Đặc biệt, tamoxifen là SERM được lựa chọn hàng đầu trong điều trị UTV thể ER+, tamoxifen cho thấy lợi ích rõ ràng trong việc giảm tỷ lệ tử vong và nguy cơ tái phát do ung thư vú, nhưng t
Tổng quan về ung thư vú
Dịch tễ học ung thư vú
Ung thư vú (UTV) là một trong những căn bệnh ung thư phổ biến nhất, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu của phụ nữ
Theo thống kê của Trung tâm nghiên cứu quốc tế về ung thư (IARC) thuộc Tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2022, UTV có tỷ lệ mắc mới lớn thứ 2 trên thế giới sau ung thư phổi với 2,3 triệu ca mắc mới ở cả hai giới chiếm 11,5% tổng số ca ung thư Ở phụ nữ, UTV đứng đầu về tỉ lệ mắc mới (20,8%) và tỉ lệ tử vong (15,4%) do ung thư
Tỷ lệ mắc căn bệnh này có sự khác nhau rõ rệt giữa các nước, và các khu vực Các nước ở khu vực phát triển có tỉ lệ mắc cao hơn rất nhiều so với các nước đang phát triển Tỷ lệ mắc cao nhất ở khu vực Úc, New Zealand, Bắc Mỹ và Tây Âu với khoảng 100 người mắc trên 100.000 dân Châu Á và châu phi là hai khu vực có tỷ lệ mắc thấp nhất (30/100.000 dân) Tuy nhiên tỷ lệ tử vong lại ngược lại, tỷ lệ tử vong của các nước đang phát triển (17%) là cao hơn các nước phát triển (13%) [46] Ở Việt Nam, UTV là bệnh ung thư có tỉ lệ mắc cao nhất, chiếm 13,6% tổng số ca ung thư ở cả hai giới; 28,9% tổng số ca ung thư ở nữ giới và có tỷ lệ tử vong hàng đầu ở phụ nữ (20,2%); tức là cứ 7 người phụ nữ được chẩn đoán ung thư thì có đến 2 người là UTV và cứ có 5 người phụ nữ UTV thì có 1 người tử vong Trong năm 2018, ước tính tại Việt Nam có 15.222 ca mới mắc, đến năm 2022, con số này đã lên tới 24.563 ca mắc mới với 100% là nữ và 10.008 ca tử vong; chứng tỏ xu hướng đang tăng rất nhanh của các bệnh nhân UTV [46] Theo báo cáo của Nguyễn Thị Lan Mai trong luận án của mình, nhận xét về nhóm tuổi mắc UTV thì phân bố ở nhóm tuổi từ 50-59 là cao nhất (30,1%), tiếp theo là nhóm 40-49 tuổi (24,8%), nhóm 60-69 tuổi (21,8%), và nhóm bệnh nhân tuổi 20- 30 và ≥ 80 tuổi chiếm tỉ lệ thấp nhất (1,7%) Đa số UTV xuất phát từ tế bào biểu mô tuyến vú, ung thư biểu mô thể ống xâm nhập là chủ yếu chiếm 84,1% ,còn các thể mô bệnh học khác ít gặp chiếm 4,3%[3] Trong đó thể bệnh chính là UTV dương tính với thụ thể estrogen (ER) [26].
Điều trị ung thư vú
1.1.2.1 Các phương pháp điều trị Điều trị UTV là điều trị đa mô thức, tức là điều trị phối hợp đa phương pháp, đây là lựa chọn thích hợp đối với hầu hết các bệnh nhân UTV [1]
Các phương pháp điều trị bao gồm:
- Điều trị đặc hiệu đích
Các phương pháp điều trị khác nhau được lựa chọn cho từng trường hợp bệnh nhân khác nhau, đặc biệt là phụ thuộc đặc điểm bệnh học khối u như thể mô bệnh học, độ mô học, tình trạng thụ thể nội tiết
Trong những bệnh nhân ung thư vú, có khoảng 60 - 70% bệnh nhân có thụ thể nội tiết estrogen (ER) dương tính, trong đó có 65% thụ thể progesterone (PR) dương tính[26] Những bệnh nhân có thụ thể nội tiết ER dương tính được điều trị liệu pháp nội tiết có tỷ lệ sống sót cao hơn so với những bệnh nhân có thụ thể nội tiết ER âm tính Vì vậy, liệu pháp nội tiết tác động vào hoạt động ER đã trở thành nền tảng trong điều trị ung thư vú trong hơn một thế kỷ qua [4] Điều trị nội tiết bằng 2 phương pháp:
• Ngăn chặn việc sản xuất estrogen:
- Ức chế buồng trứng: Buồng trứng là nơi sản xuất estrogen chủ yếu ở phụ nữ chưa mãn kinh, estrogen có tác dụng lên các tế bào biểu mô vú, ảnh hưởng đến các tế bào UTV, nên khi ức chế chức năng của buồng trứng sẽ ngăn chặn sự phát triển của các khối u vú Các biện pháp: o Phẫu thuật hoặc xạ trị cắt buồng chứng o Thuốc đồng vận GnRH (gonadotropin- releaseing hormone)
- Thuốc ức chế aromatase (enzym chuyển đổi tiền chất androgen thành estrogen, tạo estrogen từ các mô khác trong cơ thể) Ức chế aromatase giúp ức chế giảm sản xuất estrogen, đặc biệt ở những phụ nữ mãn kinh chỉ sản xuất aromatase không sản xuất estrogen nữa Các chất ức chế aromatase hiện đang được sử dụng là thuốc ức chế aromatase không steroid thế hệ thứ 3 (có thể đảo ngược): Anastrozol 1 mg/ngày uống và Letrozol 2,5 mg/ngày uống hoặc steroidal (không thể đảo ngược): Exemestan 25 mg/ngày uống Chỉ dùng cho bệnh nhân mãn kinh [13]
• Ngăn chặn tác động của estrogen lên tế bào khối u:
- Thuốc điều biến chọn lọc thủ thể estrogen- SERM (Selection estrogen receptor modulators): đóng vai trò chủ vận/ đối kháng estrogen hoặc cả hai tùy vào mô đích Tamoxifen là SERM được dùng nhiều nhất, ngoài ra còn có Toremifen và Raloxifen Có thể được sử dụng cho bệnh nhân trước và sau mãn kinh
- Thuốc làm suy giảm chọn lọc thụ thể estrogen- SERD (Selection estrogen receptor degrader): chất đối kháng estrogen, không có tác dụng chủ vận, như Fluvestrant [13].
Tamoxifen trong điều trị ung thư vú
Cơ chế tác dụng của tamoxifen
Trong những bệnh nhân ung thư vú, có khoảng 60 - 70% bệnh nhân có thụ thể nội tiết estrogen (ER) dương tính Estrogen đóng vai trò chính trong việc thúc đẩy sự tăng sinh của cả biểu mô vú bình thường và biểu mô vú tân sinh, gây ra khối u UTV Ba cơ chế chính được cho là có liên quan đến tác dụng gây ung thư của chúng: kích thích tăng sinh tế bào thông qua hoạt động nội tiết tố qua trung gian thụ thể ER, tác động gây độc gen trực tiếp bằng cách tăng tỷ lệ đột biến thông qua kích hoạt trao đổi chất qua trung gian cytochrom P450 và gây ra dị tật [26]
Tamoxifen (TAM) thể hiện cả tác dụng chủ vận và đối kháng estrogen ở các bộ phận khác nhau trong cơ thể Bởi có hai tác dụng này nên TAM được sử dụng cho bệnh nhân như một bộ điều biến thụ thể estrogen chọn lọc (SERM) Tamoxifen là SERM được sử dụng phổ biến nhất trong điều trị UTV hiện nay, có tác dụng trước và sau mãn kinh với liều uống 20 mg/ngày; phản ứng với tamoxifen khác nhau tùy thuộc vào phần trăm ER và PR từ các tế bào ung thư vú ER+, liệu pháp dùng tamoxifen vẫn có tác dụng kéo dài sau khi kết thúc điều trị [14] TAM hoạt động như một chất đối kháng estrogen trong tế bào ung thư vú ER+, chất chủ vận estrogen một phần trong tế bào nội mạc tử cung và chất chủ vận estrogen trong tế bào xương [13] Ở xương, TAM kích thích các thụ thể estrogen thay vì ngăn chặn chúng, tạo ra tác dụng chủ vận estrogen và có thể ngăn ngừa loãng xương ở phụ nữ sau mãn kinh [23] Trong mô vú, tamoxifen cạnh tranh đối kháng vị trí gắn với estrogen, ngăn không cho estrogen liên kết và kích thích thụ thể, gây ra tác dụng chống estrogen và chống ung thư Tamoxifen làm chậm chu trình tế bào thông qua các quá trình nội bào xuôi dòng, nên cũng được phân loại là thuốc kìm tế bào Tamoxifen có ái lực thấp với ER [6] nên hoạt tính dược lý còn phụ thuộc vào sự chuyển đổi thành chất chuyển hóa dạng có hoạt tính , endoxifen, bởi CYP2D6 [12] Endoxifen cạnh tranh với estrogen và liên kết với ER với ái lực cao hơn TAM gần 100 lần [6] Ngoài ra, tamoxifen ức chế quá trình glycosyl hóa ceramide và bước enzyme có thể giúp ảnh hưởng đặc tính ức chế khối u của ceramide, dẫn chất béo của spakenolipids Tamoxifen và các chất chuyển hóa N-desmethyltamoxifen và 4-hydroxytamoxifen đã được chứng minh là có tác dụng ức chế quá trình thủy phân ceramide bởi enzyme ceramidase Sự can thiệp đặc biệt này làm chậm quá trình phá hủy ceramide và do đó làm giảm thiểu sự hình thành sphingosine 1-phosphate, một loại spakenolipid có đặc tính thúc đẩy tăng trưởng ung thư Các liệu pháp tập trung vào ceramide đang trở thành
10 biện pháp can thiệp lâm sàng hấp dẫn trong điều trị ung thư, các tác nhân như tamoxifen có thể làm chậm quá trình tạo ra spakenolipids thấp nhất và giải phóng ceramide đệm thông qua ức chế glycosyl hóa, có tầm quan trọng mới [24] Một số cơ chế khác được đưa ra là tamoxifen có thể kích hoạt quá trình chết theo chu trình của tế bào thông qua ức chế hoạt tính của protein kinase, dẫn đến kích hoạt con đường c-Jun N-terminal kinase [15].
Tamoxifen trong phác đồ điều trị ung thư vú
Tamoxifen được chỉ định với bệnh nhân có thủ thể nội tiết ER+, là liệu pháp bổ trợ trong UTV giai đoạn sớm bao gồm phụ nữ tiền mãn kinh, sau mãn kinh và nam giới; điều trị UTV giai đoạn tiến triển hoặc di căn [1] Tamoxifen làm giảm nguy cơ tái phát và tử vong do ung thư vú khi được dùng như liệu pháp bổ trợ và mang lại sự giảm nhẹ triệu chứng một cách hiệu quả cho bệnh nhân ung thư vú di căn [27] Tamoxifen làm giảm 49% nguy cơ ung thư vú xâm lấn và 50% nguy cơ ung thư vú không xâm lấn, làm giảm sự xuất hiện của các khối u dương tính với thụ thể estrogen tới 69% [16]
Dưới đây là một số phác đồ nội tiết bổ trợ trong điều trị UTV:
- Nếu có các yếu tố nguy cơ cao (dựa trên kích thước khối u, di căn hạch, điểm mô bệnh học ), đặc biệt là phụ nữ dưới 35 tuổi, phối hợp ức chế buồng trứng (bằng chất đồng vận GnRH) hoặc cắt buồng trứng (bằng phẫu thuật hoặc xạ trị) và tamoxifen Ở nhóm đối tượng này kết hợp cắt hoặc ức chế buồng trứng với thuốc ức chế aromatase (AI) cho kết quả tốt hơn kết hợp với tamoxifen Thời gian ức chế buồng trứng có thể đến 5 năm Nếu sau 5 năm, bệnh nhân vẫn chưa mãn kinh, cần cân nhắc sử dụng tiếp Các trường hợp nguy cơ thấp có thể điều trị tamoxifen đơn độc Các trường hợp nguy cơ thấp có chống chỉ định tamoxifen, nên sử dụng ức chế buồng trứng hoặc cắt buồng trứng phối hợp với AI
- Sau 5 năm sử dụng tamoxifen, các trường hợp nguy cơ cao (dựa trên kích thước khối u, di căn hạch và điểm mô bệnh học) có thể tiếp tục điều trị tamoxifen đến 10 năm hoặc chuyển sang AI trong 5 năm (nếu bệnh nhân chuyển sang mãn kinh)
- Thuốc AI đơn độc (không kết hợp với ức chế buồng trứng) không có tác dụng điều trị ở bệnh nhân chưa mãn kinh Vì vậy, thuốc không được sử dụng ở bệnh nhân không đánh giá được chức năng buồng trứng, chỉ dựa vào hiện tượng mất kinh sau hoá trị
• Bệnh nhân đã mãn kinh
- Sử dụng AI từ đầu trong 5 năm Sau 5 năm điều trị có thể cân nhắc dùng tiếp
- Lựa chọn khác là AI trong 2-3 năm sau đó chuyển sang tamoxifen cho đủ 5 năm
- Các bệnh nhân mãn kinh đã sử dụng 4-6 năm tamoxifen, có thể chuyển sang
AI trong 5 năm hoặc cân nhắc điều trị tiếp tamoxifen cho đủ 10 năm
- Các bệnh nhân mãn kinh nhưng có chống chỉ định AI, không dung nạp với AI hoặc không thể dùng AI vì các lý do khác, nên sử dụng tamoxifen trong 5 năm hoặc cân nhắc dùng lên đến 10 năm
- Bệnh nhân UTV nam có ER+ nên được điều trị nội tiết bổ trợ bằng tamoxifen Nếu có chống chỉ định tamoxifen, sử dụng chất đồng vận GnRH kết hợp AI
➢ Giai đoạn di căn (IV) Điều trị nhằm mục đích giảm triệu chứng liên quan khối u, nâng cao chất lượng sống và kéo dài thời gian sống
- Các bệnh nhân không điều trị nội tiết trong vòng 1 năm trước đó có thể điều trị bằng các thuốc AI nếu đã mãn kinh Cắt buồng trứng (bằng phẫu thuật hoặc xạ trị) hoặc ức chế buồng trứng (bằng chất đồng vận GnRH) ở phụ nữ chưa mãn kinh Lựa chọn khác đối với các bệnh nhân này là tamoxifen nhưng đây là phương pháp kém hiệu quả hơn
- Nếu trước đó bệnh nhân đã dùng tamoxifen, hiện đã mãn kinh có thể chuyển sang AI hoặc ngược lại, bệnh nhân đã điều trị AI có thể chuyển sang tamoxifen
- Điều trị nội tiết duy trì ở bệnh nhân có thụ thể nội tiết dương tính, đã ổn định sau hóa trị cho bệnh di căn là một lựa chọn hợp lý
- Đối với UTV nam, điều trị nội tiết cũng được ưu tiên nếu ER dương tính, trừ khi lo ngại hoặc có bằng chứng bệnh kháng điều trị nội tiết hoặc bệnh tiến triển nhanh cần hóa trị.
Tác dụng không mong muốn của tamoxifen
Giống như nhiều loại thuốc điều trị ung thư, tamoxifen có nhiều tác dụng phụ đi kèm, mặc dù những tác dụng phụ này ít khi nghiêm trọng và gây tử vong Các tác dụng phụ thường gặp nhất là tác dụng phụ liên quan đến hoạt động của estrogen như kinh nguyệt không đều, tiết dịch âm đạo và đặc biệt, bốc hỏa là tác dụng phụ thường gặp nhất của tamoxifen, xảy ra ở 80% phụ nữ dùng tamoxifen [16] Các tác dụng phụ ít gặp hơn có thể bao gồm mất ngủ, chóng mặt, nhức đầu, tăng cân, đau bụng, tiêu chảy, khó tiêu,
12 nhiễm trùng đường tiết niệu, giảm tiểu cầu, đau lưng, rụng tóc, đau xương và đục thủy tinh thể [27]
Mặc dù tamoxifen hoạt động như một chất kháng estrogen trong mô vú nhưng lại có đặc tính estrogen ảnh hưởng đến xương, hệ tim mạch, nội mạc tử cung và có thể cả gan Tamoxifen có cảnh báo về khối u ác tính ở tử cung, tắc mạch phổi và đột quỵ ở những bệnh nhân có nguy cơ cao mắc bệnh ung thư hoặc ung thư biểu mô ống tại chỗ Phụ nữ được điều trị kéo dài bằng tamoxifen có nguy cơ mắc huyết khối tĩnh mạch sâu (DVT) và tắc mạch phổi (PE) Hai năm đầu khi bắt đầu điều trị bằng tamoxifen là thời điểm quan trọng nhất có nguy cơ cao mắc DVT, PE [22] Khoảng 2 trong số 1.000 phụ nữ UTV dùng tamoxifen có nguy cơ phát triển ung thư nội mạc tử cung với tỷ lệ cao gấp hai đến ba lần so với nguy cơ dân số bình thường Nguy cơ này không liên quan đến liều lượng của tamoxifen mà liên quan đến thời gian sử dụng và sự tích lũy Nguy cơ gia tăng này có thể có tác động về thể chất và tâm lý đối với hàng nghìn phụ nữ hiện đang dùng thuốc Tuy nhiên, theo nghiên cứu thì lợi ích của việc giảm 40% UTV là lớn hơn nguy cơ phát triển ung thư nội mạc tử cung [11]
Các tác dụng phụ nghiệm trọng nêu trên bao gồm u nội mạc tử cung, nguy cơ mắc huyết khối tắc mạch, tắc mạch phổi, có thể hạn chế việc sử dụng tamoxifen ở một mức độ nhất định Việc theo dõi tốt quá trình điều trị là bắt buộc: thường là khám phụ khoa, khám tế bào Babes-Papanicolaou, U/S qua âm đạo [13] Việc sử dụng liều tamoxifen thấp hơn cũng làm giảm tác dụng phụ hơn và giảm độc tính hơn, phù hợp về mặt lâm sàng so với tamoxifen liều tiêu chuẩn và có bằng chứng gián tiếp mạnh mẽ cho thấy tamoxifen liều thấp 5 mg cũng có hiệu quả chống ung thư [7].
Tình trạng kháng tamoxifen
Tamoxifen là liệu pháp bổ trợ hàng đầu trong điều trị UTV, làm giảm 50% tỷ lệ tái phát hàng năm và giảm 31% tỷ lệ tử vong [54] Mặc dù vậy, 20-30% khối u vẫn kháng lại liệu pháp tamoxifen, vốn đã có trước khi điều trị (kháng thuốc mới) hoặc phát triển đề kháng trong quá trình trị liệu (kháng tamoxifen mắc phải) [5] Điều này đặt ra một thách thức lớn trong việc điều trị hiệu quả UTV Vì vậy, khám phá cơ chế kháng của Tamoxifen là rất được chú trọng, để tìm ra con đường điều trị mới giảm tình trạng kháng Tamoxifen này
Một số cơ chế kháng Tamoxifen đã được đưa ra bao gồm: mất biểu hiện/ chức năng
ER, mất các đường truyền tín hiệu, biểu hiện thay đổi microRNA, cũng như chuyển hóa tamoxifen Ngoài ra, cả nhiễu xuyên âm genomic và phi genomic cũng như mối tương quan phức tạp giữa các phân nhóm ER và các yếu tố tăng trưởng đều góp phần phát triển kháng nội tiết [41] Trong đó, việc mất/ thay đổi biểu hiện ER là cơ chế chính của tình
13 trạng kháng thuốc mới đối với liệu pháp nội tiết, nó là tình trạng chuyển từ ER(+) ban đầu thành ER(-) Tác dụng của tamoxifen chủ yếu qua trung gian ER và mức độ biểu hiện ER yếu tố dự báo chính về đáp ứng của tamoxifen, nên việc mất biểu hiện ER có thể gây ra tình trạng kháng Các cơ chế làm mất biểu hiện ER là trạng thái thiếu oxy gây ra sự thoái hóa ER [63]; biểu hiện quá mức EGFR hoặc HER2 góp phần ức chế phiên mã gen ER, dẫn đến kháng nội tiết; tăng hoạt tính MAPK và liên quan đến p53 tăng cường các khối u vú có ER(-) [43].
Dược liệu có tác dụng chống ung thư vú
Các dược liệu có tác dụng chống ung thư vú
Tác dụng không mong muốn, tình trạng kháng thuốc và chi phí điều trị cao là những vấn đề hiện tại liên quan đến việc quản lý hiệu quả điều trị UTV [60] Vì vậy, cần một con đường mới trong phương pháp điều trị UTV nhằm mục tiêu an toàn và tiết kiệm chi phí Từ xa xưa, trong dân gian đã lưu truyền nhiều loại thuốc quý có tác dụng điều trị ung thư trên người [37] Vì vậy, các chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên là chất chống ung thư đầy hứa hẹn Hiệu quả của chúng cũng được báo cáo là làm giảm độc tính và ít tái phát tình trạng kháng thuốc đối với các tác nhân chống ung thư nhắm mục tiêu nội tiết tố (kháng đa thuốc như đã thấy với một số tác nhân chống ung thư) [36]
Các thành phần hoạt tính từ dược liệu có thể ức chế các liên kết phụ thuộc vào ER (tăng trưởng và tăng sinh tế bào) và độc lập (tạo ra các gốc tự do và tác nhân gây độc gen) và có khả năng gây ra stress oxy hóa và gây ung thư thông qua tín hiệu ER [34]
Cơ chế tác dụng của các thành phần thực vật đó bao gồm ức chế tăng sinh tế bào, phát triển khối u, di căn, apoptosis hình thành mạch và điều hòa các con đường sống sót của tế bào Chúng điều chỉnh tín hiệu nội bào như yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu, yếu tố hạt nhân -κB và Bcl-2 có liên quan mật thiết đến sự phát triển và tiến triển của ung thư vú [58] Hoạt chất nổi bật như isoflavone, được chứng minh làm giảm nguy cơ tử vong xuống 29% và nguy cơ tái phát ung thư xuống 32% Việc sử dụng isoflavone trong thời thơ ấu hoặc trưởng thành góp phần vào sự biệt hóa mô vú, dẫn đến giảm cấu trúc giải phẫu dẫn đến hình thành tế bào ung thư Cơ chế tác dụng của chất này như một chất có đặc tính estrogen và/hoặc kháng estrogen [53]
Các thành phần khác từ chế phẩm thiên nhiên như flavonoid, alkaloid, terpenoid, coumarin được biết đến với đặc tính chống oxy hóa, chống viêm (glabridin, curcumin, arctigenin và ajoene) và kích hoạt tế bào lympho (axit quinic, β-carotene, epigallocatechin-3-gallate, và ginsan), là những đặc tính điều hòa miễn dịch mạnh cần thiết để ức chế hoặc chống lại các tế bào ung thư [35] Sự có mặt của các thành phần như alkaloid, tanin, terpenoid và saponin có thể là nguyên nhân cho tác dụng chống
UTV [49] Thành phần chính trong Khổ sâm (Croto tonkinensis Gagnep.) làditerpenoid ent-kaurane cho thấy tiềm năng trong việc chống UTV
Có độc tính chọn lọc chống lại các tế bào UTV là một đặc tính quan trọng để lựa chọn dược liệu cho điều trị hoặc kết hợp điều trị UTV Thành phần polyphenol được chứng minh là có khả năng gây độc tế bào chọn lọc đối với các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và HTB-126 tương ứng [50], là thành phần chính của Thanh cao hoa vàng (artemisia annua L.) [52] và Xạ đen (Celastrus hindsii Benth.) [38] Vì vậy, hai dược liệu này được chọn để đánh giá tác dụng kết hợp để điều trị UTV
Một loạt các thực vật tiềm năng được đánh giá cao trong việc chống lại một số loại ung thư ở người Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) được chứng minh là có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa liên quan đến tác dụng chống ung thư, gây độc tế bào gây ức chế tế bào ung thư nội tiết như tế bào ung thư tuyến tiền liệt, ung thư cổ tử cung [48] Đặc biệt, Mảnh cộng (Clinacanthus nutans), Ngưu bàng (Arctium lappa L.) và Bán chi liên (Scutellaria barbata Wall.) đã được chứng minh có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào UTV MCF-7 bằng cơ chế chết tế bào theo chu trình trong các nghiên cứu gần đây khi dùng đơn độc [47], [29], [57]; nên nó rất được kỳ vọng trong nghiên cứu kết hợp với TAM nhằm đưa ra liệu pháp điều trị mới
Tác dụng chống ung thư của các thành phần hoạt tính của một số loại thảo dược có thể được cải thiện một cách hiệp quả bằng cách kết hợp chúng với các loại thuốc hóa trị liệu thông thường như tamoxifen, doxorubicin, 5-fluorouracil và paclitaxel Hơn nữa, hiệu quả của các loại thuốc hóa trị liệu cũng được cải thiện và giảm độc tính [58] Một số sản phẩm tự nhiên, bao gồm morin, silybin, epigallocatechin gallate (EGCG), myricetin, baicalein, curcumin, kaempferol hoặc quercetin đã được phát hiện là làm tăng khả dụng sinh học của TAM và các chất chuyển hóa của nó trong cơ thể [66] Vì vậy đã thúc đẩy ý tưởng nghiên cứu để đánh giá tác dụng hiệp đồng của Tamoxifen cùng với các loại dược liệu tiềm năng, nhằm mục đích an toàn, hiệu quả cho người bệnh.
Viễn chí Trung Quốc (VCTQ) – Polygala chinensis Linn
Viễn chí Trung Quốc (VCTQ), tên khoa học là Polygala chinensis Linn., được tìm thấy lần đầu tiên bởi Carl Linnaeus (1707-1778) và xuất bản trên tạp chí Species Plantarum số: 704 năm 1753
VCTQ thuộc bộ Fabales, họ Polygalaceae, chi Polygala (gồm 422 loài được chấp nhận)
Hình 1.1 Hình ảnh cây Viễn chí Trung Quốc (chụp bởi ThS Lại Việt Hưng) 1.3.2.2 Đặc điểm và phân bố
VCTQ là cây thảo sống hàng năm, mọc thẳng, cao 10- 25 cm; rễ sơ cấp màu cam, tròn; thân gỗ, cành nhỏ, có lông mao mềm Cuống lá khoảng 1 mm, có lông; phiến lá màu xanh, hình trứng ngược, hình elip hoặc hình mũi mác, kích thước (2,6- 10× 1- 1,5) cm, dạng giấy, có lông, gân giữa nổi lên in dọc theo trục, ít gân bên, mờ, gốc hình nêm đến tròn hoặc hình tim, mép nguyên, hơi cong, đỉnh tù hoặc nhọn; lá bắc cơ bản 2 lá, hình mũi mác Hoa khoảng 4,5 mm; lá đài 5, màu xanh, có lông chuyển, lá đài ngoài 3, hình trứng hoặc hình mác, khoảng 2 mm, đỉnh nhọn; lá đài trong 2, hình cánh hoa, hình liềm, khoảng 4,5 mm, có 4 hoặc 5 gân rõ rệt, gốc có móng guốc, đỉnh nhọn Cánh hoa
3, màu vàng hoặc trắng pha hồng; bên trong có lông trắng tập trung ở gốc; tràng hoa 4 mm, đỉnh có 2 phần phụ, dạng bó Nhị hoa 8, 1/2 dưới hợp nhất tạo thành bao nhị mở, chia ở 1/2 trên thành 8 sợi tự do; bao phấn hình trứng hẹp Bầu nhụy hình tròn, đường kính 1 mm, có lông; kiểu dáng cong cong, đỉnh hình móc câu; nhụy ở móc Quả nang có đài hoa rộng, hình cầu hoặc hình chữ nhật, có viền, có lông chuyển, có lông ngắn thưa thớt và hiếm khi có lông thẳng dài, kích thước (3,2– 4,4)x (3,7–4,7) mm Hạt màu đen, hình trứng, có lông trắng dày đặc [42]
Hình 1.2 Phân bố tự nhiên của VCTQ
Phạm vi phân bố tự nhiên của VCTQ chủ yếu ở khu vực Châu Á, vùng nhiệt đới
& cận nhiệt đới đến Quần đảo Caroline; Châu Á vùng ôn đới có: Trung Quốc, Nansei- shoto, Đài Loan ; Châu Á vùng nhiệt đới có: Tiểu lục địa Ấn Độ, Assam, Bangladesh, Đông Himalaya, Ấn Độ, Pakistan, Sri Lanka, Tây Himalaya, Campuchia, Lào, Myanmar, Nicobar, Thái Lan, Việt Nam, Malesia, Philippin, Sumatra, Papuasia New Guinea, Solomon; Châu Úc có lãnh thổ phía Bắc, Queensland; Thái Bình Dương có Tây Bắc Thái Bình Dương, đảo Caroline [51]
VCTQ có nguồn gốc từ Colombia, Assam, Bangladesh, Borneo, Campuchia, Đảo Caroline, Trung Nam Trung Quốc, Đông Nam Trung Quốc, Đông Himalaya, Hải Nam, Ấn Độ, Jawa, Lào, Đảo Sunda Nhỏ, Malaya, Myanmar, Nansei-shoto, New Guinea, Đảo Nicobar, Lãnh thổ phía Bắc, Pakistan, Philippines, Queensland, Quần đảo Solomon, Sri Lanka, Sumatra, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam, Tây Himalaya [51]
Bảng 1.1: Các thành phần dược chất chính trong cao chiết ethanol của VCTQ [31]
STT Tên thành phần Bản chất Công thức phân tử
STT Tên thành phần Bản chất Công thức phân tử
Việc sàng lọc hóa thực vật của toàn bộ cây VCTQ cho thấy sự hiện diện của alkaloid, catechin, coumanin, flavonoid, tannin, saponin, steroid, phenol, glycoside, terpenoid và xanthoprotein Sau khi tiến hành phân lập bằng sắc ký khí- phân tích khối phổ, người ta đã xác định được chính xác các thành phần hoạt chất chính như bảng trên, trong đó 1, 5–Anhydro-d-mannitol là hoạt chất chủ yếu (92,30%) [31] Công dụng chính được đề cập đến của 1,5–Anhydro-d-mannitol như một hợp chất chống ung thư Các thành phần khác đều có công dụng khác nhau, có thể giúp ích cho việc xác định tác dụng dược lý của cây: 1-Heptatriacotanol và 1,2-Benzenedicarboxylic acid có tác dụng kháng khuẩn; 9,12-octadecadienoic acid (Z,Z) có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm, chống dị ứng, hạ cholesterol máu; squalene có tác dụng kháng khuẩn, chống oxy hóa, ngăn ngừa ung thư [40]
Cao chiết VCTQ làm giảm lượng đường huyết và tăng chỉ số insulin trong máu ở những chuột bị gây ra tiểu đường có chỉ số đường huyết cao, insulin trong máu thấp Nồng độ ure, creatinine, glycosyl hóa hemoglobin (HBA1C) cũng được điều hòa bởi VCTQ Hoạt tính chống đái tháo đường của cao chiết có thể có do cơ chế kích thích insulin tuyến tụy còn sót lại hoặc bằng cách tăng sử dụng glucose ở ngoại vi Trong phân
18 tích hóa thực vật trước đó đã chỉ ra sự hiện diện của các hoạt chất flavonoid, glycoside, phenolic, tanin và alkaloid Trong đó, flavonoid được báo cáo là có tác dụng tái tạo các tế bào beta đảo tụy bị tổn thương, phenolic được chứng minh là thuốc hạ đường huyết hiệu quả Đây có thể củng cố thêm kết luận, VCTQ có tác dụng kiểm soát lượng đường trong máu ở bệnh nhân tiểu đường [30]
VCTQ được chứng minh có tác dụng cải thiện quá trình chuyển hóa lipid, trong đó việc làm giảm nồng độ insulin trong máu được nêu ở trên đóng một vai trò quan trọng Insulin là một chất ức chế mạnh quá trình phân giải lipid, nó sẽ kích hoạt enzyme lipoprotein lipase và thủy phân chất béo trung tính và sự thiếu hụt insulin dẫn đến bất hoạt các enzyme này, từ đó gây ra tình trạng tăng triglycerid máu Vì vậy, việc điều trị bằng VCTQ làm giảm đáng kể nồng độ lipid huyết thanh ở chuột mắc bệnh tiểu đường có thể là do sự cải thiện nồng độ insulin Ngoài ra, nó còn làm giảm nồng độ phospholipid, kiểm soát nồng độ cholesterol toàn phần (TC), chất béo trung tính (TG), LDL-C, VLDL-C và HDL-C; chứng thực tác dụng hạ mỡ máu của mình [30]
Cao chiết ethanol của VCTQ cũng được chứng minh là có tác dụng bảo vệ gan Trong nghiên cứu gây độc gan bằng chất độc gan CCl4 trên chuột, nó Đối với lô chuột được uống cao chiết VCTQ với liều 100 và 200 mg/kg uống trong 14 ngày, các chỉ số trên gần như về mức bình thường; so với nhóm được điều trị bằng thuốc chuẩn silymarin có thể khẳng định được tác dụng bảo vệ gan của VCTQ [62]
VCTQ cũng thể hiện tác dụng bảo vệ gan trong việc điều chỉnh hoạt động của glutamate pyruvate transaminase huyết thanh (SGPT) và glutamate huyết thanh oxaloacetate transaminase (SGOT) trong gan trên mô hình chuột bị nhiễm độc alloxan về mức hoạt động bình thường Mà mức SGPT và SGOT còn đóng vai trò là chỉ số đánh giá chức năng gan và việc phục hồi mức bình thường của các thông số này cho thấy hoạt động bình thường của gan [30]
• Diệt gốc tự do, chống oxy hóa
Gurav và cộng sự (2007) sàng lọc hóa chất thực vật của chiết xuất VCTQ cho thấy sự hiện diện của saponin, coumarin, flavonoid và lignan; đó là một nguồn giàu flavonoid và polyphenol Bằng các phương pháp phân tích khác nhau như xét nghiệm loại bỏ gốc tự do 1, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), xét nghiệm loại bỏ gốc tự do oxide nitric và xét nghiệm loại bỏ gốc hydrogen peroxide dẫn đến kết luận rằng phenolics, flavonoid trong đó có hoạt động loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ Flavonoid và polyphenol cũng được
19 chứng minh là có hoạt tính chống oxy hóa và được sử dụng để phòng ngừa và chữa các bệnh ung thư chủ yếu có liên quan đến hoạt động diệt các gốc tự do này [44], [60]
Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa của VCTQ còn được chứng minh trong nghiên cứu của N Vijaya Rekha và cộng sự (2019) bằng phương pháp DPPH sử dụng DPPH (gốc tự do 1.1- diphenyl-2- picrylhyldrazyl) Liên quan đến tác dụng chống oxy hóa, nghiên cứu còn đánh giá thêm hoạt tính chống giun sán của cao chiết VCTQ [61]
Các nghiên cứu cũng chỉ rằng tác dụng của VCTQ hoạt động phụ thuộc vào nồng độ trong tất cả cỏc mụ hỡnh IC50 được phỏt hiện lần lượt là 56,09 àg/ml, 47,63 àg/ml và 41,003 àg/ml trong xột nghiệm DPPH, xột nghiệm loại bỏ gốc tự do NO và xột nghiệm loại bỏ H2O2 [44] IC50 của cao chiết metanol VCTQ là 30,1 àg/ml
Phương pháp phân tích để đánh giá khả năng phối hợp thuốc
Sử dụng phối hợp tamoxifen cùng với các thành phần dược liệu giúp cải thiện một cách hiệu quả tác dụng chống ung thư vú, giảm độc tính và tình trạng kháng thuốc [58] Hiện nay, phối hợp thuốc cũng đã được sử dụng rộng rãi và trở thành lựa chọn hàng đầu trong điều trị nhiều căn bệnh nguy hiểm như ung thư và hội chứng suy giảm miễn dịch [55] Vì vậy, việc đánh giá khả năng phối hợp thuốc rất cần thiết để xác định liệu pháp phối hợp điều trị tiềm năng Để đánh giá được chính xác hiệu quả của việc phối hợp thuốc trong quá trình sàng lọc, việc lựa chọn phương pháp phân tích thống kê tin cậy là rất quan trọng Có nhiều phương pháp đã được đề xuất như Loewe (1953), Bliss (1956), Carter và cộng sự (1988), Berenbaum (1989), Greco, Par và Rustum (1990), Machado và Robinson (1994), Greco, Bravo and Parsons (1995), Dawson, Gennings và cộng sự (2002), Chou (2006), Fitzgerald và cộng sự (2006), Lee và cộng sự (2007), Whitehead và cộng sự (2008) Các thuật toán mới đã được phát triển trong những năm gần đây như Peifer và cộng sự (2010) , Harbron (2010) , Zhao và cộng sự (2012 , 2014) Qua rất nhiều nổ lực nghiên cứu, hai nguyên tắc chính trong việc lựa chọn mô hình nghiên cứu là: tính cộng hợp Loewe ( Loewe 1953 ) và sự độc lập của Bliss ( Bliss 1956 ) Trong các nghiên cứu kết hợp thuốc điều trị bệnh ung thư, tính cộng Loewe phù hợp khi các loại thuốc nhắm vào cùng một con đường Ngược lại, nguyên tắc độc lập của Bliss phù hợp hơn khi hai loại thuốc không loại trừ lẫn nhau, tức là khi mỗi loại nhắm vào một con đường truyền tín hiệu khác nhau Quyết định sử dụng tính cộng Loewe hay độc lập Bliss có thể được đưa ra dựa trên việc mỗi loại thuốc kết hợp có nhắm vào cùng một con đường hay không Trước tiên, phải xây dựng một mô hình tham chiếu cho giả thuyết về sự không có tương tác giữa hai thuốc, nghĩa là tác dụng của mỗi thuốc là độc lập với nhau, khi kết hợp các
21 thuốc thì tác dụng đạt được là tổng của mỗi tác dụng thuốc riêng lẻ Bất kỳ sai lệch nào so với các mô hình tham chiếu sẽ được coi là hiệp đồng tăng cường hoặc đối kháng Nếu kết hợp thuốc X và Y đạt mức đáp ứng tương tự so với khi sử dụng riêng lẻ nhưng với liều lượng thấp hơn thì phối hợp đó được gọi là hiệp đồng tăng cường [55]
Sự tương tác của các tác nhân hoạt động sinh học/ hóa học thường được nhóm thành ba loại: tính hiệp đồng, tính độc lập và tính đối kháng, dựa trên mức độ khác biệt của các hiệu ứng kết hợp quan sát được so với phản ứng mong đợi khi không có tương tác[18]
Mô hình Bliss Independence [55]:
Một trong những phương pháp lâu đời nhất để định lượng tác dụng hiệp đồng là mô hình Bliss Independence Mô hình này giả định rằng các loại thuốc không tương tác với nhau và tạo ra đáp ứng của chúng một cách độc lập
Giả sử SA, SB, SAB lần lượt là % tế bào sống sót sau khi tiếp xúc với chất thử A, chất thử B và sự kết hợp giữa 2 chất thử với cùng liều khi dùng đơn độc
A và B hiệp đồng cộng nếu SAB = SA x SB
A và B hiệp đồng tăng cường nếu SAB < SA x SB
A và B đối kháng nếu SAB > SA x SB
Mô hình Loewe Additivity [19]:
Giả định 1: Không có tương tác nào xảy ra khi một chất được kết hợp với chính nó
Giả định 2: Liều gây ra cùng đáp ứng của hai chất khác nhau là tương đương nhau
Nếu liều đơn độc D1 của chất A và D2 của chất B tạo ra cùng đáp ứng M, trong trường hợp không có tương tác giữa A và B thì bất kỳ sự kết hợp liều lượng nào (d1, d2) của A và B thỏa mãn điều kiện 𝑑1
𝐷2= 1 sẽ tạo ra đáp ứng M tương tự khi dùng liều đơn độc của mỗi chất
Sự khác biệt chính của hai mô hình tham chiếu ở giả định cơ bản của chúng trong cơ chế tác dụng độc lập hay cùng cơ chế tác dụng Trên thực tế, không có mô hình nào trong số này đúng cho mọi trường hợp phối hợp thuốc Do đó, việc sử dụng mô hình nào để đánh giá đã trở thành lựa chọn cá nhân của các nhà nghiên cứu
2 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
Hóa chất
Bảng 2.1: Danh mục hóa chất trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco, Hoa Kỳ
2 Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Hoa Kỳ
3 Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco, Hoa Kỳ
5 Phosphate-Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher,
7 Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, Đức
8 Trypan blue Gibco, Hoa Kỳ
13 Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma, Đức
14 Nước cất 2 lần Viện Dược liệu
15 Kháng thể sơ cấp anti-Ki-67 Abcam, Anh
16 Kháng thể thứ cấp kháng IgG thỏ liên hợp huỳnh quang
17 Môi trường gắn kết với DAPI Abcam, Anh
Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ, thiết bị trong nghiên cứu
STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất
1 Tủ cấy vô trùng Telstar, Tây Ban Nha
2 Tủ ấm CO2 Incusafe, Nhật Bản
3 Máy ly tâm Beckman Coulter, Hoa Kỳ
4 Kính hiển vi Zeiss, Đức
5 Máy SpectraMax iD3 Molecular Devices, Hoa Kỳ
9 Bếp cách thủy Shel Lab, Hoa Kỳ
10 Đĩa 96 giếng SPL, Hàn Quốc
11 Đĩa nuôi cấy tế bào 100mm Becton Dickinson, Pháp
12 Đĩa nuôi cấy tế bào 35mm Corning, Hoa Kỳ
13 Buồng 8 giếng Biologix, Hoa Kỳ
14 Pipet đơn kênh, đa kênh Eppendorf, Đức
15 Pipet tips Corning, Hoa Kỳ
16 Ống tube 1.5mL Corning, Hoa Kỳ
17 Ống falcon 15mL, 50mL Corning, Hoa Kỳ
18 Lam kính Sail Brand, Trung Quốc
19 Máy cất nước hai lần Aquatron, Thụy Điển
20 Máy siêu âm Hwashin Technology, Hàn
21 Nồi hấp tiệt trùng Sturdy, Hoa Kỳ
23 Buồng đếm tế bào Marienfeld, Đức
Nội dung nghiên cứu
➢ Nội dung 1: Tiến hành sàng lọc quy mô nhỏ tác dụng hiệp đồng của dược liệu và tamoxifen trên tế bào MCF-7 bằng mô hình Bliss Independence và lựa chọn được dược liệu tiềm năng là VCTQ
➢ Nội dung 2: Kiểm chứng tác dụng hiệp đồng của VCTQ và tamoxifen trên tế bào
MCF-7 bằng phương pháp Chou-Talalay
➢ Nội dung 3: Đánh giá tác dụng hiệp đồng của VCTQ và tamoxifen trên sự tăng sinh của tế bào MCF-7.
Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị mẫu thử
• Các dung dịch gốc cao chiết dược liệu được chuẩn bị ở nồng độ 50 mg/mL Cân chính xác khoảng 10 mg cao chiết dược liệu, hòa tan trong dung dịch DMSO vừa đủ 200 àL, sử dụng mỏy siờu õm để hũa tan
• Dung dịch gốc tamoxifen được chuẩn bị ở nồng độ 50 mM, sau đó pha loãng 10 lần với dung dịch DMSO thành nồng độ 5 mM, vortex để hòa tan
Sàng lọc quy mô nhỏ tác dụng hiệp đồng của dược liệu và tamoxifen trên tế bào MCF-7 Lựa chọn được VCTQ là dược liệu tiềm năng nhất
Kiểm chứng tác dụng hiệp đồng của VCTQ và tamoxifen trên tế bào MCF-7 Đánh giá tác dụng hiệp đồng của VCTQ và tamoxifen trên sự tăng sinh tế bào MCF-7
Thử nghiệm sống sót tế bào Phương pháp Bliss
Thử nghiệm sống sót tế bào Phương pháp Chou- Talalay
Thử nghiệm hóa tế bào miễn dịch biểu thị Ki-67
Thử nghiệm hình thành cụm tế bào
Nuôi cấy tế bào
Tế bào MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM đầy đủ (có bổ sung 10% huyết thanh thai bò, 1% kháng sinh penicillin - streptomycin) Tế bào được nuôi cấy ở 37°C, 5% CO2, 95% độ ẩm cho đến khi phát triển tới mức phủ 70% bề mặt đĩa nuôi, cấy chuyển 3 lần để tế bào phát triển ổn định trước khi thực hiện thực nghiệm
Rửa tế bào bằng dung dịch đệm phosphat sinh lý (PBS) Sau đó tách tế bào ra khỏi đĩa petri bằng 0,25% trypsin- EDTA, ủ trong tủ ấm 3 phút Trung hòa trypsin bằng môi trường DMEM đầy đủ, đem ly tâm 1500 vòng trong 5 phút để thu lấy cặn tế bào Pha loãng cặn tế bào bằng môi trường DMEM đầy đủ, đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm Neubauer Sau đó pha loãng tế bào để cấy trải ra đĩa với mật độ phù hợp với mỗi thí nghiệm.
Thử nghiệm sống sót tế bào
Thử nghiệm sống sót tế bào (hay thử nghiệm MTT) là phương pháp dùng để đánh giá khả năng sống của tế bào dựa trên nguyên tắc: các tế bào sống qua các enzym oxidoreductase, dehydrogenase, oxidase, peroxidase phụ thuộc NAD(P)H trong ty thể hoặc tương bào sẽ khử hóa MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) có màu vàng thành dạng formazan có màu tím mà các tế bào chết sẽ mất khả năng này Formazan được hòa tan trong DMSO và định lượng bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 570nm Số lượng tế bào sống tỷ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật độ quang của dung dịch
Cấy trải tế bào MCF-7 vào đĩa 96 giếng với mật độ 1.10 4 tế bào/giếng trong môi trường DMEM đầy đủ, nuôi cấy ở 37℃, 5% CO2/95% độ ẩm, ủ qua đêm Loại bỏ môi trường cũ, xử lý tế bào bằng tamoxifen và/hoặc cao chiết dược liệu trong môi trường DMEM Mỗi nồng độ mẫu thử được tiến hành thử nghiệm trên 3 giếng và thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần Sau khi ủ mẫu 48 giờ, thờm vào mỗi giếng 10 àL dung dịch MTT 5 mg/mL, tiếp tục ủ trong 3 giờ Sau đó loại bỏ môi trường, thêm vào mỗi giếng
200 àL dung dịch DMSO để hũa tan tinh thể formazan Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 570 nm bằng máy SpectraMax iD3
% tế bào bị ức chế = 100% - % tế bào sống sót
2.4.4.1 Đánh giá khả năng phối hợp thuốc – dược liệu bằng phương pháp phân tích Bliss
Giả sử SA, SB, SAB lần lượt là % tế bào sống sót sau khi tiếp xúc với chất thử A, chất thử B và sự kết hợp giữa 2 chất thử với cùng liều khi dùng đơn độc [33]
A và B hiệp đồng cộng nếu SAB = SA x SB
A và B hiệp đồng tăng cường nếu SAB < SA x SB
A và B đối kháng nếu SAB > SA x SB
Tiến hành thử nghiệm sống sút tế bào sau khi điều trị bằng tamoxifen 5 àM và/hoặc dược liệu 50 àg/mL
Xác định % tế bào sống sót bởi tamoxifen và/hoặc dược liệu, từ đó tính toán điểm Bliss = SA x SB - SAB
Trong đó SA, SB, SAB lần lượt là % tế bào sống sau khi dùng tamoxifen, dược liệu, phối hợp tamoxifen và dược liệu ở nồng độ nghiên cứu
So sánh điểm Bliss với 0 để kết luận về khả năng phối hợp thuốc – dược liệu Điểm Bliss = 0: độc lập Điểm Bliss > 0: hiệp đồng Điểm Bliss < 0: đối kháng
2.4.4.2 Định lượng khả năng phối hợp thuốc – dược liệu bằng bằng phương pháp phân tích Chou-Talalay
Phương pháp Chou-Talalay cho đến nay là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để định lượng sự kết hợp thuốc [25] Phương pháp Chou-Talalay được xây dựng dựa trên phương trình tác dụng trung bình Phương trình này cung cấp cơ sở lý thuyết cho phương trình chỉ số kết hợp (CI) cho phép định lượng tương tác thuốc và cũng cung cấp các thuật toán mô phỏng chỉ số giảm liều (DRI) cho từng loại thuốc trong liệu pháp phối hợp [8], [9], [10]
Phương trình tác dụng trung bình (median-effect equation)
D là liều lượng/nồng độ của một thuốc fa là tác dụng gây ra bởi D fu là phần không bị tác dụng bởi D (fu = 1-fa)
Dm là liều lượng/nồng độ của thuốc gây ra tác dụng 50% (ví dụ như IC50) m là hệ số biểu thị hình dạng của đường cong liều lượng - tác dụng
Phương trình chỉ số kết hợp (Combination Index - CI)
(Dx)1, (Dx)2 lần lượt là liều lượng/nồng độ của mỗi chất đơn độc để tạo ra cùng một đáp ứng
D1, D2 lần lượt liều lượng/nồng độ của mỗi chất mà khi kết hợp chúng (D1 + D2) tạo ra đáp ứng tương tự như khi dùng đơn độc (Dx)1, (Dx)2
CI < 1: hiệp đồng tăng cường
Phương trình chỉ số giảm liều (Dose Reduction Index - DRI)
DRI là thông số phản ánh liều lượng của mỗi thuốc khi kết hợp có thể giảm bao nhiều lần so với liều lượng đơn độc để tạo ra cùng 1 đáp ứng
DRI > 1: giảm liều DRI lần
Khảo sát tác dụng của tamoxifen và VCTQ trên sống sót tế bào MCF-7 để xác định
Sau đó tiến hành thử nghiệm sống sót tế bào điều trị bằng tamoxifen và/hoặc VCTQ với nồng độ của từng chất là bội số của giá trị IC50 tương ứng (bao gồm 0,25 x
IC50; 0,5 x IC50 ; IC50 ; 1,5 x IC50 ; 2,0 x IC50 ) trong cùng điều kiện thí nghiệm, được trình bày cụ thể trong bảng 2.3
Bảng 2.3: Nồng độ thử của tamoxifen và/hoặc dược liệu trên tế bào MCF-7 theo phương pháp Chou-Talalay
0 0,25xIC50 0,5xIC50 IC50 1,5xIC50 2,0xIC50
Tamoxifen hoặc dược liệu đơn độc
Kết hợp tamoxifen và dược liệu
Tính toán kết quả: Xác định % tế bào bị ức chế bởi tamoxifen và/hoặc dược liệu ở các nồng độ thử, sau đó sử dụng phần mềm CompuSyn để tính toán chỉ số kết hợp CI và chỉ số giảm liều DRI.
Thử nghiệm hình thành cụm tế bào
Thử nghiệm hình thành cụm tế bào là phương pháp dùng để đánh giá tác dụng của thuốc lên sự phát triển và tăng sinh của tế bào dựa trên khả năng hình thành cụm tế bào từ một tế bào đơn lẻ Cụm tế bào được xác định bao gồm ít nhất 50 tế bào
Cấy trải tế bào MCF-7 vào các đĩa nuôi cấy tế bào 35mm với mật độ 2x10 3 tế bào/đĩa trong môi trường DMEM đầy đủ, nuôi cấy ở 37℃, 5% CO2/95% độ ẩm trong
24 giờ Xử lý tế bào bằng nồng độ thích hợp tamoxifen và/hoặc dược liệu tiềm năng nhất trong môi trường DMEM đầy đủ Mỗi nồng độ mẫu thử được tiến hành thử nghiệm trên 1 đĩa và thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần Sau 24 giờ ủ mẫu, loại bỏ môi trường cũ, thay bằng môi trường DMEM đầy đủ Sau khoảng thời gian tương đương ít nhất 6 lần phần chia tế bào (10-14 ngày), loại bỏ môi trường cũ và rửa sạch tế bào bằng dung dịch đệm phosphat sinh lý (PBS) Cố định tế bào bằng ethanol 70% trong 10 phút Nhuộm tế bào với dung dịch tím tinh thể (crystal violet) 0,5% trong 30 phút Rửa sạch tế bào bằng nước cất và để khô ở nhiệt độ phòng Chụp ảnh và sử dụng phần mềm ImageJ để đếm cụm tế bào
% cụm tế bào hình thành = 𝑆ố 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ụ𝑚 𝑡ế 𝑏à𝑜 đượ𝑐 ℎì𝑛ℎ 𝑡ℎà𝑛ℎ ở 𝑛ℎó𝑚 𝑡ℎử
𝑆ố 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ụ𝑚 𝑡ế 𝑏à𝑜 đượ𝑐 ℎì𝑛ℎ 𝑡ℎà𝑛ℎ ở 𝑛ℎó𝑚 𝑐ℎứ𝑛𝑔 x 100% (Cụm tế bào được xác định bao gồm ít nhất 50 tế bào.)
Thử nghiệm hóa tế bào miễn dịch
Ki-67 là protein nhân liên quan đến sự tăng sinh tế bào Protein này hiện diện trong các pha hoạt động của chu kỳ tế bào (pha G1, S, G2, M) nhưng không tồn tại trong pha nghỉ G0 Chỉ số Ki-67 (phần trăm tế bào dương tính với Ki-67) tỷ lệ thuận với tốc độ phát triển và tăng sinh tế bào Chỉ số này được đánh giá bằng phương pháp hóa tế bào miễn dịch Hóa tế bào miễn dịch là một kỹ thuật phát hiện và hiển thị protein hoặc kháng nguyên trong tế bào bằng cách sử dụng các kháng thể nhận dạng cụ thể mục tiêu quan tâm dựa vào phản ứng liên kết kháng nguyên – kháng thể Kháng nguyên tế bào được hiển thị bằng cách sử dụng kháng thể sơ cấp liên hợp với chất huỳnh quang (phát hiện
31 trực tiếp) hoặc sử dụng kháng thể sơ cấp, theo sau là kháng thể thứ cấp liên hợp với chất huỳnh quang (phát hiện gián tiếp)
Cấy trải tế bào MCF-7 vào buồng 8 giếng với mật độ 5x10 4 tế bào/giếng trong môi trường DMEM đầy đủ, nuôi cấy ở 37℃, 5% CO2/95% độ ẩm, ủ qua đêm Loại bỏ môi trường cũ, xử lý tế bào bằng nồng độ thích hợp tamoxifen và/hoặc dược liệu tiềm năng nhất trong môi trường DMEM Mỗi nồng độ mẫu thử được tiến hành thử nghiệm trên 2 giếng và thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần Sau khi ủ mẫu 24 giờ, loại bỏ môi trường cũ và rửa sạch tế bào bằng dung dịch đệm phosphat sinh lý (PBS) 3 lần x 5 phút/lần Cố định tế bào bằng 4% paraformaldehyd/ PBS trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, rửa sạch tế bào bằng PBS 3 lần x 5 phút/lần Gây thấm tế bào bằng 0,2% Triton X/PBS trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, rửa sạch tế bào bằng PBS 3 lần x 5 phút/lần Ủ tế bào với dung dịch 3% albumin huyết thanh bò (BSA)/PBS trong 45 phút ở nhiệt độ phòng để phong bế các vị trí gắn không đặc hiệu của kháng thể Sau đó ủ qua đêm ở 4°C với kháng thể sơ cấp anti-Ki-67 đã được pha loãng bằng dung dịch 3% BSA/PBS (tỉ lệ pha loãng 1:200) Rửa sạch tế bào bằng PBS 3 lần x 5 phút/lần Ủ tế bào với kháng thể thứ cấp kháng IgG thỏ liên hợp huỳnh quang Alexa-488 đã được pha loãng bằng dung dịch 3% BSA/PBS (tỉ lệ pha loãng 1:500) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối Rửa sạch tế bào 2 lần bằng PBS và 1 lần bằng nước cất x 5 phút/lần, trong bóng tối Tháo buồng ngăn khỏi lớp phiến kính, nhỏ môi trường liên kết với DAPI trước khi gắn lam kính lên bề mặt tế bào Quan sát tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang được trang bị các bộ lọc thích hợp Chụp ảnh và sử dụng phần mềm ImageJ để đếm tế bào
Khả năng tăng sinh tế bào được đánh giá thông qua tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính với Ki-67 (% Ki-67 hay chỉ số Ki-67) % Ki-67 càng cao nghĩa là tế bào tăng sinh càng mạnh
Phương pháp phân tích số liệu
Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm Graphpad Prism phiên bản 8.02 Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Mean ± SD) từ ít nhất 3 thí nghiệm được lặp lại độc lập Sự khác biệt thống kê giữa các nhóm được phân tích bằng phương pháp one-way analysis of variance (ANOVA) kết hợp với test hậu kiểm Tukey Giá trị p < 0,05 biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
3.1 Kết quả sàng lọc các mẫu dược liệu để tìm ra dược liệu tiềm năng nhất có khả năng tăng cường hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của tamoxifen
Dựa trên tổng quan y văn và kết quả của các nghiên cứu đã được công bố, chúng tôi đã chọn ra 8 dược liệu tiềm năng để tiến hành sàng lọc dược liệu có tác dụng tăng cường hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của tamoxifen Sau đó tiến hành thử nghiệm sống sót tế bào để đánh giá tác dụng tương tác của các cao chiết dược liệu này ở nồng độ 50 àg/mL với tamoxifen ở nồng độ 5 àM, phõn tớch kết quả thụng qua phương pháp Bliss thu được kết quả như bảng dưới đây
Bảng 3.1: Kết quả sàng lọc dược liệu có tác dụng tăng cường hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của tamoxifen ở nồng độ 5 àM, cao chiết dược liệu ở nồng độ 50 àg/mL
Hiệu suất chiết (%) Điểm Bliss
Hiệu suất chiết (%) Điểm Bliss
8 Bán chi liên Scutellaria barbata Wall 31,55 -0,153 (-0,293)-(-0,013) [57]
Sau khi điều trị phối hợp 8 loại dược liệu cùng tamoxifen, có 7 dược liệu có điểm Bliss < 0 cho thấy các dược liệu này có khả năng đối kháng tác dụng với tamoxifen Dược liệu Viễn chí Trung Quốc có điểm Bliss > 0 (giá trị trung bình > 0 và khoảng tin cậy 95% không chứa giá trị 0) cho thấy Viễn chí Trung Quốc là dược liệu tiềm năng nhất tăng cường hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của tamoxifen
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn Viễn chí Trung Quốc để tiếp tục đánh giá sâu hơn tác dụng hiệp đồng của nó với tamoxifen trong ức chế tế bào UTV bằng các thử nghiệm: thử nghiệm tỷ lệ sống sót tế bào bằng phương pháp Chou- Talalay, sự hình thành cụm tế bào và mức độ biểu hiện Ki-67 trên tế bào MCF-7
3.2 Kết quả đánh giá tác dụng hiệp đồng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của tamoxifen và VCTQ
3.2.1 Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư MCF-7 của VCTQ và tamoxifen và xác định IC 50
Chúng tôi đã khảo sát sơ bộ tác dụng của tamoxifen hoặc VCTQ trên sống sót tế bào MCF-7 để xác định được IC50 của tamoxifen và VCTQ Thực hiện trên dải nồng độ 2; 4; 6; 8; 10; 15 àM đối với tamoxifen và 12,5; 25; 50; 100; 150; 200 àg/mL đối với VCTQ Kết quả thu được như hình 3.1
Hình 3.1 Xác định IC50 của tamoxifen và VCTQ
Kết luận: IC50 của tamoxifen là 4,6 àM và IC50 của VCTQ 28,4 àg/mL
3.2.2 Định lượng tác dụng hiệp đồng của tamoxifen và VCTQ trên ức chế sống sót tế bào MCF-7 Để tiếp tục kiểm chứng và định lượng tác dụng hiệp đồng của tamoxifen với VCTQ trên ức chế sống sót tế bào MCF-7, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng của tamoxifen và VCTQ trên sống sót tế bào MCF-7 bằng phương pháp Chou – Talalay, với tamoxifen nồng độ 1,25; 2,5; 5; 7,5; 10 àM và/hoặc VCTQ 6,25; 12,5; 25; 37,5; 50 àg/mL trong cùng một điều kiện thí nghiệm Sử dụng phần mềm CompuSyn để tính toán chỉ số kết hợp (CI) và chỉ số giảm liều (DRI) thu được kết quả được trình bày trong bảng 3.3, hình 3.1 và 3.2
Bảng 3.2: Tỷ lệ ức chế tế bào MCF-7 (Fa) khi điều trị bằng tamoxifen, VCTQ đơn độc hoặc kết hợp
Log (nồng độ àg/mL)
Log (nồng độ àg/mL )
Chứng Tamoxifen hoặc dược liệu đơn độc Kết hợp tamoxifen và dược liệu
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn F a – CI cho sự kết hợp giữa tamoxifen và VCTQ trên tế bào
MCF-7 theo phương pháp Chou-Talalay
Phần trăm tế bào MCF-7 bị ức chế bởi nồng độ tamoxifen 1,5; 2,5; 5; 7,5; 10 àM lần lượt là 21,6%, 29,8%, 37,8%, 55,3%, 64,2% Phần trăm tế bào MCF-7 bị ức chế bởi nồng độ VCTQ 6,26; 12,5; 25; 37,5; 50 àg/mL lần lượt là 9,2%, 26,7%, 45,3%, 50,7%, 69,6% Số liệu cho thấy, cả tamoxifen và VCTQ đều thể hiện tác dụng ức chế tế bào UTV MCF-7 và đều phụ thuộc vào nồng độ Nồng độ tamoxifen, VCTQ càng cao thì khả năng ức chế tế bào càng tăng , nhưng không quá vượt trội, cụ thể tamoxifen ở nồng độ 1,5 àM ức chế 21,6% tế bào nhưng khi tăng lờn nồng độ thử nghiệm cao nhất 10 àM cũng chỉ ức chế khoảng 64,2 % tế bào, còn VCTQ tác dụng phụ thuốc vào nồng độ hơn, tại nồng độ 6,26 àg/mL chỉ ức chế 9,2% tế bào nhưng lờn đến nồng độ cao 50 àg/mL nó đã ức chế 69,6% tế bào
Khi kết hợp tamoxifen và VCTQ, tác dụng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 tăng đáng kể so với dung tamoxifen hoặc VCTQ đơn độc Kết quả ở các nồng độ 1,25/6,25; 2,5/12,5; 5/25; 7,5/37,5; 10/50 (àM/ àg/mL) phần trăm tế bào MCF-7 bị ức chế lần lượt là 18,0%, 48,9%, 70,2%, 88,3%, 93,4% So sánh cụ thể tamoxifen ở liều cao nhất 10
Hiệp đồng tăng cường Đối kháng
36 àM thỡ chỉ ức chế 64,2 % tế bào, VCTQ tại nồng độ cao nhất 50 àg/mL chỉ đạt được 69,6% thì khi kết hợp ức chế gần như hoàn toàn các tế bào MCF-7 (93,4%)
CI được vẽ trên trục y để đánh giá tác dụng hiệp đồng của thuốc, (Fa) trên trục x là một hàm của mức tác dụng Sự kết hợp ở các cặp nồng độ 2,5/12,5; 5/25; 7,5/37,5; 10/50 (àM/ àg/mL) của tamoxifen và VCTQ thể hiện tỏc dụng hiệp đồng tăng cường (CI < 1), riờng sự kết hợp tamoxifen và VCTQ tại cặp nồng độ 1,25/6,25 (àM/ àg/mL) có giá trị CI > 1 chưa thể hiện tác dụng hiệp đồng Chỉ số kết hợp giảm mạnh khi tăng nồng độ kết hợp hai thuốc từ 1,752; 0,880; 0,797; 0,455 đến 0,368; chứng tỏ tác dụng hiệp đồng tăng lên khi nồng độ kết hợp thuốc tăng Tại IC50 chỉ số kết hợp là 0,797, đến nồng độ kết hợp thuốc cao nhất chỉ số này là 0,368, đạt tác dụng hiệp đồng cao nhất (CI thấp nhất) Như vậy, từ nồng độ TAM 2,5 àM, VCTQ 6,25 àg/mL, hai thuốc này cú tỏc dụng hiệp đồng trên ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 và sự hiệp đồng này tăng theo nồng độ
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn F a – DRI cho sự kết hợp giữa tamoxifen và VCTQ trên tế bào MCF-7 theo phương pháp Chou-Talalay
Chỉ số giảm liều (DRI) của tamoxifen và VCTQ ở các mức tác dụng ức chế (Fa) hầu như đều lớn hơn 1 (chỉ cú ở nồng độ 1,25/6,25 (àM/ àg/mL), DRI của tamoxifen bé hơn 1), cho thấy khi phối hợp hai chất với nhau có thể làm giảm liều lượng của một trong hai loại thuốc để đạt được tác dụng ức chế tương tự khi dùng đơn độc Cụ thể, khi sử dụng kết hợp ở các mức ức chế tế bào MCF-7 48,9%, 70,2%, 88,3%, 93,4%; chỉ số giảm liều (DRI) của tamoxifen so với điều trị đơn độc lần lượt là 2,38; 3,32; 8,31; 12,74; DRI của VCTQ lần lượt là 2,18; 2,02; 2,99; 3,45
Các giá trị DRI của tamoxifen đều lớn hơn nhiều so với 1 và các giá trị này tăng dần theo mức tác dụng ức chế tế bào MCF-7 đạt được Đặc biệt, để đạt hiệu quả ức chế 93,4%; dùng kết hợp với VCTQ giúp làm giảm nồng độ tamoxifen đi 12,74 lần so với dung tamoxifen đơn độc
3.2.3 Tác dụng hiệp đồng của tamoxifen và VCTQ trên ức chế hình thành cụm tế bào MCF-7
Thử nghiệm đánh giá hình thành cụm tế bào được sử dụng để xác nhận tác dụng hiệp đồng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của tamoxifen và VCTQ Kết quả được thể hiện trong hình 3.3
Hình 3.4: Ảnh hưởng của tamoxifen và VCTQ đến sự hình thành cụm tế bào MCF-7
(A): Hình ảnh đại diện các cụm tế bào hình thành sau khi điều trị ở mỗi nhóm,
(B): Phần trăm cụm tế bào hình thành ở mỗi nhóm (* p < 0,05)
TAM 1,25 àM VCTQ 5 àg/mL
Kết quả đánh giá tác dụng hiệp đồng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của
Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư MCF-7 của VCTQ và tamoxifen và xác định IC 50
Chúng tôi đã khảo sát sơ bộ tác dụng của tamoxifen hoặc VCTQ trên sống sót tế bào MCF-7 để xác định được IC50 của tamoxifen và VCTQ Thực hiện trên dải nồng độ 2; 4; 6; 8; 10; 15 àM đối với tamoxifen và 12,5; 25; 50; 100; 150; 200 àg/mL đối với VCTQ Kết quả thu được như hình 3.1
Hình 3.1 Xác định IC50 của tamoxifen và VCTQ
Kết luận: IC50 của tamoxifen là 4,6 àM và IC50 của VCTQ 28,4 àg/mL.
Định lượng tác dụng hiệp đồng của tamoxifen và VCTQ trên ức chế sống sót tế bào MCF-7
tế bào MCF-7 Để tiếp tục kiểm chứng và định lượng tác dụng hiệp đồng của tamoxifen với VCTQ trên ức chế sống sót tế bào MCF-7, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng của tamoxifen và VCTQ trên sống sót tế bào MCF-7 bằng phương pháp Chou – Talalay, với tamoxifen nồng độ 1,25; 2,5; 5; 7,5; 10 àM và/hoặc VCTQ 6,25; 12,5; 25; 37,5; 50 àg/mL trong cùng một điều kiện thí nghiệm Sử dụng phần mềm CompuSyn để tính toán chỉ số kết hợp (CI) và chỉ số giảm liều (DRI) thu được kết quả được trình bày trong bảng 3.3, hình 3.1 và 3.2
Bảng 3.2: Tỷ lệ ức chế tế bào MCF-7 (Fa) khi điều trị bằng tamoxifen, VCTQ đơn độc hoặc kết hợp
Log (nồng độ àg/mL)
Log (nồng độ àg/mL )
Chứng Tamoxifen hoặc dược liệu đơn độc Kết hợp tamoxifen và dược liệu
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn F a – CI cho sự kết hợp giữa tamoxifen và VCTQ trên tế bào
MCF-7 theo phương pháp Chou-Talalay
Phần trăm tế bào MCF-7 bị ức chế bởi nồng độ tamoxifen 1,5; 2,5; 5; 7,5; 10 àM lần lượt là 21,6%, 29,8%, 37,8%, 55,3%, 64,2% Phần trăm tế bào MCF-7 bị ức chế bởi nồng độ VCTQ 6,26; 12,5; 25; 37,5; 50 àg/mL lần lượt là 9,2%, 26,7%, 45,3%, 50,7%, 69,6% Số liệu cho thấy, cả tamoxifen và VCTQ đều thể hiện tác dụng ức chế tế bào UTV MCF-7 và đều phụ thuộc vào nồng độ Nồng độ tamoxifen, VCTQ càng cao thì khả năng ức chế tế bào càng tăng , nhưng không quá vượt trội, cụ thể tamoxifen ở nồng độ 1,5 àM ức chế 21,6% tế bào nhưng khi tăng lờn nồng độ thử nghiệm cao nhất 10 àM cũng chỉ ức chế khoảng 64,2 % tế bào, còn VCTQ tác dụng phụ thuốc vào nồng độ hơn, tại nồng độ 6,26 àg/mL chỉ ức chế 9,2% tế bào nhưng lờn đến nồng độ cao 50 àg/mL nó đã ức chế 69,6% tế bào
Khi kết hợp tamoxifen và VCTQ, tác dụng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 tăng đáng kể so với dung tamoxifen hoặc VCTQ đơn độc Kết quả ở các nồng độ 1,25/6,25; 2,5/12,5; 5/25; 7,5/37,5; 10/50 (àM/ àg/mL) phần trăm tế bào MCF-7 bị ức chế lần lượt là 18,0%, 48,9%, 70,2%, 88,3%, 93,4% So sánh cụ thể tamoxifen ở liều cao nhất 10
Hiệp đồng tăng cường Đối kháng
36 àM thỡ chỉ ức chế 64,2 % tế bào, VCTQ tại nồng độ cao nhất 50 àg/mL chỉ đạt được 69,6% thì khi kết hợp ức chế gần như hoàn toàn các tế bào MCF-7 (93,4%)
CI được vẽ trên trục y để đánh giá tác dụng hiệp đồng của thuốc, (Fa) trên trục x là một hàm của mức tác dụng Sự kết hợp ở các cặp nồng độ 2,5/12,5; 5/25; 7,5/37,5; 10/50 (àM/ àg/mL) của tamoxifen và VCTQ thể hiện tỏc dụng hiệp đồng tăng cường (CI < 1), riờng sự kết hợp tamoxifen và VCTQ tại cặp nồng độ 1,25/6,25 (àM/ àg/mL) có giá trị CI > 1 chưa thể hiện tác dụng hiệp đồng Chỉ số kết hợp giảm mạnh khi tăng nồng độ kết hợp hai thuốc từ 1,752; 0,880; 0,797; 0,455 đến 0,368; chứng tỏ tác dụng hiệp đồng tăng lên khi nồng độ kết hợp thuốc tăng Tại IC50 chỉ số kết hợp là 0,797, đến nồng độ kết hợp thuốc cao nhất chỉ số này là 0,368, đạt tác dụng hiệp đồng cao nhất (CI thấp nhất) Như vậy, từ nồng độ TAM 2,5 àM, VCTQ 6,25 àg/mL, hai thuốc này cú tỏc dụng hiệp đồng trên ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 và sự hiệp đồng này tăng theo nồng độ
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn F a – DRI cho sự kết hợp giữa tamoxifen và VCTQ trên tế bào MCF-7 theo phương pháp Chou-Talalay
Chỉ số giảm liều (DRI) của tamoxifen và VCTQ ở các mức tác dụng ức chế (Fa) hầu như đều lớn hơn 1 (chỉ cú ở nồng độ 1,25/6,25 (àM/ àg/mL), DRI của tamoxifen bé hơn 1), cho thấy khi phối hợp hai chất với nhau có thể làm giảm liều lượng của một trong hai loại thuốc để đạt được tác dụng ức chế tương tự khi dùng đơn độc Cụ thể, khi sử dụng kết hợp ở các mức ức chế tế bào MCF-7 48,9%, 70,2%, 88,3%, 93,4%; chỉ số giảm liều (DRI) của tamoxifen so với điều trị đơn độc lần lượt là 2,38; 3,32; 8,31; 12,74; DRI của VCTQ lần lượt là 2,18; 2,02; 2,99; 3,45
Các giá trị DRI của tamoxifen đều lớn hơn nhiều so với 1 và các giá trị này tăng dần theo mức tác dụng ức chế tế bào MCF-7 đạt được Đặc biệt, để đạt hiệu quả ức chế 93,4%; dùng kết hợp với VCTQ giúp làm giảm nồng độ tamoxifen đi 12,74 lần so với dung tamoxifen đơn độc.
Tác dụng hiệp đồng của tamoxifen và VCTQ trên ức chế hình thành cụm tế bào MCF-7
Thử nghiệm đánh giá hình thành cụm tế bào được sử dụng để xác nhận tác dụng hiệp đồng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 của tamoxifen và VCTQ Kết quả được thể hiện trong hình 3.3
Hình 3.4: Ảnh hưởng của tamoxifen và VCTQ đến sự hình thành cụm tế bào MCF-7
(A): Hình ảnh đại diện các cụm tế bào hình thành sau khi điều trị ở mỗi nhóm,
(B): Phần trăm cụm tế bào hình thành ở mỗi nhóm (* p < 0,05)
TAM 1,25 àM VCTQ 5 àg/mL
➢ Hình ảnh trực quan (A) cho thấy số lượng cụm tế bào hình thành sau khi điều trị bằng tamoxifen hoặc VCTQ ít hơn so với nhóm chứng Ở nhóm điều trị phối hợp tamoxifen và VCTQ, số cụm tế bào được hình thành ít hơn hẳn so với nhóm chứng cũng như so với điều trị bằng tamoxifen hoặc VCTQ đơn độc Hơn nữa, số lượng tế bào trong mỗi cụm ở nhóm điều trị phối hợp ít hơn so với các nhóm còn lại
➢ Tính toán kết quả ở hình (B) cho thấy: Điều trị bằng tamoxifen hoặc VCTQ đơn độc làm giảm sự hình thành cụm tế bào MCF-7, % cụm tế bào hình thành lần lượt là 49% và 62% so với nhóm chứng So với nhóm chứng, điều trị kết hợp tamoxifen và VCTQ làm giảm số cụm tế bào hình thành còn 30% Trong đó, tỷ lệ cụm tế bào hình thành ở nhóm điều trị phối hợp tamoxifen và VCTQ giảm đáng kể so với nhóm điều trị bằng tamoxifen hoặc VCTQ đơn độc (30% so với 49% hoặc 62%), sự giảm có ý nghĩa thống kê (p