đề tài “Xác định tên khoa học của cây Cỏ Vòi Voi tại tỉnh Bạc Liêu bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA”. xác lập chỉ thị phân tử làm công cụ xác định dược liệu cây Cỏ Vòi Voi. Sử dụng chỉ thị hình thái mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Cỏ Vòi Voi.
LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới quanh năm nên thích hợp cho việc trồng trọt phát triển nhiều loại cỏ thuốc quý Cha ông ta hay dùng cỏ để chữa bệnh thông thường mà hay mắc phải như: nóng, sốt, ho, cảm cúm, đau bụng, đau răng, chảy máu, Và lưu truyền từ đời sang đời khác trở thành thuốc cổ truyền dân tộc Ngày với phát triển khoa học, y học đại, người sâu vào nghiên cứu loài cỏ chữa bệnh cổ truyền để tìm chất có ích phục vụ cho nhiều lĩnh vực khoa học mà đặc biệt y học Thực vật dược – làm dược liệu – nghiên cứu tương đối hồn chỉnh Nhưng khác biệt tiến hóa nguồn dược liệu (trải qua trình hình thành, sinh trưởng, phát triển hàng trăm năm) nhà khoa học giới quan tâm xác định cách xác theo thị phân tử Bên cạnh đó, số loại phát sớm thời điểm khoa học chưa tiên tiến hay địa điểm mà trình độ kỹ thuật không cao Điều dễ dẫn đến việc sai sót đánh giá tiềm chữa bệnh số Một số phát nghiên cứu sơ mặt hình thái hay chí mơ tả mơ hồ hình dáng bên ngồi Chính điều khiến số đáng có tiềm trở thành vị thuốc quý, dược liệu, lại người xem loài cỏ mọc hoang Điển Cỏ Vịi Voi (Heliotropium indicum L.) Trong nhân dân, vòi voi vị thuốc chữa tê thấp, viêm tấy, mụn nhọt, viêm họng, mẩn ngứa Nói đến Cỏ Vịi Voi, hiểu biết mơ tả theo thị hình thái trình bày từ xa xưa Đến nghiên cứu DNA dược liệu trở thành xu hướng chung nghiên cứu dược liệu Mục đích việc xác định xác lồi dược liệu vơ cần thiết, xác định xác tìm kiểm sử dụng tốt sản phẩm dược liệu Cây Cỏ Vòi Voi dùng làm dược liệu từ xưa, để tránh nhầm lẫn giả mạo Cỏ Vòi Voi trở thành dược liệu việc làm quan trọng ngành Dược Các nhà khoa học sâu xác định DNA Cỏ Vòi Voi, theo Việt Nam thành cơng Cỏ Vịi Voi làm dược liệu Cịn chiết xuất DNA Cỏ Vịi Voi hay giải trình tự gen đặc trưng làm thị phân tử chưa bắt gặp Khó khăn nhiều nguồn khác nhau: thứ nguồn tài chính; thứ hai nhu cầu; thứ ba tầm nhìn nhà nghiên cứu Cả ba cản trở phần tác động đến việc nghiên cứu thị phân tử Cỏ Vịi Voi Đến nay, việc tìm hiểu đầy đủ Cỏ Vòi Voi để đưa dược liệu thành thuốc thực phẩm chức trở thành yêu cầu tất yếu với nhà Dược học Sự phát triển vượt bậc công nghệ DNA giải trình tự gen từ cuối kỷ XX nay, trở thành cơng cụ xác kịp thời giúp xác định loài làm dược liệu khơng cịn khó khăn Chỉ thị phân tử trở thành cơng cụ xác tuyệt đối phân loại thực vật, động vật Nhiệm vụ đề tài dựa thị hình thái thị phân tử để xác định xác Cỏ Vòi Voi Đưa thị trở thành thị chính, xác định mà khơng cịn phải chờ đợi thời gian Vì lý đến thực đề tài “Xác định tên khoa học Cỏ Vòi Voi tỉnh Bạc Liêu thị hình thái giải trình tự gen DNA” Đề tài hoàn thành đảm bảo mục tiêu xác lập thị phân tử làm cơng cụ xác định dược liệu Cỏ Vịi Voi Để hồn thành mục tiêu địi hỏi nghiên cứu phải thực mục tiêu cụ thể sau đây: - Khái quát hiểu biết Cỏ Vòi Voi - Sử dụng thị hình thái mơ tả xác đặc điểm thực vật học Cỏ Vòi Voi - Xây dựng quy trình chiết xuất tinh DNA Cỏ Vịi Voi - Giải trình trình tự gen ITS Cỏ Vòi Voi làm thị phân tử CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 1.1.1 Trên giới Cây Cỏ Vòi voi sử dụng y học dân gian nước bao gồm Lào, Ấn Độ, Campuchia Philipin Cuốn sách The Useful Native Plants of Australia năm 1889 ghi lại loài tìm thấy tất vùng nhiệt đới cận nhiệt đới giới cũ Cây Cỏ Vòi voi dược liệu dùng nghiên cứu nước như: Theo De Peralta (1928, Philipp Agr., 27: 333) lá, hoa, rễ có chứa axit xyanhydric Năm 1961, số tác giả chiết từ vòi voi Gana châu Úc ancaloit gọi indixin C15H25O5N (theo J Chem Soc., 12: 5.400 - 5.463, 1961) Năm 1969, người ta phát số loài Heliotropium H lasiocarpum Fish et Mey, số ancaloit có nhân pyrolizidinn (như héliotrin, độ chảy 125-126°C, D -75° (CHC1) lasiocarpine, độ chảy 95-97°C D - 0,40) (J M Gourley et Chem Commum, 1969) có độc tính cao gan gây huỷ hoại tổ chức gan, đau bụng, ỉa chảy, xuất huyết lan tỏa gây ung thư 1.1.2 Ở Việt Nam Sau chục năm lăn lộn nghiên cứu dược liệu Năm 1960, GS.TS Đỗ Tất Lợi biên soạn sách “Những thuốc vị thuốc Việt Nam” xuất đến lần thứ 8, Trong có Cỏ Vòi Voi Trong năm 1961-1962, bệnh viện Hải Dương dùng cao rượu Vòi voi điều trị cho 856 bệnh nhân bị bong gân, tụ huyết, bầm sưng sang chấn, viêm, viêm tấy, áp xe, chín mé, viêm hạch v.v Năm 1985 Tổ chức y tế giới có khuyến cáo khơng nên dùng vịi voi làm thuốc Bộ y tế Việt Nam có thị cần thận trọng dùng vòi voi chữa bệnh 1.2 MỘT SỐ KHÁI NIỆM LIÊN QUAN 1.2.1 Khái niệm thị Để phân biệt cá thể khác loài, người ta thường dùng thị di truyền Chỉ thị di truyền tình trạng hay thuộc tính đo đếm có khả di truyền từ hệ sang hệ khác Theo Paterson cộng (Paterson ctv, 1991b), tình trạng coi thị di truyền thiết phải bảo đảm hai tiêu chuẩn: - Phải phản ánh đa hình bố mẹ - Phải truyền lại xác cho hệ sau Các thị di truyền có vai trị nghiên cứu di truyền chọn giống Chỉ thị di truyền hữu ích việc nghiên cứu thừa kế dấu hiệu di truyền biến đổi chúng quần thể, đặc biệt thị liên quan đến tính trạng sinh học có lợi cho người Những thị từ lâu cơng cụ có ích chương trinh chọn giống (Retter ctv, 1993) Dựa vào tiêu chuẩn thị di truyền, người ta phân loại thị di truyền thành thị hình thái, thị sinh hóa thị phân tử DNA 1.2.2 Chỉ thị hình thái (morphological marker) Chỉ thị hình thái loại thị mang tính chất mơ tả, nhìn thấy đo đếm được, khả ứng dụng hạn chế Mỗi thị hình thái thường kiểm sốt gen đơn lẻ (single gene), ví dụ gen quy định màu vỏ hạt, hình dạng hạt Chỉ thị hình thái thưởng dễ nhận biết dạng trội - lặn Chúng thường sử dụng q trình chọn lọc Tuy nhiên, chúng có số lượng tương đối biểu chủng phụ thuộc nhiều vào giai đoạn sinh trưởng phát triển cá thể Người ta sử dụng thị hình thái mơ tả đánh giá tài nguyên lúa từ năm đầu kỷ XX Kato ctv (1928) đề nghị phân chia lúa O saiva thành hai loài phụ Japomica Indica nhờ đặc điểm hình thái Các tác giả cịn phân biệt thêm loài phụ Javanica 1.2.3 Chỉ thị sinh hố (biochemical marker) Chỉ thị sinh hóa loại thị có chất protein, hầu hết trường hợp đa hình protein, bao gồm thị isozym loại protein dự trữ (storage proteins) Các protein khác có khối lượng phân tử điểm đăng diện khác Chúng di chuyển với tốc độ khác diện trường chiều hay hai chiều, tạo đặc điểm đặc trưng gel điện di phương pháp nhuộm Do chế phức tạp đóng mở gen giai đoạn khác trình phát triển cá thể quy định thể thị sinh hóa Bất kỳ protein có mặt thể sinh vật dù giai đoạn phát triển cá thể, sản phẩm gen Cơ chế điều khiển vật chất di truyền DNA, thông qua dịng thơng tin di truyền từ DNA —> RNA => Protein Chỉ thị protein isozym thuộc loại đồng trội, có độ tin cậy cao Đồng thời phát biến dạng khác protein Tuy nhiên, có số lượng khơng nhiều biểu chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển cá thể, khơng phản ánh xác chất di truyền tình trạng, nên thị protein isozym ứng dụng tương đối hạn chế 1.2.4 Các thị phân tử DNA (DNA markers) Chỉ thị phân tử DNA thị có chất đa hình DNA Nó dịng gen có sẵn hay dạng thơng tin trình tự lưu giữ chuyển tải tệp liệu máy tính Dựa vào người ta chia chi thị phân tử làm ba loại chính: - Chỉ thị dựa sở lai DNA (chỉ thị RFLP); - Chỉ thị dựa nguyên tắc nhân bội DNA PCR (RAPD.AFLP ); - Chỉ thị dựa sở chuỗi có trình tự lặp lại (tiểu vệ tinh, vi vệ tinh ) 1.3 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY 1.3.1 Phân loại Tên khoa học: Heliotropium indicum L (Heliotropium anisophyllum P de B.) Họ Vòi voi: Borraginaceae Bộ (ordo): Borraginales Chi (genus): Heliotropium Giới (regnum): Plantae Tên khác: Dền voi, cấu vĩ trùng, đại vĩ đạo, promoi damrey-xantui damrey (Campuchia) 1.3.2 Đặc điểm hình thái Hình – Cây Cỏ Vòi Voi https://www.dongyvietnam.org/wp-content/uploads/2020/04/hinh-anh-cayvoi-voi-chua-vay-nen.jpg 1.3.2.1 Thân Cây vòi voi loại cỏ cao từ 0,20-0,40m, thân khỏe, cứng, mang nhiều cành, thân cành có lơng Hình 1- Thân Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.2.2 Lá Lá hình trứng dài, phía cuống trịn hẹp lại, phía đầu tù, phiến dài 5- 9cm, rộng 3-5cm, hai mặt nhiều lơng, mép có cưa khơng đều, cuống có dìa phía trên, dài 3-7cm Hình 1- Lá Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.2.3 Hoa Hoa tím nhạt trắng, khơng cuống, so le, liền hàng tạo thành cụm hoa xim bọ cạp đầu cành hay kẽ Hình 1- Hoa Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.2.4 Quả Quả gồm hạch nhỏ, đỉnh đính vào nhau, phía xa cao 4mm, lên phía hẹp lại, chín tách Hình 1- Quả Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.3 Đặc điểm vi phẩu 1.3.3.1 Thân Vi phẫu gần tròn Biểu bì lớp tế bào nhỏ, mang lơng chở đơn bào ngắn hay dài lông tiết ngắn Lớp cutin mỏng có cưa thưa cạn Dưới biểu bì lớp tế bào mơ mềm khuyết, vách mỏng, kích thước nhỏ mơ mềm vỏ Kế đến 5-6 lớp mơ dày góc Mơ mềm vỏ 2-3 lớp tế bào hình trịn hay bầu dục, kích thước khơng Nội bì khơng rõ Trụ bì hóa mô cứng thành đám thân già Libe 2-gỗ thành vòng liên tục Gỗ phân bố Tế bào mơ mềm tủy hình trịn, kích thước khơng Hình 1- Vi phẩu Thân Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.3.2 Lá Gân giữa: Gân rõ, gân lồi Biểu bì tế bào xếp đặn, mang lông che chở đơn bào ngắn hay dài lơng tiết ngắn Lớp cutin mỏng có cưa cạn Dưới biểu bì mơ dày góc Tế bào mơ mềm vách mỏng, hình trịn hay bầu dục, vách uốn lượn, kích thước khơng đều, xếp chừa khuyết nhỏ Các bó libe-gỗ xếp đặn thành vòng cung; vòng cung lớn với libe dưới, gỗ trên; vòng cung với libe trên, gỗ Phiến lá: Tế bào biểu bì kích thước to tế bào biểu bì dưới, kích thước tế bào biểu bì khơng đều, tế bào to thường kéo dài thành lông che chở đơn bào ngắn hay dài, chân lông có tinh thể calci carbonat hình khối trịn Lỗ khí có biểu bì Mơ mềm giậu gồm lớp tế bào, gần gân có lớp mô mềm giậu Mô mềm khuyết tế bào phân nhánh Hình 1-7 Vi phẩu Lá Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.3.3 Rễ Bần gồm 1-2 lớp tế bào, vách tẩm bần Tế bào mơ mềm hình bầu dục theo hướng tiếp tuyến, xếp chừa khuyết nhỏ Libe tạo thành chùy tia tủy ngăn cách, tế bào gần vùng tượng tầng bị ép dẹp, vách mỏng, uốn lượn, libe xa vùng tượng tầng có vách dày Gỗ chiếm tâm, mạch gỗ to không Tia tuỷ gồm 1-4 dãy tế bào Hình 1-8 Vi phẩu Rễ Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.3.4 Hoa Hình 1-9 Hoa đồ Cây Cỏ Vịi Voi 1.3.4 Đặc điểm sinh thái - Phân bố: Cây Vòi voi có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Ngày thường mọc hoang nhiều nước nhiệt đới, phổ biến Đông Nam Á Việt Nam, Ấn Độ, Lào, Philipine, Indonesia,… Ở Việt Nam, mọc hầu hết tỉnh, trừ vùng núi cao - Khí hậu, thổ nhưỡng: Đây lồi ưa sáng, thường mọc bãi đất ẩm đường đi, nương rẫy, vườn, đất bỏ hoang, … - Thu hoạch: Cây thu hái quanh năm, mọc từ hạt vào khoảng tháng – 5, sinh trưởng mùa hè Ra hoa nhiều tàn lụi vào mùa thu để chứa nhiều dưỡng chất sản phẩm chất lượng thường người ta hay thu hoạch vào mùa hè mùa thu Người ta dùng toàn cây, hái phơi khô dùng tươi 1.4 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 1.4.1 Chiết xuất tinh DNA Toàn DNA tế bào, bao gồm tất gen vùng liên gen gọi gen Bộ gen người chứa khoảng 80.000 gen, vùng mã hóa gen chiếm khoảng 3% tồn gen Bộ gen nấm chứa khoảng 6.000 gen Bộ gen vài thực vật có nhiều trình tự lặp lại Bộ gen prokaryote nhỏ chứa nhiễm sắc thể có dạng vịng, prokaryote có gen nằm plasmid Bộ gen prokaryote khơng có intron trình tự lặp lại 10 - Bài thuốc 1: Chữa sai khớp, bong gân, sau chỉnh hình khớp Vịi voi (lá hoa) 30g, củ tỏi, muối ăn 10g Tất giã nát, đắp vào chỗ sưng tấy, băng chặt - Bài thuốc 2: Chữa vết thương phần mềm Vòi voi 50g, Sài đất 200g, Tô mộc 20g Sắc nước, ngâm rửa bên - Bài thuốc 3: Viêm phổi, mủ màng phổi 60g tươi, đun sôi nước, uống với mật ong Hoặc giã 60g – 120g tươi, lấy dịch uống với mật - Bài thuốc 4: Giảm sưng amydal Vòi voi Dùng tươi, nghiền ra, lấy dịch súc miệng - Bài thuốc 5: Chữa phong thấp, nhức mỏi, tê bại, đau khớp xương Vịi voi khơ 300g, rễ Nhàu rừng 200g, củ Bồ bồ 150g, Cỏ mực 100g Các vị hiệp chung, tán nhuyễn, vò viên hạt tiêu Mỗi lần uống 20-30 viên, ngày 2-3 lần 1.5.8 Một vài lưu ý sử dụng Trong số loài Heliotropium H lasiocarpum Fish et Mey, có độc tính cao gan gây huỷ hoại tổ chức gan, đau bụng, ỉa chảy, xuất huyết lan tỏa gây ung thư Tính chất độc thường khơng thể dùng, mà thường xuất cách âm ỉ, kéo dài, khó phát Trên sở đó, Tổ chức y tế giới có khuyến cáo khơng nên dùng vịi voi làm thuốc Bộ y tế Việt Nam (1985) có thị cần thận trọng dùng vòi voi chữa bệnh, dùng để đắp theo kinh nghiệm cổ truyền: Trong trường hợp tụ huyết, bầm tím, chấn thương, viêm tấy, áp xe, sưng vú, sưng khớp, đinh nhọt giai đoạn chưa có mủ Tuy nhiên khơng nên dùng cho người già yếu có kết nên ngừng ngay, không nên dùng lâu Tốt người bệnh không nên tự ý sử dụng thuốc có vịi voi nhà trước định từ thầy thuốc có chun mơn Y học cổ truyền 1.6 VAI TRÒ ĐỐI VỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI Cây cỏ Vòi voi biết đến loài thường mọc bãi đất ẩm đường đi, nương rẫy, vườn, đất bỏ hoang, đồng quê Việt Nam Những đặc điểm Vòi voi dễ nhận thấy, khơng q khó khăn để tìm kiếm Vịi voi Trong nhân dân người Việt Nam, Vịi voi vị thuốc có tác dụng chữa tê thấp, viêm tấy, mụn nhọt, viêm họng, mẩn ngứa, điều kinh Nó sử dụng y học dân gian nhiều nước như: Ở Indonesia, nước sắc từ dùng trị bệnh nấm Candida Tại Lào, Campuchia, người ta dùng Vòi voi sắc uống đắp trị viêm sưng tấy, bong gân, thâm tím, đụng giập, viêm họng, áp xe, thấp khớp 15 Ở Thái Lan, nước sắc phần mặt đất dùng làm thuốc hạ sốt, chống viêm, rễ trị bệnh mắt Tại Tây Phi, người ta dùng để trị chàm, chốc lở Ở Ấn Độ, dùng làm mềm da, lợi tiểu, trị vết thương, nhọt lở lợi Nước sắc chồi non trị ho, ghẻ; nước sắc rễ trị ho, sốt; nước sắc trị mày đay 16 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 - Vị trí thu mẫu : Dược liệu Cây Cỏ Vòi Voi Bạc Liêu thu thập để chiết xuất - Kinh độ : 105043’31’’ Đ - Vĩ độ : 9017’44’’B Hình – La bàn toạ độ Tiêu chuẩn chọn mẫu - Thu cỏ Vòi voi nguyên vẹn (đầy đủ thân, lá, rễ, hoa, quả,…) - Cây cịn tươi, khơng bị héo, vàng, không bị sâu, bệnh - Cây không non không già 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Cây bị sâu, bệnh héo, vàng - Cây bị khiếm khuyết hay bị hư hại phần - Cây non hay già 2.1.3 Cách bảo quản mẫu Sau thu mẫu theo tiêu chuẩn, để mẫu vào túi ni lông có nước hay thu có đất để giữ ẩm, không để bị héo Khi xử lý mẫu xong, trồng lại để tiến hành nghiên cứu tiêu chưa đạt 2.1.4 Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị - Nguyên liệu: Mẫu Cỏ Vịi Voi, thu đến ngun vẹn, khơng bị sâu, bệnh để chiết xuất phân tích DNA giải trình tự gen - Hóa chất PCR điện di: PCRMix (NEXpro, Korea), PCR 2X MasterMix, agarose tinh khiết, thuốc nhuộm GelRed, TAE 1X, Loading dye 6x, Laddeer kb phí (Thermo Scientific, USA), TE, nước tinh (nước cất lầnvà qua trùng 121ºC 20 phút) 17 - Thiết bị Điện di ATTO CORPORATION AE 7344, máy điện di gel Polyacrylamide ATTA Compact PAGE-Twin (ATTA, Nhật), máy PCR GeneAmp PCR System 2700 (Amplied Biosystem – Malaysia), máy đọc gel tia UV (BioBlockScientific, Pháp) - Cơng cụ máy xử lý Giải trình tự DNA xác định gen ITS 2.1.5 Thời gian nghiên cứu - Thời gian bắt đầu: 05/07/2023 - Thời gian kết thúc: 05/08/2023 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp thị hình thái 2.2.1.1 Đặc điểm hình thái Quan sát mơ tả hình thái bên ngồi Dựa vào PPNC thực vật Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) có cải tiến Mỗi đặc điểm thực 10 mẫu - Thân: Đo phần thân từ mặt đất đến hết chồi Ta thấy vòi voi loại cỏ cao trung bình 28.2cm, thân khỏe, cứng, mang nhiều cành, thân cành có lơng Hình – Đo Thân Cây Cỏ Vòi Voi STT Bảng – Chiều dài trung bình thân cỏ Vòi Voi Chiều dài thân (cm) Chiều dài trung bình thân (cm) 21.2 18 10 30.1 23.9 34.2 25.8 21.5 32.5 35.3 26.6 30.9 28.2 - Lá: Đo hai số: Chiều dài lá; chiều rộng Ta thấy hình trứng dài, phía cuống trịn hẹp lại, phía đầu tù, phiến dài trung bình 7.6cm, rộng 3.9cm, hai mặt nhiều lơng, mép có cưa khơng đều, cuống có dài 3-7cm Hình – Đo Lá Cây Cỏ Vòi Voi STT Bảng – Chiều dài trung bình cỏ Vòi Voi Chiều dài Chiều rộng Chiều dài Chiều rộng (cm) (cm) trung bình trung bình 19 (cm) - (cm) 9.1 5.2 8.5 4.5 7.3 4.2 8.9 4.6 8.8 4.4 6.0 3.1 7.6 3.9 8.9 4.8 5.6 2.0 7.2 4.0 10 5.3 1.9 Rễ: Đo từ phần mặt đất đến chóp rễ Ta thấy rễ cọc, dài trung bình 22.1 cm Hình 2-4 Đo Rễ Cây Cỏ Vòi Voi STT Bảng – Chiều dài trung bình rễ cỏ Vòi Voi Chiều dài rễ (cm) Chiều dài trung bình rễ (cm) 22.3 15.2 20.5 21.1 23.2 20