương nhiễm sắc

thể [65]

1.3.7 Tác dụng theo cơ chế qua kênh PgP

Đa kháng thuốc do P-glycoprotein (PgP) hoặc protein liên quan đến đa kháng thuốc (MRP) là một trở ngại nghiêm trọng đối với hóa trị ung thư Nhiều nỗ lực đã được dành ra để điều chỉnh tình trạng đa kháng thuốc ở các loài khác nhau bằng cách sử dụng các chất ức chế cụ thể, nhưng nói chung ít thành công Một số flavonoid có hoạt tính ức chế mạnh chống lại chức năng kháng thuốc của PgP Cơ chế bởi flavonoid của đa kháng thuốc tế bào qua kênh PgP có thể thông qua:

(i) Ức chế sự biểu hiện quá mức của gen đa kháng thuốc-1 (MDR1) [46] (ii) Liên kết trực tiếp với miền liên kết nucleotid có ái lực cao [46]

(iii) Ức chế hoạt động ATPase, thủy phân nucleotid và tương tác thuốc phụ

thuộc năng lượng với màng làm giàu chất vận chuyển [33] Đặc tính độc đáo của sự đảo ngược đa kháng thuốc của các hợp chất này có thể giúp bảo vệ chống lại các khối u đa kháng thuốc [32]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu là hoa của cây Đu đủ đực được thu hái vào tháng 6/2023 tại huyện An Dương, Hải Phòng Mẫu cây đã được lưu mẫu tại Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện dược liệu

Hình 2.1 Một số hình ảnh hoa Đu đủ đực

2.1.2 Hóa chất, dung môi

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất trong nghiên cứu

6 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco, Hoa Kỳ

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

8 Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) Gibco, Hoa Kỳ

10 Phosphate-Buffered Salin (PBS) Thermo Fisher,

Hoa Kỳ

11

(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromid) (MTT) Invitrogen, Hoa Kỳ

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ, thiết bị trong nghiên cứu

1 Dụng cụ thường quy phòng thí nghiệm Trung Quốc

STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất

17 Đĩa nuôi cấy tế bào 100mm Becton Dickinson, Pháp

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Xây dựng quy trình chiết xuất cao và tiến hành chiết cao phân đoạn từ hoa

của cây Đu đủ đực

- Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế tế bào MCF-7 của các phân đoạn cao chiết hoa

Đu đủ đực, từ đó định tính các phân đoạn cao chiết có tác dụng Thiết kế nghiên cứu của khóa luận được tóm tắt ở sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu của khóa luận 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

Trong khóa luận này, hoa Đu đủ được phơi khô trong bóng râm hoặc sấy ở nhiệt độ không quá 60oC để đạt độ ẩm dưới 12%, sau đó được xay thô, rây qua rây có kích thước lỗ sàng 5 mm, bảo quản trong túi zip nilon kín để tránh ẩm và ánh sáng

Mỗi mẻ chiết được tiến hành với 10,0 g dược liệu Sau khi lọc, gộp dịch chiết của 2 lần chiết và thu hồi dung môi ở áp suất giảm Dung môi sau khi được thu hồi sẽ cho cao đặc, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60oC đến khi thu được cao khô có hàm ẩm không quá 5%

2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực

- Xử lý nguyên liệu: Hoa Đu đủ đực được tách riêng khỏi các phần dược liệu khác, sấy

ở nhiệt độ 60oC trong tủ sấy thông gió Trong quá trình sấy, đảo nguyên liệu, kiểm tra độ ẩm của nguyên liệu mỗi 1 giờ 1 lần cho đến khi độ ẩm nguyên liệu < 12%

Nguyên liệu được xay thô, rây qua rây có kích thước lỗ sàng 5 mm, bảo quản trong túi zip nilon kín để tránh ẩm và ánh sáng

- Tiến hành chiết cao toàn phần:

Cân khoảng 10,0 g dược liệu hoa Đu đủ đực Tiến hành song song 2 mẻ với cùng phương pháp chiết Tiến hành chiết 2 lần với dung môi EtOH 80%; tỷ lệ dung môi/dược

liệu của lần 1 là 7 ml/g; lần 2 là 5 ml/g Tiếp tục tiến hành chiết theo các phương pháp khác nhau như sau:

+ Phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng: Ngâm dược liệu trong cốc có mỏ 500ml, 3

ngày tại nhiệt độ phòng, khuấy trộn 1 lần/ngày Lọc, gộp dịch của 2 lần chiết và thu hồi dung môi tại áp suất giảm, thu được cao toàn phần, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60oC cho đến khi thu được cao khô có hàm ẩm ≤ 5%

+ Phương pháp chiết siêu âm: Dược liệu đã ngâm được siêu âm 30 phút tại nhiệt độ

của bể siêu âm (37oC) Lọc, gộp dịch của 2 lần chiết và thu hồi dung môi tại áp suất giảm, thu được cao toàn phần, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60oC cho đến khi thu được cao khô có hàm ẩm ≤ 5%

+ Phương pháp chiết hồi lưu: Dược liệu sau khi ngâm được chiết hồi lưu tại nhiệt độ

80oC (nhiệt độ sôi của dung môi) trong 1,5 giờ (kể từ lúc sôi) Lọc, gộp dịch của 2 lần chiết và thu hồi dung môi tại áp suất giảm, thu được cao toàn phần, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60oC cho đến khi thu được cao khô có hàm ẩm ≤ 5%

Đánh giá các phương pháp chiết xuất dựa trên thông số là hệ suất chiết cao:

+ Hiệu suất chiết cao (%)

H(%) = mcao× (100 − acao)

mdl× (100 − adl) × 100 Trong đó:

mcao : khối lượng cao chiết được (g) mdl: khối lượng dược liệu đem chiết (g) acao: độ ẩm của cao (%)

adl: độ ẩm của dược liệu (%)

2.3.1.2 Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong mẫu cao thu được

Định tính các nhóm chất chính bằng phản ứng hóa học thường quy của các cao phân đoạn theo theo sách giáo trình Thực tập Dược liệu [3]

- Tiếp tục tiến hành phương pháp chiết xuất có hiệu suất chiết cao toàn phần cao nhất, thành phần gồm các nhóm chất có tác dụng trên tế bào ung thư với lượng dược liệu là 100 g với các điều kiện chiết tương tự, từ đó chiết xuất cao cao phân đoạn

2.3.1.3 Phương pháp chiết phân đoạn

Dựa vào tính chất dung môi ít phân cực dễ dàng hòa tan các chất không phân cực, khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và ngược lại, dung môi phân cực mạnh