Bùi thị thúy so sánh thành phần hóa học của cao đặc bài thuốc “thần dược cứu mệnh” được bào chế bằng các phương pháp khác nhau khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ THÚY SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO ĐẶC BÀI THUỐC “THẦN DƯỢC CỨU MỆNH” ĐƯỢC BÀO CHẾ BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ THÚY Mã sinh viên: 1801679 SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO ĐẶC BÀI THUỐC “THẦN DƯỢC CỨU MỆNH” ĐƯỢC BÀO CHẾ BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Trần Văn Ơn Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật Khoa Dược Liệu – Dược học cổ truyền LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS TS Trần Văn Ơn, người trực tiếp, hướng dẫn em hồn thành khóa luận Ngồi ra, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Hồng Quỳnh Hoa, cảm ơn truyền đạt giải đáp thắc mắc em liên quan đến trình thực nghiệm bàn luận đề tài Nhân đây, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô môn Thực Vật, khoa Dược Liệu – Dược Cổ Truyền giúp đỡ tiếp thêm động lực cho em suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, em cảm ơn Ban giám hiệu, Bộ mơn phịng ban tồn thể cán bộ, nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, bảo tận tình cho em suốt năm học tập trường Cuối cùng, em xin cảm ơn tới gia đình, nhà trường bạn bè ủng hộ, động viên đồng hành em chặng đường năm vừa qua Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Bùi Thị Thúy MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Bài thuốc “Thần dược cứu mệnh” 1.1.1 Công thức thuốc 1.1.2 Cơ sở thuốc .2 1.1.3 Cách chế biến theo y học cổ truyền 1.1.4 Chủ trị 1.1.5 Tác dụng .3 1.1.6 Liều dùng, cách dùng 1.1.7 Kiêng kỵ 1.2 Tóm tắt đặc điểm vị thuốc thuốc “Thần dược cứu mệnh” .4 1.2.1 Địa Long .4 1.2.2 Rau ngót 1.2.3 Đậu đen 1.4 Vài nét cao thuốc từ dược liệu 10 1.4.1 Định nghĩa 10 1.4.2 Phương pháp bào chế cao đặc 11 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Thiết bị 13 2.1.3 Hóa chất, dung mơi .13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu .14 2.3.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu nghiên cứu .14 2.3.2 Điều chế cao TH thuốc “Thần Dược Cứu Mệnh” 15 2.3.3 Phương pháp bào chế cao đơn thành phần cao PT 16 2.3.4 Đánh giá chất lượng cao đặc .17 2.3.5 Định tính thành phần hố học cao đặc TDCM phương pháp TLC .18 2.3.6 Định lượng thành phần hố học cao đặc TDCM 20 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Kiểm tra chất lượng vị thuốc đầu vào nghiên cứu 23 3.1.1 Địa long (Pheretima sp.) 23 3.1.2 Rau ngót (Sauropus androgynus (L) Merr.) .24 3.1.3 Đậu đen (Vigna unguiculata subsp cylindrica (L.)) 26 3.2 Bào chế kiểm tra số tiêu chất lượng cao TH TDCM 27 3.2.1 Bào chế cao TH 27 3.2.2 Kiểm tra số tiêu chất lượng cao TH 29 3.3 Bào chế cao đơn thành phần cao PT TDCM 29 3.3.1 Bào chế cao Địa long, cao Rau ngót cao Đậu đen 29 3.3.2 Bào chế cao PT TDCM .30 3.4 Định tính thành phần hố học cao TH, cao đơn thành phần cao PT TDCM phương pháp sắc ký lớp mỏng 34 3.4.1 Hệ dung môi (1) 34 3.4.2 Hệ dung môi (2) 37 3.5 Định lượng thành phần hố học cao TH cao PT TDCM 39 3.5.1 Định lượng protein toàn phần .39 3.5.2 Định lượng thành phần polyphenol toàn phần 40 BÀN LUẬN 43 4.1 Kiểm tra chất lượng đầu vào 43 4.2 Về kết bào chế cao TH cao PT thuốc TDCM 43 4.3 So sánh thành phần hóa học có cao TH cao PT TLC 44 4.4 So sánh hàm lượng protein toàn phần polyphenol toàn phần cao TH cao PT 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Ý nghĩa AcOH Acid acetic ĐĐ Đậu đen DĐVN V Dược điển Việt Nam V ĐL Địa Long EtOH Ethylacetat HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao PT Phối trộn R Hệ số hồi quy tuyến tính RN Rau ngót 10 RSD Độ lệch chuẩn tương đối 11 SD Phương sai 12 TDCM Thần Dược Cứu Mệnh 13 TH Tổng hợp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các chất phân lập xác định Rau ngót…………………………7 Bảng 3.1 Kết định lượng protein dược liệu Địa long…………………… 24 Bảng 3.2 Kết định lượng protein tồn phần Rau ngót………………………25 Bảng 3.3 Kết định lượng protein dược liệu Đậu đen…………………… 27 Bảng 3.4 Khối lượng hiệu suất chiết cao TH TDCM……………………… 27 Bảng 3.5 Kết đo pH mẫu cao tổng hợp………………………………… 29 Bảng 3.6 Khối lượng hiệu suất bào chế cao đơn thành phần……………………….29 Bảng 3.7 Khối lượng hàm ẩm cao PT………………………………………….30 Bảng 3.8 Kết đo pH cao PT……………………………………………… 30 Bảng 3.9 Kết sắc ký đồ hệ dung môi (1)……………………………………… 34 Bảng 3.10 Kết sắc ký đồ hệ dung môi (2) ……………………………………….37 Bảng 3.11 Kết thẩm định độ lặp lại phương pháp định lượng protein…………….39 Bảng 3.12 Hàm lượng protein mẫu cao TH cao PT… 39 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng polyphenol… 40 Bảng 3.14 Nồng độ độ hấp thụ acid galic………………………………………41 Bảng 3.15 Kết hàm lượng polyphenol cao phối hợp tổng hợp ……… 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Cơng thức hóa học số hợp chất Đậu đen Hình Bộ dụng cụ định lượng protein Kjeldahl……………………………….20 Hình 3.1 Dược liệu Địa Long 23 Hình 3.2 Hình bột dược liệu Địa Long 24 Hình 3.5 Dược liệu Đậu đen 26 Hình 3.6 Hình ảnh soi bột Đậu đen .26 Hình 3.7 Sơ đồ quy trình bào chế cao TH thuốc TDCM .28 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình bào chế cao đặc Địa Long 31 Hình 3.9 Sơ đồ quy trình bào chế cao đặc Rau ngót 32 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình bào chế cao đặc Đậu đen 33 Hình 3.11 Hình ảnh sắc ký đồ hệ dung môi (1) 35 Hình 3.12 So sánh phổ sắc ký cao PT cao TH 254nm chưa phun thuốc thử .36 Hình 3.13 So sánh phổ sắc ký cao PT cao TH 366nm chưa phun thuốc thử .36 Hình 3.14 So sánh phổ sắc ký cao PT cao TH ánh sáng trắng sau phun thuốc thử .36 Hình 3.15 Hình ảnh sắc ký đồ hệ dung môi (2) 38 Hình 3.16 So sánh phổ sắc ký cao PT cao TH 254nm .38 Hình 3.17 So sánh phổ sắc ký cao PT cao TH 366nm .38 Hình 3.18 Phương trình đường chuẩn gallic 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt xuất huyết Dengue bệnh truyền nhiễm gây dịch vi rút Dengue gây nên Bệnh xảy quanh năm, thường gia tăng vào mùa mưa Bệnh gặp trẻ em người lớn Đặc điểm sốt xuất huyết Dengue sốt, xuất huyết huyết tương, dẫn đến sốc giảm thể tích tuần hồn, rối loạn đơng máu, suy tạng, khơng chẩn đốn sớm xử trí kịp thời dễ dẫn đến tử vong Cho đến thời điểm tại, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu sốt xuất huyết sốt xuất huyết nặng [5] Từ xa xưa, y học cổ truyền phát triển Việt Nam hàng nghìn năm đóng vai trị quan trọng cơng tác chăm sóc sức khỏe người dân Một định hướng phát triển ngành Dược phát triển thuốc cổ truyền với ưu điểm an tồn, tác dụng phụ so với thuốc Tây y Trong đại dịch sốt xuất huyết năm 1969 Hà Nội khiến nhiều người tử vong, thuốc “Thần dược cứu mệnh” (TDCM) lương y Nguyễn An Định cung cấp cứu sống nhiều người, đặc biệt trường hợp bệnh nặng nhất, tưởng khó qua khỏi [3] Bài thuốc “Thần dược cứu mệnh” có thành phần giun đất, loại động vật bò sát nằm lòng đất mang lại cảm giác xa lánh, gây tâm lý e ngại việc sử dụng Do đó, thuốc khơng nhiều người biết đến sử dụng dạng thuốc sắc truyền thống Việc bào chế thành chế phẩm viên nén, viên nang, viên hoàn, giúp người bệnh dễ sử dụng hơn, đạt hiệu cao Hiện tại, thị trường xuất chế phẩm bào chế từ cao thuốc theo thành phần thuốc “Thần Dược Cứu Mệnh” Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp bào chế cao thuốc khác tới thành phần hóa học hàm lượng chất thuốc Để đánh giá khác thành phần hóa học cao thuốc “Thần Dược Cứu Mệnh” bào chế theo phương pháp khác nhau, tiến hành đề tài “So sánh thành phần hóa học cao đặc thuốc “Thần Dược cứu mệnh” bào chế phương pháp khác nhau” với mục tiêu: - Bào chế cao đặc thuốc TDCM theo phương pháp chiết toàn phần thuốc TDCM - Bào chế cao thuốc TDCM phối trộn từ cao đơn thành phần thuốc - So sánh thành phần hóa học cao TH cao PT thuốc TDCM CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Bài thuốc “Thần dược cứu mệnh” 1.1.1 Công thức thuốc Địa Long 10g Đậu đen 20g Rau ngót 15g Công thức thuốc sách “Những thuốc vị thuốc Việt Nam” có ghi lại: Địa Long 50g sấy khô, tương đương với 50 giun đất tươi (liều dùng cho người lớn trẻ từ 15 – 16 tuổi trở lên), 30g khô hay 30 tươi (cho trẻ từ – tuổi đến 13 – 14 tuổi), 20g khô hay 20 tươi (cho trẻ – tháng đến – tuổi) Đậu đen 100g Rau ngót – mớ bán chợ (tương đương với 200 – 300g), băm nhỏ cành [3] 1.1.2 Cơ sở thuốc 1.1.2.1 Theo dân gian Bài thuốc “Thần dược cứu mệnh” ghi chép sách Nam in đầu kỷ 20 với công dụng cứu người bốn khắc (60 phút) Năm 1940, thuốc xuất gần nguyên văn sách “Hai trăm thuốc quý” tác giả lương y Lê Văn Tình Sadec “Thần dược cứu mệnh” giới thiệu cụ Nguyễn An Định thông qua đăng báo Long An tháng 4/1997 Khơng có sở chứng minh, nhiên theo kinh nghiệm sử dụng thuốc nhiều bệnh nhân đồng thời sách ghi chép lại, thời gian tác dụng thuốc từ 63 – 65 phút Hiệu thuốc thể rõ ràng đại dịch sốt xuất huyết Hà Nội năm 1969 [3] 1.1.2.2 Theo y học cổ truyền Trong thuốc có vị thuốc Địa Long, Đậu đen Rau ngót Địa Long đóng vai trị qn thuốc, chiếm vị trí quan trọng thuốc Nhiều nghiên cứu chứng minh vị thuốc địa long có khả hạ sốt, kháng histamin, trị hen, chống đông máu, chống ung thư, làm lành vết thương, tái tạo tế bào thần kinh [17], [18], [47] Do đó, chủ trị thuốc “Thần dược cứu mệnh” chủ yếu dựa tác dụng vị thuốc Đậu đen rau ngót phối hợp thuốc giúp tăng tác dụng địa long, tăng dẫn thuốc vào tạng đồng thời làm mùi hôi Địa long, tạo mùi vị thơm ngon, dễ uống, giúp người bệnh khơng cịn cảm giác e ngại sử dụng giun đất ĐL RN ĐĐ PT ĐL TH RN ĐĐ PT TH b) a) Hình 3.13 Hình ảnh sắc ký đồ hệ dung môi (2) a) Phát vết 254nm b) Phát vết 366nm Hình 3.14 So sánh phổ sắc ký cao PT cao TH 254nm Hình 3.15 So sánh phổ sắc ký cao PT cao TH 366nm Từ phổ sắc ký cao PT cao TH bước sóng khác nhau, nhận thấy phổ có đỉnh đáy peak tương đương Về chiều cao phổ, đỉnh đáy peak 38 cao PT cao so với cao tổng hợp, chứng tỏ nồng độ vệt có Rf cao PT cao cao tổng hợp 3.5 Định lượng thành phần hoá học cao TH cao PT TDCM 3.5.1 Định lượng protein toàn phần Thẩm định lại phương pháp định lượng protein toàn phần cao TDCM cách: Cân xác 0,5g mẫu cao TH định lượng protein tồn phần theo phương pháp trình bày mục 2.3.6.1 Làm lặp lại lần mẫu cao tổng hợp Kết ghi nhận bảng 3.11 Bảng 3.11 Kết thẩm định độ lặp lại phương pháp định lượng protein Lần Hàm lượng protein (%) 20.95 20.6 21.72 20.14 21.44 20.77 Trung bình ± SD 20,93 ± 0,57% RSD 2,74% Kết thu hàm lượng protein 20,59 ± 0,57% với RSD = 2,74% (< 5%) Do khẳng định độ lặp lại phương pháp Kết định lượng protein hai loại: cao TH TDCM cao PT TDCM trình bày bảng 3.12 Bảng 3.12 Hàm lượng protein mẫu cao TH cao PT Mẫu cao Hàm lượng protein cao Hàm lượng protein cao TH (%) PT (%) 18,92 23,90 20,57 24,13 20,97 26,05 Trung bình 20,15 ± 1,09 24,69 ± 1,18 Cao TH thuốc TDCM có hàm lượng protein trung bình 20,15% cao PT có hàm lượng protein trung bình 24,69% Như vậy, thấy, hàm lượng protein cao TH thấp so với cao PT có điều kiện chiết xuất 39 3.5.2 Định lượng thành phần polyphenol toàn phần 3.5.2.1 Thẩm định phương pháp định lượng polyphenol toàn phần cao TDCM Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần cao TDCM trình bày mục 2.3.6.2 Kết thẩm định tính tương thích, độ đặc hiệu, độ xác sau:  Tính tương thích hệ thống Pha dung dịch acid gallic chuẩn có nồng độ 6mcg/ml từ dung dịch chuẩn gốc, thực phản ứng Folin – Ciocalteu Đo độ hấp thụ bước sóng 765nm Thực lần Độ hấp thụ đo 0,421± 0,0025 (RSD = 0,60%) Kết cho thấy: độ lệch chuẩn tương đối (RSD) độ hấp thụ dung dịch chuẩn sau phản ứng với thuốc thử Folin – Ciocalteu < 2% Như vậy, phương pháp phân tích tương thích với hệ thống quang phổ UV – VIS  Độ đặc hiệu Tiến hành đo quang song song mẫu trắng mẫu chuẩn có nồng độ 2mcg/ml bước sóng 765nm, thu Amẫu trắng = 0,002 Amẫu chuẩn = 0,151 Từ kết cho thấy mẫu trắng khơng có tín hiệu hấp thụ quang Do phương pháp UV-VIS có tính đặc hiệu phù hợp theo yêu cầu  Độ xác Cân xác 0,53g mẫu cao tổng hợp Tiến hành định lượng theo quy trình trình bày mục 2.3.6.2 Tính nồng độ mẫu thử cao TH dựa vào phương trình đường chuẩn Thực mẫu riêng biệt Kết thu trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng polyphenol Nồng độ Mẫu thử Cpolyphenol ± SD ngày (mcg/ml) (RSD) 3,884 ± 0,135 (mcg/ml) (RSD = 2,71%) Cpolyphenol ± SD khác ngày (RSD) 3.911 ± 0,138 (mcg/ml) (RSD = 3,54%) Nhận thấy RSD < 5%, kết chấp nhận để kết luận độ xác phương pháp  Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị dung dịch chuẩn với nồng độ 2, 4, 6, 8, 10 mcg/ml, tiến hành phản ứng Folin – Ciocalteu, song song làm mẫu trắng Đo độ hấp thụ bước sóng 765nm xây dựng đường chuẩn thể mối tương quan nồng độ độ hấp thụ acid gallic 40 Bảng 3.14 Nồng độ độ hấp thụ acid galic Mẫu Nồng độ acid Độ hấp thụ (A) galic (mcg/ml) 0,164 0,273 0,414 0,537 10 0,609 0.7 y = 0.0577x + 0.0532 R² = 0.9904 Độ hấp thụ Abs 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Nồng độ acid galic(mcg/ml) 10 12 Hình 3.16 Phương trình đường chuẩn gallic Nhận xét: Kết cho thấy, khoảng nồng độ – 10 mcg/ml, có mối tương quan tuyến tính nồng độ gallic độ hấp thụ quang, hệ số tương quan R2 0.9904 > 0,99 Điều chứng tỏ có tương quan tuyến tính chặt chẽ độ hấp thụ quang nồng độ chất khảo sát Do sử dụng đường chuẩn để xác định hàm lượng polyphenol cao PT cao tổng hợp 3.5.2.2 Định lượng polyphenol cao TDCM Tiến hành định lượng polyphenol loại cao TDCM trình bày mục 2.3.6.2 Kết thu bảng 3.15 Nhận xét: cao TH thuốc TDCM có hàm lượng trung bình polyphenol tồn phần 0,94% cao PT thuốc TDCM có hàm lượng trung bình 0,97% Như vậy, hàm lượng polyphenol cao đơn phối trộn cao cao tổng hợp 41 Bảng 3.15 Kết hàm lượng polyphenol cao phối hợp tổng hợp Mẫu Hàm lượng polyphenol cao PT (%) Hàm lượng polyphenol cao TH (%) 1,00 0,96 0,99 0,93 0,95 0,93 Trung bình 0,97 ± 0,03 0,94 ± 0,02 42 BÀN LUẬN 4.1 Kiểm tra chất lượng đầu vào Dựa theo mô tả phương pháp ghi DĐVN V và, nghiên cứu thực nghiệm với số tiêu quan trọng để kiểm tra tính dược liệu Hiện nay, ngành Dược cần giải số vấn đề thực tiễn cấp bách, có tình trạng nhầm lẫn giả mạo dược liệu thị trường Chính vậy, đề tài tiến hành kiểm tra tính vị thuốc thuốc Tuy nhiên, việc kiểm tra chất lượng vị thuốc theo tất tiêu DĐVN V tốn nhiều thời gian nên khuôn khổ thời gian kinh phí có hạn, chúng tơi lựa chọn số tiêu quan trọng để kiểm tra Trên sở đó, vị thuốc đảm bảo tính đúng, nhiên chất lượng mức tương đối 4.2 Về kết bào chế cao TH cao PT thuốc TDCM Về phương pháp Cao PT phương pháp phối hợp đồng dạng cao khô thành phần dược liệu công thức thuốc theo tỷ lệ định Trong đó, theo phương pháp truyền thống y học cổ truyền, thuốc thường phối hợp nồi theo tỷ lệ thuốc tính đơn giản, tiết kiệm thời gian Nước dung mơi phổ biến, có sẵn rẻ tiền đồng thời có khả hịa tan rộng Sử dụng dung môi chiết để tăng hiệu suất chiết rút ngắn thời gian chiết Trong thành phần thuốc TDCM có vị Địa Long thể chất dẻo dai, khó bẻ gãy, hạt đậu đen thể chất cứng, dân gian sử dụng thuốc sắc nước để chữa bệnh, nghiên cứu chọn bào chế theo phương pháp sắc Dựa vào thông tin trình bày chương 1, protein cho hoạt chất thuốc này, thể rõ ràng tác dụng hạ sốt, chống viêm, chống ung thư, chống oxy hóa, làm lành tế bào thần kinh,…Do đó, số thao tác trình bào chế cao giúp tăng hàm lượng protein thu Địa Long cắt nhỏ giúp tăng thấm nước vào dược liệu, nhiên nghiên cứu khơng sử dụng kích thước nhỏ bột Địa Long dễ đóng bánh, khó khăn q trình lọc, dịch chiết nhiều tạp, khó tinh chế Thành phần protein Đậu đen nằm chủ yếu phần ruột hạt, làm vỡ hạt để phá vỡ lớp vỏ bên ngoài, tăng tiếp xúc dung môi dược liệu Bột đậu đen không sử dụng khả trương nở mạnh nước, gây trào q trình chiết, làm protein đồng thời tăng tạp, gây khó khăn lọc tinh chế dịch chiết Thao tác ngâm dược liệu trước sắc giúp dung môi thấm làm trương nở tế bào, tăng trình khuếch tán chất tan tế bào dược liệu 43 Đậu đen Rau ngót trước chiết có thêm bước vàng Thao tác phù hợp với cách chế biến truyền thống thuốc TDCM Ngoài ra, theo y học đại, trình vàng làm gia tăng sức căng bề mặt dược liệu Nhờ đó, hoạt chất dễ ngồi q trình sắc thuốc Trong đậu đen, nhiệt độ nhỏ làm biến tính tinh bột, hạn chế tạp tinh bột dịch chiết thuốc Nghiên cứu số lần chiết lần để chiết nhiều hoạt chất có thể, từ giúp ích cho việc so sánh hàm lượng chất có loại cao Số lần chiết thời gian chiết tăng lên để chiết kiệt hoạt chất có dược liệu, nhiên việc tăng số lần thời gian dẫn đến tăng tạp chất chất cao, tốn dung môi thời gian để cô cạn So sánh cảm quan pH cao TH PT Về cảm quan, thể chất cao đơn phơí hợp khơ so với thể chất cao TH cao đơn thành phần sấy thời gian dài để đảm bảo độ ẩm