Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng kháng viêm của cây duối ô rô streblus ilicifolius ( vidal ) corner, moraceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ĐỖ THỊ HẰNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA CÂY DUỐI Ô RÔ STREBLUS ILICIFOLIUS (VIDAL) CORNER, MORACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ĐỖ THỊ HẰNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA CÂY DUỐI Ô RÔ STREBLUS ILICIFOLIUS (VIDAL) CORNER, MORACEAE NGÀNH : DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYÈN MÃ SỐ: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS MÃ CHÍ THÀNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các kết quả, số liệu trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Đỗ Thị Hằng TÓM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2020-2022 Ngành: Dược liệu - Dược cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA CÂY DUỐI Ô RÔ Streblus ilicifolius (Vidal) Corner, Moraceae Học viên thực hiện: Đỗ Thị Hằng Người hướng dẫn khoa học: TS Mã Chí Thành Mở đầu đặt vấn đề Cây Duối ô rô (Streblus ilicifolius) thường mọc hoang vùng đồi núi với độ cao từ 400 – 500 m, phân bố nhiều Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh khu vực Đông Nam Á Ở Việt Nam, mọc phổ biến miền Bắc, Tây Nguyên thường tạo thành quần hệ nhỏ chân thung lũng đá vơi, chân qn, gặp từ Lạng Sơn, Hồ Bình, Hà Nội, Nam Hà, Ninh Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Đồng Nai tới thành phố Hồ Chí Minh Dân gian thường sử dụng vỏ làm thuốc tiêu độc điều trị mụn nhọt Bên cạnh đó, số nghiên cứu cho thấy lồi có tác dụng dược lý tiềm kháng khuẩn ức chế enzym tyrosinase Tuy nhiên, công bố đặc điểm hình thái, giải phẫu, thành phần hóa học tác dụng sinh học cịn Đó lý thực đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng kháng viêm Duối ô rô Đối tượng Phần mặt đất loài Streblus ilicifolius thu hái Gia Lai vào tháng năm 2021 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng kháng viêm phân đoạn dòng tế bào thần kinh đệm BV2 Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng lỏng, sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển, Sephadex LH-20 phương pháp tinh chế khác để phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn có hoạt tính kháng viêm mạnh Xác định cấu trúc dựa vào phổ MS, NMR so sánh với tài liệu tham khảo Kết bàn luận Bột dược liệu (4,5 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 96%, cô thu hồi thu 470 g cao cồn toàn phần Chiết phân bố lỏng lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần, loại dung môi thu cao n-hexan (125 g), cao ethyl acetat (103 g), cao n-butanol (43 g) cao nước (180 g) Từ 30 g cao ethyl acetat kỹ thuật VLC, Sephadex, kết tinh phân đoạn thu hợp chất tinh khiết quercetin 7-O-L-rhamnosid (vincetoxicoside B), kaempferol-3-O-Lrhamnosid (afzelin), quercetin 3-O-L-rhamnosid (quercitrin), vitexin, quercetin, kaempferol3,7-O-L-dirhamnosid (kaempferitrin), quercetin-3,7-O-L-dirhamnosid, saponarin Cả cao thử nghiệm (cao toàn phần, cao n-hexan, cao EtOAc cao n-BuOH) thể hoạt tính kháng viêm, cao n-BuOH cho hoạt tính yếu Kết luận Từ cao EtOAc phân lập hợp chất Cả hợp chất lần phân lập từ loài Streblus ilicifolius Trong đó, hai hợp chất vitexin saponarin lần phân lập từ chi Streblus ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2020 – 2022 Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206 BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTI-INFLAMMATORY CONSTITUENTS FROM THE AERIAL PARTS OF STREBLUS ILICIFOLIUS (VIDAL) CORNER, MORACEAE Do Thi Hang Supervisors: Dr Ma Chi Thanh Introduction Streblus ilicifolius (Vidal) Corner is a species belonging to the Streblus genus and Moraceae family, used in traditional medicine for the treatment of antidotal and anti-inflamatory In addition, recent studies have also shown that this plant has potential pharmacological effects, such as anti-inflammation, antimicrobial activity and tyrosinase inhibitory In Vietnam, there are some records of experience and studies on the chemical composition and biological activity of this plant Therefore, this study was carried out to investigation of bioactivityguided isolation of anti-inflammatory constituents from the aerial parts of Streblus ilicifolius (Vidal) Corner, Moraceae Materials The aerial parts of Streblus ilicifolius (Vidal) Corner were collected in Gia Lai, in March 2021 Methods Screening anti-inflammatory activity of the fractions on the BV2 cells Using liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography, silica gel column chromatography and purification methods to isolate the pure compounds from potential fractions on anti-inflammatory activity Structure elucidation was based on spectroscopic methods (NMR and MS) and compared with the data on literature Results and discussion The whole plant of S ilicifolius (4.5 kg) was dried and extracted with 96% ethanol to obtain 470 g of ethanol extract The extract was diluted with water and distributed with solvents to obtain fractions: n-hexane (125 g), ethyl acetate (103 g), n-butanol (43 g), water fraction (180 g) From ethyl acetate fraction, by vacuum liquid chromatography and Sephadex LH-20 column, compounds were isolated: quercetin 7-O-L-rhamnosid (vincetoxicoside B), kaempferol-3-O-Lrhamnosid (afzelin), quercetin 3-O-L-rhamnosid (quercitrin), vitexin, quercetin, kaempferol3,7-O-L-dirhamnosid (Kaempferitrin), quercetin-3,7-O-L-dirhamnosid, saponarin The ethanol extract, n-hexane fraction, ethyl acetate fraction, and n-butanol fraction showed the potential anti-inflammatory activity In which, n-butanol fraction showed the weakest activity Conclutions Eight compounds were isolated from the ethyl acetate fraction All compounds were isolated for the first time from S ilicifolius Among them, vitexin and saponarin were isolated for the first time in the genus Streblus i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC SƠ ĐỒ vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại chi Streblus 1.1.2 Đặc điểm họ Dâu tằm (Moraceae) 1.1.3 Đặc điểm chi Streblus 1.1.4 Hóa học 1.1.5 Tác dụng sinh học loài thuộc chi Streblus 11 TỔNG QUAN VỀ LOÀI STREBLUS ILICIFOLIUS 21 1.2.1 Thực vật học 21 1.2.2 Thành phần hóa học 22 1.2.3 Tác dụng sinh học loài Streblus ilicifolius 23 TỔNG QUAN VỀ VIÊM, CHẤT KHÁNG VIÊM, CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM 24 1.3.1 Tổng quan viêm 24 1.3.2 Một số phương pháp sàng lọc tác dụng kháng viêm 28 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 2.1.1 Nguyên liệu 31 2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 31 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 33 2.2.2 Khảo sát sơ thành phần hóa học 33 2.2.3 Thử độ tinh khiết 34 2.2.4 Chiết xuất tách phân đoạn phân bố lỏng - lỏng 34 ii 2.2.5 Phân lập chất tinh khiết theo định hướng kháng viêm 34 2.2.6 Kiểm tra độ tinh khiết 35 2.2.7 Xác định cấu trúc chất phân lập 35 2.2.8 Thử tác dụng kháng viêm mơ hình ni cấy tế bào 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 39 3.1.1 Đặc điểm hình thái 39 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 40 THỬ TINH KHIẾT 46 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC 46 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 46 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 46 3.4.2 Chiết xuất, phân tách phân đoạn khảo sát hoạt tính kháng viêm 48 3.4.3 Phân lập hợp chất kiểm tra độ tinh khiết từ cao phân đoạn 57 3.4.4 Xác định cấu trúc chất phân lập 71 CHƯƠNG BÀN LUẬN 92 Đặc điểm thực vật học 92 Về thành phần hoá học 92 Về tác dụng kháng viêm 93 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 95 Kết luận 95 5.1.1 Về thực vật học sơ định tính thành phần hoá học 95 5.1.2 Về hoá học 95 5.1.3 Về tác dụng kháng viêm 96 Đề nghị 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO 97 PHỤLỤC……………………………………………………………………….105 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên Đỉnh rộng br Broad COSY Correlated Spectroscopy d Doublet DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxid EtOAc Ethyl acetate Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Single Quantum Correlation Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% sinh vật thử nghiệm J Coupling constant Hằng số ghép m Multiplet Minimum bactericidal concentration Nhiều đỉnh HMBC HSQC IC50 MBC Đỉnh đôi Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MIC Minimal inhibitory concentration MS Mass spectrometry Nồng độ nhỏ có tác dụng ức chế Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu s Singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc ký lớp mỏng t Triplet TLTK Đỉnh ba Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV VLC VS δ Ultraviolet Vacuum liquid chromatography Vanillin sulfuric Tử ngoại Sắc ký cột chân khơng Độ dời hóa học iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số loài chi Streblus Bảng 3.2 Kết kiểm tra độ tinh khiết dược liệu S ilicifolius 46 Bảng 3.3 Kết xác định hàm lượng chất chiết dược liệu S ilicifolius 46 Bảng 3.4 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật 47 Bảng 3.5 Tỷ lệ sống tế bào phân đoạn cao thử 50 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm ức chế sinh NO 51 Bảng 3.7 Các phân đoạn thu từ cột VLC cao E 56 Bảng 3.8 Khối lượng phân đoạn tách từ phân đoạn E3 58 Bảng 3.9 Khối lượng phân đoạn tách từ phân đoạn E3.2 60 Bảng 3.10 Khối lượng phân đoạn tách từ phân đoạn E4 62 Bảng 3.11 Khối lượng phân đoạn phân tách từ E4.4 63 Bảng 3.12 Khối lượng phân đoạn tách từ phân đoạn E5 65 Bảng 3.13 Khối lượng phân đoạn tách từ phân đoạn E5.3 66 Bảng 3.14 Khối lượng phân đoạn tách từ phân đoạn E10 68 Bảng 3.15 Khối lượng phân đoạn tách từ phân đoạn E10.4 69 Bảng 3.16 Bảng so sánh phổ NMR SIE1 Quercetin-7-O-αL-rhamnosid 71 Bảng 3.17 Bảng so sánh phổ NMR SIE2 Afzelin 73 Bảng 3.18 Bảng so sánh phổ NMR SIE3 Quercitrin 75 Bảng 3.19 Bảng so sánh phổ NMR SIE4 Vitexin 78 Bảng 3.20 Bảng so sánh phổ NMR SIE5 quercetin 80 Bảng 3.21 Bảng so sánh phổ NMR SIE6 Kaempferitrin 82 Bảng 3.22 Bảng so sánh phổ NMR SIE7 Quercetin 3,7-OαLdirhamnopyranosid 84 Bảng 3.23 Bảng so sánh phổ NMR SIE8 Saponarin 86 Bảng 3.24 Giá trị phổ 13C-CPD ( ppm; 100 MHz) hợp chất phân lập 88 Bảng 3.25 Giá trị phổ 1H-CPD ( ppm; 100 MHz) hợp chất phân lập 89 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các lồi thuộc chi Streblus A: S asper, B: S ilicifolius, C: S indicus, D: S zeylanicus Hình 1.2 Một số cấu trúc glycosid tim chi streblus Hình 1.3 Một số cấu trúc lignan chi Streblus Hình 1.4 Một số cấu trúc flavonoid chi Streblus Hình 1.5 Cấu trúc hố học số hợp chất phân lập từ loài S ilicifolius 23 Hình 3.6 Lồi Streblus ilicifolius (Vidal) Corner mọc ngồi tự nhiên 39 Hình 3.7 Đặc điểm hình thái lồi Streblus ilicifolius (Vidal) Corner 39 Hình 3.8 Cấu tạo giải phẫu thân S ilicifolius (Vidal) Corner 41 Hình 3.9 Cấu tạo giải phẫu vùng gân Streblus ilicifolius 43 Hình 3.10 Cấu tạo giải phẫu cuống Streblus ilicifolius (Vidal) Corner 44 Hình 3.11 Cấu tạo giải phẫu phiến Streblus ilicifolius (Vidal) Corner 44 Hình 3.12 Đặc điểm bột dược liệu phần mặt đất thân Duối ô rơ 46 Hình 3.13 Sắc ký đồ cao phân đoạn Duối ô rô – Streblus ilicifolius 49 Hình 3.14 Thử nghiệm đánh giá khả sống sót tế bào cao chiết 51 Hình 3.15 Kết hoạt tính ức chế sinh NO cao chiết tế bào BV2 kích thích viêm LPS 52 Hình 3.16 Kết đánh giá hoạt tính ức chế protein COX2 cao chiết tế bào BV2 kích thích viêm LPS 53 Hình 3.17 Kết đánh giá hoạt tính ức chế protein iNOS cao chiết tế bào BV2 kích thích viêm LPS 54 Hình 3.18 SKLM khảo sát hệ dung môi khai triển cao E 55 Hình 3.19 Sắc ký đồ cao phân đoạn cao E SKLM 57 Hình 3.20 Sắc ký đồ phân tách phân đoạn E3 59 Hình 3.21 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết SKLM E3.4 59 Hình 3.22 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết SKLM SIE2 SIE3 61 Hình 3.23 Sắc ký đồ phân tách phân đoạn E4 63 Hình 3.24 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết SKLM SIE4 63 Hình 3.25 Sắc ký đồ phân đoạn phân tách từ E4.4 64 Hình 3.26 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết SKLM SIE5 64 Hình 3.27 Sắc ký đồ phân tách phân đoạn E5 66 Hình 3.28 Sắc ký đồ phân tách phân đoạn E5.3 66