lê thị mai linh nghiên cứu chiết xuất và đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú mcf 7 của hoa đu đủ đực carica papaya l

Đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn .... Kết quả đánh giá đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của

TỔNG QUAN

Tổng quan về hoa Đu đủ đực

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây Đu đủ

Vị trí phân loại: Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya (L.) [9], được phân loại thực vật học như sau [79]:

Loài Carica papaya L Đặc điểm thực vật: Cây Đu đủ cao từ 3 đến 7 m, thân thẳng, đôi khi có phân nhánh Vỏ mang rất nhiều sẹo của cuống lá Lá mọc so le ở ngọn cây, phiến lá to rộng chia làm 6-9 thùy, thùy hình trứng nhọn, mép có răng cưa không đều, cuống lá rỗng và dài 30-50cm Hoa trắng nhạt hay xanh nhạt, khác gốc Hoa đực mọc ở kẽ lá thành chùy có cuống rất dài Hoa cái có tràng dài hơn tràng của hoa đực, mọc thành chùy ở kẽ lá Quả thịt, hình trứng to, dài 20-30cm, đường kính 15- 20cm Thịt quả dày, lúc đầu có màu xanh lục, sau ngả màu vàng cam Trong ruột quả có rất nhiều hạt đen to bằng hạt tiêu, xung quanh có lớp nhầy Mùa hoa quả từ tháng 5 đến tháng 10 [9], [16] Đặc điểm sinh thái: Đu đủ là loại cây trồng nhiệt đới, ưa khí hậu nóng và ẩm Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng là 21-33°C, lượng mưa hàng năm ˃ 1200 mm Cây sống được trên nhiều loại đất, song yêu cầu phải thoát nước nhanh Đu đủ không chịu được ngập úng quá 20 giờ Ở Việt Nam, cây không trồng được ở vùng núi cao lạnh (trên 1500m) Đu đủ là cây sinh trưởng nhanh Cây trồng từ hạt sau 4 - 5 tháng có thể ra hoa [16]

Hình 1.1 Một số hình ảnh về cây Đu đủ [6], [9]

1.1.2 Phân bố Đu đủ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ song nguồn gốc xuất hiện các giống trồng trọt vẫn chưa được rõ ràng Đu đủ chủ yếu được trồng ở các nước vùng nhiệt đới như Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Myanma, Malaysia, Indonesia (Châu Á); Uganda (châu Phi); Brasil, Equado, Hoa Kỳ (châu Mỹ); Úc, New Zealand (châu Đại Dương) [14] Ở Việt Nam, Đu đủ là cây trồng khá lâu đời và chưa xác định được cụ thể thời gian cây được nhập vào Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Tuy nhiên chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa [14]

Hoa Đu đủ đực có chứa các thành phần có hoạt tính như alcaloid, flavonoid, saponin và tanin, phenolic, glycosid, triterpenoid, steroid [36], [75]

Theo Okoye và cộng sự (2017), nghiên cứu báo cáo rằng các thành phần alcaloid trong hoa Đu đủ đực có hàm lượng 0,53 ± 0,01% và các thành phần như flavonoid, saponin, tanin, terpenoid, steroid và glycosid [64]

Theo nghiên cứu của Mukhaimin và cộng sự (2019), chiết xuất hoa Đu đủ đực bằng phương pháp chiết xuất rắn-lỏng, chiết lỏng-lỏng và phương pháp chiết dưới sự hỗ trợ của vi sóng (MAE) Tổng hàm lượng alcaloid cao nhất là 0,02981 mg/g Các alcaloid bao gồm carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain, được tìm thấy trong cao chiết MeOH 80% từ hoa Đu đủ đực [60]

Hình 1.3 Một số alcaloid có hoạt tính sinh học trong hoa Đu đủ đực [60]

Theo Van và cộng sự (2020), các loại flavonoid có trong hoa Đu đủ đực là quercetin, quercitrin, quercetin 3-O-(6''-galloyl)-β-D-galactopyranosid, myricitrin, kaempferol, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosid, kaempferol 3-O-β-D- glucopyranosid và kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranosid [84]

Hình 1.4 Một số flavonoid có trong hoa Đu đủ đực [84]

1.1.3.3 Saponin Định lượng hàm lượng saponin có trong hoa Đu đủ đực bằng phương pháp đo quang phổ cho thấy: hàm lượng saponin là 230 ± 20 mg trong 100 g hoa Đu đủ đực [42]

1.1.3.4 Tanin Định lượng hàm lượng tanin có trong hoa Đu đủ đực bằng phương pháp đo quang phổ cho thấy: hàm lượng tanin là 0,46 ± 0,36 mg trong 100 g hoa Đu đủ đực [42]

Hoa Đu đủ đực chứa các hợp chất phenolic Thông qua việc sử dụng dữ liệu phổ NMR, phân tích HR-ESI-MS và so sánh tài liệu đã xác định được một hợp chất phenolic mới gọi là caricapapayol có cấu trúc như hình dưới [45]

1.1.3.6 Glycosid Định tính cho thấy trong hoa Đu đủ đực có chứa glycosid tim [74] Kết quả định lượng hàm lượng glycosid tim có trong hoa Đu đủ đực là 1,87 ± 0,02% [64]

1.1.3.7 Terpenoid Định tính cho thấy trong hoa Đu đủ đực có chứa terpenoid [74] Kết quả định lượng hàm lượng terpenoid có trong hoa Đu đủ đực là 0,21 ± 0,01% [64]

1.1.3.8 Steroid Định tính cho thấy trong hoa Đu đủ đực có chứa steroid [74] Kết quả định lượng hàm lượng steroid có trong hoa Đu đủ đực là 0,08 ± 0,01% [64]

Các vitamin như B1, B2, B3 và C được tìm thấy trong hoa Đu đủ đực Các khoáng chất như Ca, Mg, Mn, Zn, Cu, Cd, Co, Pb, Fe, K, Na cũng có trong hoa Đu đủ đực [67]

Talukdar và cộng sự (2021) đã đánh giá hàm lượng protein trong cao chiết nước từ hoa Đu đủ đực bằng phương pháp Lowry cho thấy ở 660 nm, nồng độ protein là

1.1.4 Công dụng trong dân gian

Theo những cách sử dụng trong dân gian, hoa Đu đủ đực được sử dụng để điều trị ho, vàng da và hạ sốt [85] Hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa ho, viêm phổi, mất tiếng [16]

1.1.5 Tính vị quy kinh, công năng, chủ trị [7]

Hoa Đu đủ đực có:

+ Công năng: Ích phế trừ đàm

Hoa Đu đủ đực chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có tác dụng dược lý, bao gồm khả năng chống oxy hóa, gây độc với tế bào ung thư, kháng khuẩn, hạ đường huyết, giảm đau, hạ lipid máu, diệt trừ sâu, ức chế tyrosinase và chống tia UV [67]

1.1.6.1 Tác dụng chống oxy hóa

- Cao chiết methanol 99,8% (500 μg/ml) được đánh giá bằng phương pháp Ferric Thiocyanat (FTC) với IC₅₀ là 17,47 μg/ml [42];

- Cao chiết ethanol 99,8% phân đoạn n-hexan được đánh giá bằng phương pháp DPPHvới IC₅₀ là 100,81 ± 1,180 μg / ml [75];

- Các cao chiết methanol 99,8%, cloroform, n-hexan được đánh giá bằng phương pháp DPPH Cao chiết có khả năng khử gốc tự do DPPH cao nhất là cao chiết n-hexan với khả năng khử gốc tự do DPPH là 64,07% [36];

- Cao chiết EtOH 70% từ hoa Đu đủ đực (100 ppm): được đánh giá bằng khả năng trung hòa gốc tự do ABTS + với IC₅₀ là 4,8946 ppm thu được khi hoạt động chống oxy hóa được đánh giá phương pháp xác định khả năng trung hòa gốc tự do ABTS + (acid 2,2 – azinobis – 3 ethyl benzothiazolin – 6 – sulfonic) [82]

1.1.6.2 Độc tính trên tế bào

- Trên dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng ở người (WiDr Cell):

+ Cao chiết chiết EtOH 96% phân đoạn n-hexan được đánh giá tính ức chế tế bào theo phương phỏp MTT, cho thấy cao chiết cú độc tớnh với tế bào với IC50 = 64,105 àg/ml [75]

+ Cao chiết EtOH 96% phân đoạn hexan (8, 16, 24 và 32 μg/ml) được đánh giá bằng phương pháp dòng chảy tế bào cho thấy có tác dụng chặn chu kỳ tế bào trong các pha

Phương pháp chiết xuất

1.2.1 Các phương pháp chiết xuất hoa Đu đủ đực trong các nghiên cứu trước đây

Một vài phương pháp chiết xuất hoa Đu đủ đực được sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học:

- Chưng bột hoa Đu đủ đực trong nước cất một lần ở nhiệt độ 100°C với các tỉ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10/1; 20/1; 40/1; 60/1; 80/1; 100/1 (v/w) trong các khoảng thời gian 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 giờ thu được các cao chiết nước tương ứng Sau đó, tiến hành cô quay chân không các cao chiết nước đến khối lượng không đổi thu được các cao nước với khối lượng tương ứng [15]

- Phương pháp chiết sử dụng siêu âm: Qua tối ưu hóa các thông số chiết siêu âm bằng RSM, trong điều kiện chiết xuất tối ưu bao gồm thời gian chiết xuất 33 phút, công suất siêu âm 240 W, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 27:1 ml/g và nhiệt độ chiết xuất là 46 o C, hàm lượng flavonoid thu được là 10,648 ± 0,228 mg QE/g [50]

- Phương pháp chiết kết hợp xử lý enzym: Qua tối ưu hóa, điều kiện chiết xuất được tìm thấy là ở pH 7 với 1,5 mg/ml cellulase, tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:10 (g/ml),

10 thời gian chiết là 4 giờ và ở nhiệt độ chiết là 65 o C Năng suất chiết xuất papain đã đạt tới 3,8018 μmol với 2,0910 đơn vị/ml trong mẫu dược liệu xử lý enzym [94]

1.2.2 Phương pháp bào chế cao

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các cao chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp [4]

Cao thuốc được chia làm 3 loại [4]:

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc

Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Dưới đây là sơ đồ tổng quát mô tả quy trình bào chế cao [2]:

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình bào chế cao tổng quát [2]

Một số cơ chế tác dụng chống ung thư của các nhóm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên 10 1 Tác dụng theo cơ chế ức chế hoặc cảm ứng enzym

Ung thư vú là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán ở phụ nữ [76] Các yếu tố tiên lượng bao gồm: Tuổi, kích thước u nguyên phát, tình trạng di căn hạch nách, loại mô học và độ mô học [11]

11 Mối liên hệ giữa ung thư và stress oxy hóa lần đầu được công bố bởi Warburg (1956) [88] Theo đó, khi sản xuất dư thừa, các gốc tự do làm thay đổi cấu trúc của các chất sinh học trong cơ thể con người như protein, lipid, lipoprotein và ADN Những thay đổi này dẫn đến một loạt các hoạt động tiền ung thư của tế bào như thúc đẩy chu kỳ tế bào, lão hóa, hoại tử tế bào và sự loại bỏ lẫn nhau của các tế bào [63] Từ đó, hướng nghiên cứu về sự tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào đã được chú ý đến nhiều hơn [5]

Thành phần hóa học có trong các thảo dược như flavonoid, alcaloid, terpenoid, coumarin, saponin đã được biết đến với các đặc tính chống ung thư Bằng cách gây nhiễu chu kỳ tế bào, gây chết theo chương trình, thay đổi chương trình chuyển hóa tế bào, ức chế sự kết dính, tăng sinh và di chuyển của tế bào, đồng thời ngăn chặn các con đường truyền tín hiệu quan trọng đối với sự tiến triển của ung thư, các dược liệu có thể hỗ trợ phòng ngừa và điều trị ung thư vú [44], [65], [68] Tuy nhiên, một số chất có hoạt tính sinh học như phytoestrogen (hợp chất phenol có cấu trúc tương tự như estrogen) và isoflavonoid có thể đóng vai trò là chất gây rối loạn nội tiết, thường là nguyên nhân dẫn đến ung thư vú [23]

1.3.1 Tác dụng theo cơ chế ức chế hoặc cảm ứng enzym

Cơ chế quan trọng mà flavonoid có thể phát huy tác dụng là thông qua sự ức chế các enzym chuyển hóa giai đoạn I Các enzym này chuyển hóa các chất gây ung thư thành chất trung gian phản ứng có thể tương tác với các nucleophil tế bào và dẫn đến ung thư Flavonoid ức chế hoạt động của một số isoenzym P450 như CYP1A1 và CYP1A2 [48], [49]

Một cơ chế khác là cảm ứng các enzym chuyển hóa giai đoạn II như glutathione- S-transferase, quinon reductase và UDP-glucuronyl transferase [26], [77], theo đó các chất gây ung thư được thải trừ, dễ dàng bị loại bỏ khỏi cơ thể

Aromatase – enzym tổng hợp estrogen từ androgen Ức chế aromatase là một cách tiếp cận quan trọng để giảm tác dụng của estrogen trong ung thư vú phụ thuộc hormone Do đó, flavonoid có thể được coi là tác nhân tiềm năng chống lại ung thư vú thông qua việc ức chế mạnh aromatase [31], [87]

1.3.2 Tác dụng theo cơ chế ức chế tăng sinh tế bào ung thư

Phòng ngừa ung thư thường liên quan đến ức chế, đảo ngược hoặc chậm tăng sinh tế bào Hầu hết các flavonoid ức chế sự tăng sinh trong nhiều loại dòng tế bào ung thư ở người, nhưng ít/không có độc hại đối với các tế bào bình thường [47], [66], [89]

Flavonoid đặc biệt hiệu quả trong việc ức chế xanthin oxidase [29], COX hoặc LOX [61] do đó ức chế sự tăng sinh khối u

12 Ornithin decarboxylase là một enzym tăng tốc độ trong sinh tổng hợp polyamin, tốc độ tổng hợp ADN và tăng sinh tế bào ở một số mô Một số thí nghiệm cho thấy flavonoid có thể ức chế ornithin decarboxylase gây ra bởi các chất kích thích khối u, và do đó gây ra sự giảm polyamin sau đó và ức chế tổng hợp ADN/protein [56] cũng có hiệu quả trong việc ức chế các enzym truyền tín hiệu, ví dụ, protein tyrosin kinase (PTK) [37], protein kinase C (PKC) [53] và phosphoinositid 3-kinase (PIP3) [71]

Ngoài ra, các saponin có thể nhận ra các tế bào ung thư, bởi vì các tế bào ung thư có màng tế bào và cấu trúc khác với các tế bào bình thường Màng tế bào ung thư chứa nhiều hợp chất hơn như cholesterol Saponin có thể liên kết cholesterol có trong màng tế bào ung thư, do đó phá vỡ tính thấm của màng[68]

1.3.3 Tác dụng theo cơ chế gây nhiễu chu kỳ tế bào

Tín hiệu phân bào đảm bảo các tế bào lần lượt bước vào chu kỳ tế bào Tổng hợp ADN (pha S) và tách hai tế bào con (pha M) là những đặc điểm chính của sự tiến triển chu kỳ tế bào Thời gian giữa các pha S và M được gọi là pha G2 Giai đoạn này rất quan trọng để cho phép các tế bào sửa chữa các lỗi xảy ra trong quá trình sao chép ADN, ngăn chặn sự lan truyền của các lỗi này sang các tế bào con Ngược lại, pha G1 đại diện cho giai đoạn cam kết tiến triển chu kỳ tế bào tách các pha M và S khi các tế bào chuẩn bị sao chép ADN dựa trên tín hiệu phân bào Do đó, các chất ức chế hoặc điều biến sẽ được quan tâm để khám phá như các tác nhân điều trị mới trong bệnh ung thư [72], [73] Các điểm kiểm tra ở cả G1/S và G2/M của chu kỳ tế bào trong các dòng tế bào ung thư nuôi cấy đã được tìm thấy bị nhiễu loạn bởi các flavonoid như silymarin, genistein, quercetin, daidzein, luteolin, kaempferol, apigenin và epigallocatechin 3-gallat [27], [30], [92]

1.3.4 Tác dụng theo cơ chế cảm ứng gây chết tế bào theo chương trình

Flavonoid đã được chứng minh là gây ra apoptosis ở một số dòng tế bào ung thư, không gây độc trên các tế bào bình thường Một số cơ chế có thể liên quan, bao gồm ức chế hoạt động của ADN topoisomerase I / II [22], [59], giảm các loại oxy phản ứng (ROS) [51], điều hòa biểu hiện protein sốc nhiệt [70]

1.3.5 Tác dụng theo cơ chế chống oxy hóa

Flavonoid có thể chống lại ung thư thông qua việc hạn chế các phản ứng oxy hóa gây hại trong tế bào, có thể dẫn đến sự phát triển của ung thư Flavonoid với các nhóm hydroxyl hoạt động như chất chống oxy hóa trong nuôi cấy tế bào in vitro; khử anion superoxid, gốc peroxy lipid hoặc ổn định các gốc tự do thông qua quá trình hydro hóa [35]

1.3.6 Tác dụng theo cơ chế ngăn ngừa quá trình tạo mạch

13 Các chất ức chế sự hình thành mạch như flavonoid, có thể can thiệp vào các bước khác nhau của quá trình tạo mạch, như phá hủy các mạch máu, tăng sinh và di chuyển các tế bào nội mô, hoặc sự hình thành lumen Do đó, các hợp chất này có thể có tiềm năng điều trị các khối u rắn [83]

Saponin cũng làm giảm sự xuất hiện của các loại oxy phản ứng như H2O2 và ức chế các con đường tín hiệu phosphatidyl inositol-3 kinase, ngừa tổn thương nhiễm sắc thể [65]

1.3.7 Tác dụng theo cơ chế qua kênh PgP Đa kháng thuốc do P-glycoprotein (PgP) hoặc protein liên quan đến đa kháng thuốc (MRP) là một trở ngại nghiêm trọng đối với hóa trị ung thư Nhiều nỗ lực đã được dành ra để điều chỉnh tình trạng đa kháng thuốc ở các loài khác nhau bằng cách sử dụng các chất ức chế cụ thể, nhưng nói chung ít thành công Một số flavonoid có hoạt tính ức chế mạnh chống lại chức năng kháng thuốc của PgP Cơ chế bởi flavonoid của đa kháng thuốc tế bào qua kênh PgP có thể thông qua:

(i) Ức chế sự biểu hiện quá mức của gen đa kháng thuốc-1 (MDR1) [46] (ii) Liên kết trực tiếp với miền liên kết nucleotid có ái lực cao [46]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là hoa của cây Đu đủ đực được thu hái vào tháng 6/2023 tại huyện An Dương, Hải Phòng Mẫu cây đã được lưu mẫu tại Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện dược liệu

Hình 2.1 Một số hình ảnh hoa Đu đủ đực

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

1 Dung môi ethanol (EtOH) Việt Nam

2 Dung môi n-hexan Trung Quốc

3 Dung môi ethyl acetat (EtOAc) Trung Quốc

4 Dung môi dicloromethan (DCM) Trung Quốc

5 Dimethyl sulfoxid (DMSO) Trung Quốc

6 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco, Hoa Kỳ

7 Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Hoa Kỳ

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

8 Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) Gibco, Hoa Kỳ

10 Phosphate-Buffered Salin (PBS) Thermo Fisher,

Diphenyltetrazolium Bromid) (MTT) Invitrogen, Hoa Kỳ

12 Trypan blue Gibco, Hoa Kỳ

14 Hóa chất định tính Bộ môn Dược liệu

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ, thiết bị trong nghiên cứu

STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất

1 Dụng cụ thường quy phòng thí nghiệm Trung Quốc

2 Máy đo độ ẩm Ohaus, Hoa Kỳ

3 Cân phân tích Precisa Thụy Sỹ

4 Cân kỹ thuật Sartorius Sartorius, Đức

6 Tủ cấy vô trùng Telstar, Tây Ban Nha

7 Tủ ấm CO2 Incusafe, Nhật Bản

8 Máy ly tâm Beckman Coulter, Hoa Kỳ

9 Kính hiển vi Zeiss, Đức

10 Máy SpectraMax iD3 Molecular Devices, Hoa Kỳ

STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất

11 Bình nitơ lỏng Trung Quốc

15 Bể ổn nhiệt Shel Lab, Hoa Kỳ

16 Đĩa 96 giếng SPL, Hàn Quốc

17 Đĩa nuôi cấy tế bào 100mm Becton Dickinson, Pháp

18 Pipet đơn kênh, đa kênh Eppendorf, Đức

19 Pipet tips Corning, Hoa Kỳ

20 Ống tube 1.5ml Corning, Hoa Kỳ

21 Ống falcon 15ml, 50ml Corning, Hoa Kỳ

22 Lam kính Sail Brand, Trung Quốc

23 Máy cất nước hai lần Aquatron, Thụy Điển

24 Máy siêu âm Hwashin Technology, Hàn

25 Nồi hấp tiệt trùng Sturdy, Hoa Kỳ

27 Buồng đếm tế bào Marienfeld, Đức

Dòng tế bào ung thư vú biểu hiện thụ thể estrogen MCF-7 được cung cấp bởi GS Suresh Awale, Đại học Toyama (Nhật Bản) được hoạt hóa và lưu giữ tại Viện Dược liệu.

Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Xây dựng quy trình chiết xuất cao và tiến hành chiết cao phân đoạn từ hoa của cây Đu đủ đực

- Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế tế bào MCF-7 của các phân đoạn cao chiết hoa Đu đủ đực, từ đó định tính các phân đoạn cao chiết có tác dụng

Thiết kế nghiên cứu của khóa luận được tóm tắt ở sơ đồ sau:

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

Trong khóa luận này, hoa Đu đủ được phơi khô trong bóng râm hoặc sấy ở nhiệt độ không quá 60 o C để đạt độ ẩm dưới 12%, sau đó được xay thô, rây qua rây có kích thước lỗ sàng 5 mm, bảo quản trong túi zip nilon kín để tránh ẩm và ánh sáng

Mỗi mẻ chiết được tiến hành với 10,0 g dược liệu Sau khi lọc, gộp dịch chiết của

2 lần chiết và thu hồi dung môi ở áp suất giảm Dung môi sau khi được thu hồi sẽ cho cao đặc, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60 o C đến khi thu được cao khô có hàm ẩm không quá 5%

2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực

- Xử lý nguyên liệu: Hoa Đu đủ đực được tách riêng khỏi các phần dược liệu khác, sấy ở nhiệt độ 60 o C trong tủ sấy thông gió Trong quá trình sấy, đảo nguyên liệu, kiểm tra độ ẩm của nguyên liệu mỗi 1 giờ 1 lần cho đến khi độ ẩm nguyên liệu < 12%

Nguyên liệu được xay thô, rây qua rây có kích thước lỗ sàng 5 mm, bảo quản trong túi zip nilon kín để tránh ẩm và ánh sáng

- Tiến hành chiết cao toàn phần:

Cân khoảng 10,0 g dược liệu hoa Đu đủ đực Tiến hành song song 2 mẻ với cùng phương pháp chiết Tiến hành chiết 2 lần với dung môi EtOH 80%; tỷ lệ dung môi/dược

18 liệu của lần 1 là 7 ml/g; lần 2 là 5 ml/g Tiếp tục tiến hành chiết theo các phương pháp khác nhau như sau:

+ Phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng: Ngâm dược liệu trong cốc có mỏ 500ml, 3 ngày tại nhiệt độ phòng, khuấy trộn 1 lần/ngày Lọc, gộp dịch của 2 lần chiết và thu hồi dung môi tại áp suất giảm, thu được cao toàn phần, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60 o C cho đến khi thu được cao khô có hàm ẩm ≤ 5%

+ Phương pháp chiết siêu âm: Dược liệu đã ngâm được siêu âm 30 phút tại nhiệt độ của bể siêu âm (37 o C) Lọc, gộp dịch của 2 lần chiết và thu hồi dung môi tại áp suất giảm, thu được cao toàn phần, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60 o C cho đến khi thu được cao khô có hàm ẩm ≤ 5%

+ Phương pháp chiết hồi lưu: Dược liệu sau khi ngâm được chiết hồi lưu tại nhiệt độ

80 o C (nhiệt độ sôi của dung môi) trong 1,5 giờ (kể từ lúc sôi) Lọc, gộp dịch của 2 lần chiết và thu hồi dung môi tại áp suất giảm, thu được cao toàn phần, được chuyển ra khay để sấy chân không ở 60 o C cho đến khi thu được cao khô có hàm ẩm ≤ 5% Đánh giá các phương pháp chiết xuất dựa trên thông số là hệ suất chiết cao:

H(%) = m cao × (100 − a cao ) m dl × (100 − a dl) × 100 Trong đó: mcao : khối lượng cao chiết được (g) mdl: khối lượng dược liệu đem chiết (g) acao: độ ẩm của cao (%) adl: độ ẩm của dược liệu (%)

2.3.1.2 Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong mẫu cao thu được Định tính các nhóm chất chính bằng phản ứng hóa học thường quy của các cao phân đoạn theo theo sách giáo trình Thực tập Dược liệu [3]

- Tiếp tục tiến hành phương pháp chiết xuất có hiệu suất chiết cao toàn phần cao nhất, thành phần gồm các nhóm chất có tác dụng trên tế bào ung thư với lượng dược liệu là 100 g với các điều kiện chiết tương tự, từ đó chiết xuất cao cao phân đoạn

2.3.1.3 Phương pháp chiết phân đoạn

Dựa vào tính chất dung môi ít phân cực dễ dàng hòa tan các chất không phân cực, khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và ngược lại, dung môi phân cực mạnh

19 thì dễ dàng hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực, tiến hành chiết cao phân đoạn như sau:

Cao thu được sau khi chiết bằng phương pháp có hiệu suất chiết cao tốt nhất với EtOH 80% được chiết phân bố lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, dicloromethan, ethylacetat Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn n-hexan, dicloromethan, ethylacetat

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7

Tế bào MCF-7 được nuôi cấy trong đĩa petri 100 mm chứa môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh penicillin/streptomycin Các tế bào được phát triển ở 37°C trong môi trường được làm ẩm 95% không khí/5% CO2 cho đến khi phát triển tới mức phủ 70% bề mặt đĩa nuôi (3 – 4 ngày), tiến hành cấy chuyển sang đĩa nuôi cấy mới Cấy chuyển 3 lần để tế bào phát triển ổn định, lúc đó tế bào đã sẵn sàng để thực hiện thí nghiệm

2.3.2.2 Đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư MCF-7

Pha dung dịch gốc cao chiết toàn phần và các phân đoạn cao chiết hoa Đu đủ đực nồng độ 50 mg/ml trong DMSO: Cân chính xác khoảng 5 mg cao chiết, hòa tan trong dung dịch DMSO vừa đủ 100 àl Từ nồng độ gốc này sẽ pha thành cỏc nồng độ khỏc nhau: 12,5; 25; 50; 100 và 200 àg/ml (pha trong mụi trường DMEM) để đỏnh giỏ độc tính trên tế bào MCF-7

Tách tế bào MCF-7 ra khỏi đĩa petri bằng 1 ml trypsin - EDTA 0,25%, ủ trong tủ ấm 3 phút Sau đó tế bào được đem ly tâm 1500 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi trypsin - EDTA Bổ sung lại 1 ml môi trường DMEM đầy đủ Pha loãng hỗn dịch bằng

4 ml môi trường, tiến hành đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm tế bào Neubauer

Xử lý số liệu

Tất cả các kết quả thí nghiệm được tổng hợp bằng phần mềm Microsoft Excel và được phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0 và GraphPad Prism 8

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

3.1.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết xuất cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực

- Phương pháp chiết ngâm cho hiệu suất chiết cao đạt 12,04% ở quy mô khảo sát là 10g, với khoảng thời gian chiết là 3 ngày (không kể thời gian lọc mẫu)

- Phương pháp chiết siêu âm cho hiệu suất chiết cao đạt 14,31% ở quy mô khảo sát là 10g, với khoảng thời gian chiết là 30 phút (không kể thời gian lọc mẫu)

- Phương pháp chiết hồi lưu cho hiệu suất chiết cao đạt 16,47% ở quy mô khảo sát là 10g, với khoảng thời gian chiết là 1,5 giờ (không kể thời gian lọc mẫu)

Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết cao EtOH 80% theo phương pháp chiết:

Hình 3.1 Hiệu suất chiết cao toàn phần theo phương pháp chiết

Phương pháp chiết Khối lượng dược liệu (g) Cao chiết (g) Hiệu suất (%)

Chiết ngâm 10,13 ± 0,03 1,22 ± 0,01 12,04 ± 0,03 Chiết siêu âm 10,43 ± 0,02 1,49 ± 0,03 14,31 ± 0,12 Chiết hồi lưu 10,57 ± 0,02 1,74 ± 0,05 16,47 ± 0,28

23 Với các phương pháp chiết khác nhau nhưng sử dụng chung một loại dung môi là EtOH 80% và các tỷ lệ dung môi/dược liệu cho các lần chiết là giống nhau đã cho thấy các kết quả khác nhau về hiệu suất chiết với p = 0,001 (q < 0,05) (sử dụng phần mềm SPSS 16.0)

- Chiết với phương pháp hồi lưu cho hiệu suất cao nhất 16,47% với thời gian là 1,5 giờ

- Chiết với siêu âm cho hiệu suất thấp hơn 14,31% và sử dụng thời gian là ít nhất (30 phút)

- Phương pháp chiết ngâm có lợi thế không cần trang thiết bị máy móc hay sử dụng năng lượng, tuy nhiên cần thời gian chiết dài (3 ngày) và hiệu suất thấp nhất 12,04%

- Kết quả định tính các nhóm chất có trong các mẫu cao

Kết quả định tính các mẫu cao chiết thu được theo phương pháp được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm hợp chất bằng phản ứng hóa học trong cao chiết bằng phương pháp ngâm, siêu âm, hồi lưu

Nhóm Các phản ứng Cao chiết

Cao chiết PP hồi lưu

Glycosid tim Phản ứng Baljiet - - -

Phản ứng với dung dịch kiềm + + +

Phản ứng với hơi amoniac + - +

Saponin Khả năng tạo bọt + - -

24 Cao chiết thu được bằng phương pháp ngâm xuất hiện nhóm hợp chất flavonoid và saponin; cao chiết thu được bằng phương pháp siêu âm xuất hiện nhóm hợp chất alcaloid; cao chiết thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu xuất hiện nhóm hợp chất flavonoid, alcaloid

Dựa vào những kết quả trên, lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu do có hiệu suất lớn hơn, có nhiều hợp chất có tác dụng sinh học hơn phương pháp chiết siêu âm; lợi thế hơn chiết ngâm về thời gian và cả hiệu suất

Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực

Hoa Đu đủ đực được xay thô, rây lựa chọn dược liệu kích thước ≤ 5 mm Chiết nguyên liệu bằng phương pháp chiết hồi lưu 2 lần với dung môi EtOH 80%; tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 7 ml/g; 5 ml/g trong 1,5 giờ kể từ lúc sôi Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc, cô thu hồi dung môi áp suất giảm, chuyển ra khay sấy chân không ở 60 o C để thu được cao khô

- Đánh giá độ ổn định của quy trình:

Tiến hành lặp lại quy trình với 3 mẻ, thu được cao chiết với hiệu suất theo bảng 3.3:

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình chiết xuất cao từ hoa Đu đủ đực quy mô 100g

25 Kết quả hiệu suất cao cho thấy hiệu suất chiết cao ổn định khi áp dụng với quy mô 100g dược liệu hoa Đu đủ đực Phần cao chiết toàn phần thu được tiếp tục được sử dụng để chiết phân đoạn và đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7

Tiến hành chiết phân đoạn

Phân tán 25g cao chiết toàn phần EtOH 80% (thu được sau khi chiết cao ở quy mô 100g với 3 mẻ chiết) trong 25 ml nước nóng (tỷ lệ 1:1 mg/ml) Dịch thu được đem chiết phân bố lỏng lỏng theo tỷ lệ 1:2 với các dung môi có độ phân cực tăng dần n- hexan, dicloromethan, ethylacetat Mỗi dung môi chiết 3 lần, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ không quá 60 o C đến khi độ ẩm dưới 5%

Ngoài quá trình chiết phân đoạn, tiến hành chiết cao từ hoa Đu đủ đực theo phương pháp ngâm tại nhiệt độ phòng với 2 dung môi EtOH 50%, EtOH 96%; tỷ lệ dung môi/dược liệu 2 lần chiết là 7 ml/g, 5 ml/g; thời gian chiết là 3 ngày/lần; lọc và thu hồi dung môi áp suất giảm, sấy chân không tại 60 o C thu được cao khô để đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7

Sơ đồ quy trình chiết các phân đoạn trong hình 3.3:

TT Dược liệu (g) Cao chiết (g) Hiệu suất (%)

Hình 3.3 Sơ đồ chiết các cao phân đoạn hoa Đu đủ đực

Khối lượng và hiệu suất chiết cao tương ứng thu được qua quá trình tiến hành được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.4 Khối lượng và hiệu suất chiết cao phân đoạn hoa Đu đủ đực

Loại cao Khối lượng (g) Hiệu suất (%)

Đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn

Tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của các cao chiết được thể hiện theo bảng 3.5:

Các mẫu cao chiết được đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7: + M1: Cao chiết toàn phần EtOH 80% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu

+ M2: Cao chiết toàn phần EtOH 50% thu được bằng phương pháp chiết ngâm

+ M3: Cao chiết toàn phần EtOH 96% thu được bằng phương pháp chiết ngâm

27 + M4: Cao chiết phân đoạn n-hexan của cao toàn phần EtOH 80% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu

+ M5: Cao chiết phân đoạn dicloromethan của cao toàn phần EtOH 80% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu

+ M6: Cao chiết phân đoạn etylacetat của cao toàn phần EtOH 80% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các cao chiết hoa Đu đủ đực đối với khả năng sống sót của tế bào MCF-7 thể hiện qua % tế bào sống sót

Kết quả IC50 được trình bày dưới bảng 3.5 như sau:

Bảng 3.6 Kết quả IC 50 của các cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn với chứng dương được sử dụng là tamoxifen

Mẫu nghiên cứu IC 50 (μg/ml)

+ Cao chiết EtOH 80% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu (M1) cho IC50 = 191,8 àg/ml với r 2 = 0,9081

28 + Cao chiết EtOH 96% thu được bằng phương pháp chiết ngâm (M2) cho IC50 = 376,1 àg/ml với r 2 = 0,7296

+ Cao chiết EtOH 50% thu được bằng phương pháp chiết ngâm (M3) cho IC50 = 2732 àg/ml với r 2 = 0,4869

Qua kết quả trên cho thấy, IC50 cao EtOH 96% chiết hồi lưu < IC50 cao EtOH 96% chiết ngâm < IC50 cao EtOH 50% chiết ngâm Từ đó tiếp tục tiến hành đánh giá tác dụng độc tính trên 3 cao phân đoạn (M4, M5, M6) của cao chiết toàn phần thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu

+ Cao chiết phân đoạn n-hexan (M4) từ hoa Đu đủ đực gây ức chế 50% tế bào với

+ Cao chiết phân đoạn dicloromethan (M5) từ hoa Đu đủ đực gây ức chế 50% tế bào với

+ Cao chiết phân đoạn etylacetat (M6) từ hoa Đu đủ đực gây ức chế 50% tế bào với IC50

Qua kết quả trên cho thấy: IC50 phân đoạn dicloromethan < IC50 phân đoạn n-hexan < IC50 phân đoạn etylacetat, dự đoán các hợp chất có tác dụng độc tính lên tế bào ung thư vú MCF-7 tan nhiều hơn trong dung môi dicloromethan

BÀN LUẬN

Về mô hình nghiên cứu

4.1.1 Về đối tượng nghiên cứu

Các bộ phận của cây Đu đủ đều có thể sử dụng để làm thức ăn hoặc làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian [39], tuy nhiên lá là bộ phận được nghiên cứu chiết xuất và các hoạt tính sinh học nhiều nhất [28], [40], [57] Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về chiết xuất và đánh giá hoạt tính sinh học từ lá của cây Đu đủ, tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về hoa Đu đủ và đặc biệt là hoa Đu đủ đực [67] Trong một số nghiên cứu, cho thấy hoa Đu đủ đực có tác dụng chống oxy hóa [75], gây độc trên các dòng tế bào [50], kháng khuẩn [36],… Ở Việt Nam, hoa Đu đủ đực rất phổ biến, dễ trồng, dễ phát triển, thu hái nhanh

Vì vậy, lựa chọn dược liệu hoa Đu đủ đực là đối tượng nghiên cứu

4.1.2 Về dòng tế bào lựa chọn để đánh giá tác dụng gây độc tính

Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 từ lâu đã được xem là một đối tượng nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực ung thư vú, nhờ vào khả năng nuôi cấy dễ dàng và tốc độ phân chia nhanh chóng, cho phép thực hiện nhiều thí nghiệm trong thời gian ngắn [62] Điều này làm cho MCF-7 trở thành một mô hình lý tưởng để nghiên cứu các cơ chế sinh học của ung thư

Dựa trên các tài liệu tham khảo về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hoa đu đủ đực, chúng tôi đã nhận thấy tiềm năng đáng kể của loại cây này trong việc hỗ trợ điều trị ung thư [62] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất trong hoa đu đủ đực, đặc biệt là flavonoid, có khả năng gây độc đối với tế bào ung thư [69] Các kinh nghiệm dân gian cho thấy việc sử dụng hoa đu đủ đực có thể có tác dụng tích cực trong việc làm giảm các triệu chứng ung thư và cải thiện sức khỏe tổng quát [85]

Xét về khía cạnh đạo đức, việc sử dụng dòng tế bào ung thư vú MCF-7 trong nghiên cứu giúp hạn chế các vấn đề đạo đức liên quan đến việc sử dụng động vật trong các thí nghiệm y sinh học

Xét về khía cạnh kinh phí, dòng tế bào ung thư vú MCF-7 dễ dàng nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm

Dựa vào dòng tế bào hiện sẵn có tại phòng thí nghiệm và tất cả những lý do trên, chúng tôi đã quyết định lựa chọn mô hình dòng tế bào ung thư vú MCF-7 để đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các hoạt chất chiết xuất từ hoa đu đủ đực

4.1.3 Về lựa chọn các yếu tố trong quy trình chiết xuất cao toàn phần

- Lựa chọn dung môi ethanol 80%/ H 2 O 20%

30 Thông thường khi chiết xuất với các dược liệu là bộ phận trên mặt đất và để thu được đại diện đa số các nhóm chất, hệ dung môi rất thông dụng là MeOH; MeOH 80% trong nước; hoặc hệ dung môi EtOH-H2O (hệ ethanol-nước) Với MeOH và các hệ dung môi liên quan MeOH thường cho hiệu suất chiết tốt hơn khi so với EtOH tương ứng, tuy nhiên chúng các là dung môi có độc tính đến mắt

Ngoài ra, khóa luận đã lựa chọn dung môi ethanol 80% dựa trên các kết quả nghiên cứu trên thế giới như nhóm nghiên cứu của Amjad và cộng sự (2013) đã sử dụng dung môi ethanol 80% để chiết xuất các hợp chất flavonoid và phenolic từ hoa của loài

Punica granatum (L.) [19] Nhóm nghiên cứu của Naveed Ahmad và cộng sự (2011), khi sử dụng dung môi chiết xuất là EtOH 80% cho thấy tổng hàm lượng phenolic, flavonoid thu được ở trong hoa của loài Calotropis procera (Ait.) tốt hơn so với các dung môi MeOH 80%, aceton 80% [18]

Do vậy, với những lý do trên, trong điều kiện nghiên cứu thăm dò tác dụng và khảo sát, với điều kiện thực tại, lựa chọn dung môi EtOH 80% cho việc chiết cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực

- Lựa chọn xay thô dược liệu tới kích cỡ < 5 mm

Với thực vật còn non, mỏng, mềm như cỏ cây, hoa lá, dung môi dễ thấm vào dược liệu Nhưng nếu để dược liệu ở kích thước quá thô thì khó thấm dung môi, diện tích tiếp xúc giữa dung môi với dược liệu không cao, ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết được; nếu dược liệu được phân chia đến mức kích thước quá nhỏ, sẽ ảnh hưởng đến quá trình lọc, dễ gây bít tắc, dịch chiết thu được bị lẫn nhiều tạp

Việc lựa chọn kích thước dược liệu vừa để đảm bảo dung môi chiết thâm nhập được tối đa vào tế bào dược liệu, các mẻ dược liệu có độ đồng đều lớn, vừa đảm bảo không gây khó khăn cho quá trình rút lấy dịch chiết là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến xây dựng quy trình Do đó, lựa chọn xay thô dược liệu tới kích cỡ < 5 mm để chiết xuất cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực

- Lựa chọn các phương pháp chiết xuất

Sau khi tham khảo phương pháp chiết siêu âm hoa Đu đủ đực của Phan Lê Thảo

My và cộng sự (2020) cho hàm lượng flavonoid thu được là 10,648 ± 0,228 mg QE/g [50] cùng các phương pháp thường dùng trong chiết xuất dược liệu đã được áp dụng [8]; với các điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, lựa chọn 3 phương pháp chiết ngâm, chiết siêu âm, chiết hồi lưu để đánh giá hiệu suất chiết cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực, từ đó lựa chọn ra phương pháp chiết xuất có hiệu suất tốt nhất

- Lựa chọn số lần chiết

31 Dựa trên các nghiên cứu chiết xuất cho thấy, khi tăng số lần chiết, hiệu suất chiết cao có thể tăng lên, lượng hợp chất chiết được nhiều hơn tuy nhiên không đáng kể, và tăng số lần chiết có thể gây lãng phí dung môi, chi phí tăng, tăng thời gian cô và thu hồi dung môi [13] Tham khảo trên các nghiên cứu về chiết xuất dược liệu để đánh giá tác dụng sinh học, số lần chiết đa số được sử dụng là 2 lần [10], [12]

Với dược liệu có màng tế bào mỏng như hoa Đu đủ đực, sau khi cân nhắc giữa hiệu suất và chi phí, chỉ tiến hành chiết xuất cao toàn phần 2 lần từ hoa Đu đủ đực

- Lựa chọn tỷ lệ dung môi/dược liệu

Thông thường khi lựa chọn tỷ lệ dung môi trên dược liệu ở mức 4 ml/g cho thấy đủ ngập hoàn toàn dược liệu trong quá trình chiết, tuy nhiên dịch thu được sánh, đặc, gây khó lọc và rút dịch chiết Khi chiết với tỷ lệ dung môi/dược liệu ≥ 10 ml/g thì lượng dịch chiết nhiều, thời gian chiết và cô kéo dài gây tăng chi phí Tham khảo tỷ lệ dung môi/dược liệu thường quy được sử dụng [10], [24], [90], với dược liệu đã được xay thô, kích thước nhỏ hơn 5 mm, lựa chọn tỷ lệ dung môi dược liệu là 7ml/g cho lần chiết đầu và 5 ml/g cho lần chiết 2 để tiết kiệm dung môi.

Về kết quả nghiên cứu

4.2.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

Cao chiết toàn phần từ hoa Đu đủ đực thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu với hiệu suất 16,47% Qua tham khảo, hiệu suất chiết cao toàn phần từ hoa Đu đủ đực thu được trong nghiên cứu của Rachman và cộng sự (2023) là 9,99% với dung môi EtOH 96% bằng phương pháp ngâm [34], của Yuliastuti và cộng sự (2021) là 17,65% với dung môi EtOH 70% bằng phương pháp ngâm [91]

Dựa trên kết quả định tính cũng cho thấy, trong cao chiết bằng phương pháp hồi lưu thu có những hợp chất có tác dụng sinh học trên tế bào ung thư vú MCF-7 Điều này cho thấy phương pháp chiết được lựa chọn là phù hợp để thực hiện chiết hoa Đu đủ đực phục vụ cho việc đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư

Lựa chọn chiết cao phân đoạn với các dung môi có độ phân cực giảm dần: n- hexan, dicloromethan, etylacetat nhằm mục đích đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào MCF-7 của từng phân đoạn, qua đó xác định được các phân đoạn có tác dụng tốt, đề xuất tiến hành chiết các hợp chất có hoạt tính gây độc trên tế bào MCF-7

4.2.2 Kết quả đánh giá đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 của cao toàn phần và các cao phân đoạn

Kết quả đánh giá tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 cho thấy cao chiết toàn phần EtOH 80% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu (M1) cho tác dụng

32 ức chế cao hơn so với cao chiết EtOH 96% (M2), cao chiết EtOH (M3) thu được bằng phương pháp ngâm lạnh dựa trên nồng độ ức chế 50% lượng tế bào Qua đó cho thấy, các hợp chất có tác dụng gây độc trên tế bào MCF-7 xuất hiện nhiều hơn trong cao chiết toàn phần EtOH 80% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu

Từ cao chiết hồi lưu, tiến hành chiết phân đoạn được các cao phân đoạn M4, M5,

M6 Với nồng độ ức chế 50% lượng tế bào là ớt nhất (46,04 àg/ml) cho thấy cao chiết phân đoạn dicloromethan (M5) có tác dụng gây độc trên tế bào MCF-7 mạnh hơn cao chiết phân đoạn n-hexan (M4), phân đoạn etylacetat (M6) Điều đó cho thấy rằng, các hợp chất có tác dụng gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7 tan nhiều hơn trong dung môi dicloromethan (dung môi phân cực vừa)

Các cao chiết có giá trị IC50