1 ĐĂṬ VẤN ĐỀ Những năm gần đây, xu hướng sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược tự nhiên ngày càng nhiều, không chỉ ở các nước Á Đông mà còn ở các nước phương Tây do tác dụng phụ của thuốc tổn.
ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược tự nhiên ngày nhiều, không nước Á Đơng mà cịn nước phương Tây tác dụng phụ thuốc tổng hợp hóa dược Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao, có khoảng 4000 lồi sử dụng làm thuốc y học cổ truyền Mặc dù nước ta có nguồn dược liệu dồi dào, nhiên việc khai thác tiềm thuốc hạn chế, phần nhiều thuốc chưa nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý thực nghiệm, từ đưa dẫn chứng khoa học cho việc nghiên cứu phát triển sản phẩm, thuốc theo hướng đại Ðan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) thuốc quý di thực vào Việt Nam từ Trung Quốc vào năm 1960 Hiện nay, nước ta trồng nhiều sinh trưởng tốt vùng Tây Bắc [1-4] Rễ Đan sâm sử dụng rộng rãi y học cổ truyền Trung Quốc Nhật Bản để điều trị bệnh tim mạch, giúp tăng cường tuần hoàn máu [5-8] Các nghiên cứu dược lý công bố Đan sâm nước chủ yếu theo hướng chứng minh công dụng y học cổ truyền Gần tác dụng chống ung thư Đan sâm, đặc biệt thành phần Tan (Tanshinon) phát thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học Dược liệu nói chung Đan sâm nói riêng sinh trưởng phát triển môi trường thổ nhưỡng khí hậu khác thành phần hóa học tác dụng sinh học có khác biệt Cho đến nước có báo cáo thành phần hóa học đặc biệt hoạt tính chống ung thư dược liệu Đan sâm Nhằm cung cấp sở khoa học chứng minh tác dụng chống ung thư Đan sâm tìm kiếm hoạt chất có tác dụng chống ung thư từ nguồn dược liệu Đan sâm trồng Việt Nam, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng kháng số dòng tế bào ung thư rễ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), họ Hoa môi (Lamiaceae)” với 02 mục tiêu sau: Xác định cấu trúc hóa học số hợp chất hàm lượng Tanshinon rễ Đan sâm Đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro cao chiết hợp chất phân lập từ rễ Đan sâm Để đa ̣t đươ ̣c 02 mu ̣c tiêu trên, luận án tiế n hành với các nô ̣i dung sau: Thẩm định tên khoa học mẫu nghiên cứu - Thu hái mẫu nghiên cứu - Mô tả đă ̣c điể m hin ̀ h thái, phân tić h đă ̣c điể m của quan sinh sản (hoa, quả, hạt) để thẩm đinh ̣ tên khoa ho ̣c của mẫu Đan sâm nghiên cứu Nghiên cứu về hóa học - Chiế t xuấ t, phân lâ ̣p và xác định cấ u trúc hơ ̣p chấ t từ rễ Đan sâm - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời số Tan rễ Đan sâm Nghiên cứu về tác dụng chống ung thư - Đánh giá tác dụng ức chế phát triển số dòng tế bào ung thư - Nghiên cứu chế gây chết tế bào theo chương trình + Nghiên cứu chế gây chết tế bào theo chương trình cấp độ tế bào + Nghiên cứu chế gây chết tế bào theo chương trình cấp độ phân tử CHƯƠNG TỞNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CỦA CÂY ĐAN SÂM 1.1.1 Vị trí phân loại Đan sâm cịn gọi đơn sâm, huyết sâm, xích sâm Về phân loại, lồi thuộc chi Hoa xôn (Salvia), họ Hoa môi (Lamiaceae), Hoa môi (Lamiales), phân lớp Hoa môi (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới Thực vâ ̣t (Plantae) [1-6] Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae) Bộ: Hoa môi (Lamiales) Họ: Hoa môi (Lamiaceae) Chi: Hoa xôn (Salvia) Họ Hoa môi hay Bạc hà (Lamiaceae) họ thực vật lớn Hoa môi (Lamiales) với khoảng 250 chi 7000 loài [9] Tên gọi nguyên gốc họ Labiatae, hoa chúng có cánh hoa hợp thành mơi môi [10], [11] Tuy nhiên, tên gọi "Lamiaceae" sử dụng rộng rãi nói họ Họ Hoa môi chia làm 07 phân họ bao gồm Ajugoideae, Lamioideae, Nepetoideae, Prostantheroideae, Scutellarioideae, Symphorematoideae Viticoideae [9], [10] Các chi lớn thuộc họ Salvia, Scutellaria, Stachys, Plectranthus, Hyptis, Teucrium, Thymus, Vitex, Nepeta Ở Việt Nam phát 40 chi khoảng 145 lồi thuộc họ Hoa mơi (Lamiaceae) [6] Chi Salvia chi thực vật lớn họ Lamiaceae, với khoảng 900 loài phân bố khắp nơi giới [12] Chi thuộc phân họ Nepetoideae Ở Việt Nam tìm thấy 08 lồi thuộc chi Salvia với tên gọi Xôn bao gồm S coccinea (Xôn đỏ), S eberhardtii (Xôn eberhardt), S farinacea (Xôn xanh), S miltiorrhiza (Xôn củ, Đan sâm), S plebeia (Xôn dại), S scapiformis (Xôn cuống dài), S sonchifolia (Xôn hai hoa) S splendens (Hoa xôn) [6] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Đan sâm cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, tồn thân mang lơng ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vng có gân dọc Lá kép, mọc đối 3-5 chét, đặc biệt có Lá chét mọc thường lớn Lá kép có cuống dài, cuống chét ngắn có dìa Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm Mép chét có cưa tù Mặt chét màu xanh, có lơng mềm màu trắng, mặt màu xanh tro, có lơng dài Gân mặt dưới, chia phiến thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc thành chùm đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, vòng 3-10 hoa, thường hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, mơi, mơi trơng nghiêng hình lưỡi liềm, mơi xẻ thùy, thùy có cưa trịn Hai nhị mơi dưới, bầu có vịi dài lịi môi Quả nhỏ, dài mm, rộng 1,5 mm [1] , [3], [4] Hình 1.1 Hình ảnh Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) (A) dược liệu rễ Đan sâm (B) (Nguồn Internert) 1.1.3 Phân bố sinh thái Cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) phân bố rộng rãi Trung Quốc (nhiều tỉnh Tứ Xun), ngồi cịn có Nhật Bản, Triều Tiên [1], [3] Về nguồn gốc, Đan sâm không phân bố tự nhiên Việt Nam Từ năm 1960, Việt Nam di thực giống Đan sâm từ Trung Quốc trồng nhiều nơi có khí hậu thích hợp, thường nơi có đất cát ẩm, khí hậu lạnh [3] Ở Việt Nam, Đan sâm trồng số tỉnh đồng trung du Bắc Bộ Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Phú Thọ, Thanh Hóa…[1], [7] Kết nghiên cứu Viện Dược liệu cho thấy, suất dược liệu Đan sâm trồng vùng đồng (Hà Nội, Phú Thọ) cao so với vùng núi cao (Sa Pa, Tam Đảo) Thời gian sinh trưởng trung bình Đan sâm vùng đồng 240 ngày vùng núi 330 ngày [7], [8] Đan sâm nhân giống rễ củ, trồng tốt vào tháng 2-3 [3], [4] Mùa hoa từ tháng 5-8, mùa tháng 7-10 Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [1], [4] 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐAN SÂM Thành phần hóa học Đan sâm chủ yếu công bố nhà khoa học Trung Quốc Nhật Bản Cho đến nay, có khoảng gần 200 hợp chất tìm thấy thành phần hóa học lồi Salvia miltiorrhiza Các hợp chất phân lập xác định bao gồm diterpenoid thân dầu, acid phenolic thân nước, nhóm hợp chất khác tinh dầu Ngoại trừ thành phần tinh dầu tìm thấy hoa, hợp chất lại phân lập từ rễ (bộ phận sử dụng làm thuốc Đan sâm) 1.2.1 Các hợp chất diterpenoid Diterpenoid hợp chất có khung 20 carbon cấu trúc Đây nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học bật dược liệu Đan sâm [13-15] Dựa vào đặc điểm cấu trúc, diterpenoid phân lập từ Đan sâm chia thành 03 phân nhóm bao gồm hợp chất tanshinon có nhóm mang màu ortho-naphthoquinon (Phân nhóm 1), hợp chất abietan diterpenoid có nhóm mang màu para-naphthoquinon (Phân nhóm 2), hợp chất diterpenoid khác (Phân nhóm 3) [13], [16] Các hợp chất thuộc phân nhóm phân nhóm (Các hợp chất diterpenoid quinon) diterpenoid tìm thấy thành phần hóa học lồi thuộc chi Salvia [13], [17] Trong số hợp chất diterpenoid, tanshinon IIA (9) thành phần có nhiều nghiên cứu dược lý hợp chất báo cáo Con đường sinh tổng hợp hợp chất tanshinon từ Đan sâm chứng minh thông qua đường mevalonat methylerythritol phosphat [13], [16], [18] Tên cấu trúc diterpenoid phân lập từ Đan sâm trình bày Bảng 1.1 Hình 1.2-1.4 Bảng 1.1 Các hợp chất diterpenoid phân lập từ Đan sâm TT Tên chất Tài liệu Phân nhóm 1 Miltiron (1) [19] 7β-hydroxy-8,13-abietadien-11,12-dion (2) [20] 4-methylenemiltiron (3) [20] 2-isopropyl-8-methylphenanthren-3,4-dion (4) [13] Methylenedihydrotanshinquinon (5) [20] 1,2,5,6-tetrahydrotanshinon I (6) [20] Methylentanshiquinon (7) [16] 3-hydroxymethylentanshinquinon (8) [16] Tanshinon IIA (9) [13], [21], 10 Tanshindiol A (10) [22] 11 Tanshindiol B (11) [22] 12 Tanshindiol C (12) [22] 13 3α-hydroxytanshinon IIA (13) [22] 14 Tanshinon IIB (14) [23] 15 Methyl tanshinonat (15) [24] 16 Tanshinaldehyd (16) [24] 17 Nortanshinon (17) [22] 18 15,16-dihydrotanshinon I (18) [21] 19 Tanshinon I (19) [21] 20 Formyltanshinon (20) [20] 21 Tanshinol A (21) [25] 22 Przewaquinon B (22) [26] 23 Cryptotanshinon (23) [21] 24 Isotanshinon II (24) [13] 25 Przewaquinon A (25) [26] 26 Hydroxytanshinon IIA (26) [24] 27 Przewaquinon C (27) [24] 28 Trijuganon C (28) [13] 29 1,2-dihydortanshinquinon (29) [13] 30 1,2-dihydrotanshinquinon (30) [27] 31 Dihydronortanshinon (31) [28] 32 1,2-didehydromiltiron (32) [20] 33 Dihydroisotanshinon II (33) [29] 34 1-dehydrotanshinon ⅡA (34) [16] 35 1-dehydromiltiron (35) [20] 36 Tanshinon Ⅴ (36) [13] 37 Neo-przewaquinon A (37) [13] 38 Saprorthoquinon (38) [13] 39 Salviadionether (39) [30] 40 R-(+)-salmiltiorin E (40) [30] 41 R-(+)-grandifolia D (41) [30] Phân nhóm 42 Danshenxinkun F (42) [30] 43 Danshenxinkun G (43) [30] 44 Neodanshenxinkun A (44) [30] 45 Neocryptotanshinon II (45) [31] 46 Danshenxinkun B (46) [21] 47 (−)-Danshexinkun A (47) [32] 48 Oleoyl neocryptotanshinon (48) [33] 49 Miltionone I (49) [27] 50 Oleoyl danshenxinkun A (50) [33] 51 Dihydroisotanshinon I (51) [21] 52 Isotanshinon I (52) [13] 53 Isototanshinon (53) [16] 54 1-ketoisocryptotanshinon (54) [13] 55 Neocryptotanshinon (55) [34] 56 Isotanshinon IIA (56) [35] 57 Isotanshinon IIB (57) [34] 58 Isocryptotanshion II (58) [35] 59 Danshexinkun C (59) [36] 60 Danshexinkun D (60) [37] 61 Sibiriquinon A (61) [38] 62 Sibiriquinon B (62) [38] 63 Trijuganon A (63) [13] Phân nhóm 64 Ferruginol (64) [21] 65 Sugiol (65) [21] 66 6,12-dihydroxyabieta-5,8,11,13-tetraen-7-on (Montbretol) (66) [13] 67 11,12-dihydroxy-20-nor-5(10),6,8,11,13-abietapentaen-1on (67) [20] 68 Neotanshinlacton (68) [13] 69 Salvianan (69) [39] 70 Neosalvianen (70) [39] 71 Salvianen (71) [39] 72 Salviadion (72) [39] 73 Salviamin G (73) [40] 74 Microstegiol (74) [41] 75 epi-cryptoacetalide (75) [42] 76 Cryptoacetalide (76) [42] 77 Epi-danshenspiroketallacton (77) [22] 78 Danshenspiroketallacton (78) [21] 79 9-isopropyl-2,2,5-trimethyl-8H-phenaleno[1,9bc]furan8-on (salvilenon) (79) [43] 80 Miltipolon (80) [13] 81 Salviacoccin (81) [41] 82 Sclareol (82) [41] 83 Salviolon (83) [13] 84 Tanshinlacton (84) [20] 85 Salvilenon (85) [43] 86 Miltionon II (86) [27] 87 Danshenol A (87) [22] 88 Danshenol B (88) [22] 89 Acid salvianolacton E (89) [30] 90 Acid salvianolacton F (90) [30] 91 Normiltioan B (91) [30] 92 Salprzelacton B (92) [30] 93 Salprzelacton C (93) [30] 94 Salvianone este A (94) [30] 95 Salvianone este B (95) [30] 96 Acid tanshinoic A (96) [44] 97 Acid tanshinoic B (97) [44] 98 Acid tanshinoic C (98) [44] 99 Acid 4-methyl-9-(ethoxycarbonyl)-8-naphthoic (99) [40] Hình 1.2 Cấu trúc hóa học hợp chất tanshinon có nhóm mang màu ortho-naphthoquinon từ Đan sâm 10 µM [134] Dihydrotanshinon I có khả gây chết tế bào ung thư theo chương trình apoptosis số dịng tế bào K562, K562/ADR, HL-60, 143B, DU145, MGC803, SGC7901, HCT116, HepG2 Cơ chế xác định thông qua điều chỉnh protein Bcl-2 kích hoạt caspase [134], [135] Ngồi ra, kích hoạt JNK1/2 p38MAPK sản sinh gốc oxy hóa hoạt động đóng vai trò quan trọng gây chết tế bào ung thư theo chương trình dihydrotanshinon I Bên cạnh tác dụng chống ung thư, hợp chất cịn chứng minh có tác dụng chống viêm, bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan, chống lại bệnh Alzheimer [134] Trijuganon C (2) Hợp chất trijuganon C (2) diterpenoid khung abietan Hợp chất lần phân lập từ loài Salvia trijuga vào năm 1991 nhà khoa học Trung Quốc [112] Cho đến nay, trijuganon C tìm thấy 02 lồi chi Salvia S trijuga S miltiorhiza [13] Về cấu trúc hóa học, trijuganon C gần giống với cryptotanshinon (4) với nhóm chức este C-19 thay nhóm CH3 Cho đến chưa có cơng bố tác dụng sinh học hợp chất báo cáo Trijuganon B (3) Cũng giống chất số 2, trijuganon B (3) lần phân lập từ loài Salvia trijuga Lu cộng [114] Sau đó, trijuganon B tìm thấy dược liệu Đan sâm (S miltiorhiza) So với diterpenoid Đan sâm tanshinon IIA cryptotanshinon (với 19 carbon) cấu trúc trijuganon B 01 nguyên tử carbon vị trí C-19 Theo tra cứu, chưa có nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất Cryptotanshinon (4) Cryptotanshinon (4) 03 hợp chất Tan với Tan I, Tan IIA sử dụng làm chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu Đan sâm Các nghiên cứu công bố cho thấy hợp chất thể nhiều hoạt tính sinh học, đáng ý tác dụng chống ung thư [136], [137] Các nghiên cứu chế phân tử xác định JAK2/STAT3, PI3K/AKT, NF95 κB, AMPK đường chu kỳ tế bào có liên quan đến tác dụng ức chế gây chết tế bào theo chương trình apoptosis dòng tế bào ung thư khác cryptotanshinon [136] Các chế tương tác với để ức chế tăng sinh, di xâm nhập tế bào, đồng thời gây biến đổi, tự chết, hoại tử miễn dịch tế bào [136], [137] Ngoài tác dụng chống ung thư, cryptotanshinon (4) chứng minh có tác dụng chống viêm, điều hịa miễn dịch, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch, chống rối loạn chuyển hóa [137] Tanshinon IIA (5) Tanshinon IIA (5) thành phần diterpenoid chính, dùng làm chất đối chiếu quy định tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Đan sâm Dược điển Việt Nam, Dược điển Trung Quốc, Dược điển Đài Loan nhiều nước khác [60], [138], [139] Trong Dược điển Việt Nam V, chuyên luận Đan sâm, Tan IIA quy định chất đối chiếu tiêu chí định tính định lượng [138] Theo đó, hàm lượng tanshinon IIA khơng thấp 0,2% tính theo dược liệu khơ kiệt [138] Tanshinon IIA (5) sử dụng Trung Quốc nhiều quốc gia để điều trị bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp, nhiễm trùng huyết bệnh khác [140] Tác dụng kháng u tanshinon IIA (5) gần nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Tanshinon IIA chứng minh có tác dụng ức chế phát triển nhiều dòng tế bào ung thư ung thư phổi, ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư biểu mô dày, ung thư đại trực tràng, u thần kinh đệm, u xương, ung thư cổ tử cung, ung thư buồng trứng, ung thư vú ung thư tuyến tiền liệt [140], [141] Tanshinon IIA gây tượng tự chết theo chương trình, ức chế phát triển di chuyển tế bào, ức chế hình thành mạch đảo ngược MDR khối u cách kích hoạt AMPK, ức chế đường tín hiệu PI3K/Akt/mTOR, kích hoạt caspase [140], [142], [143] Ngoài tác dụng liệt kê, Tanshinon IIA chứng minh có tác dụng chống viêm, chống ơxy hóa, điều hịa miễn dịch…[142], [143] 96 Tanshinon I (6) Về cấu trúc hóa học, tanshinon I (6) có 18 carbon giống với hợp chất trijuganon B (3) Tanshinon I thành phần diterpenoid dược liệu Đan sâm [13] Về tác dụng tế bào ung thư, tanshinon I thể hoạt tính gây độc nhiều dịng tế bào ung thư bao gồm ruột kết, dày, vú gan, tuyến tiền liệt, phổi máu [13], [16] Cơ chế gây chết tế bào theo chương trình tanshinon I chứng minh thơng qua kích thích protein p53, p21, Bax, giảm biểu protein Bcl-2, hoạt hóa enzym caspase-3, ức chế tín hiệu PI3K/Akt [13], [16] Nghiên cứu khả chống ung thư phổi in vivo chuột nhắt tanshinon I có khả làm chậm phát triển khối u mức liều 150 mg/kg 200 mg/kg [13] Acid 7β,24-dihydroxy ursolic (7) Hợp chất acid 7β,24-dihydroxy ursolic (7), triterpen 05 vòng khung ursan Hợp chất lần phân lập từ loài Saurauja roxburghii, Họ Dương đào (Actinidiaceae) vào năm 2011 nhà khoa học Đại học Osaka, Nhật Bản vào năm 2011 [116] Trong nghiên cứu tác dụng độc tế bào 02 dòng ung thư thần kinh đệm chuột C6 ung thư biểu mô biểu mô người A431, hợp chất tác dụng [116] Cho đến có nhiều triterpenoid khung usan phân lập từ chi Salvia, nhiên báo cáo có mặt hợp chất 7β,24-dihydroxy ursolic (7) thành phần hóa học 01 lồi Salvia Acid 24-hydroxy corosolic (8) Giống chất số 7, acid 24-hydroxy corosolic (8) dẫn xuất acid ursolic với hai nhóm hydroxyl vị trí C-2 C-24 Hợp chất lần nhà khoa học Đại học Y dược Toyama tìm thấy từ cành loài Hedyotis lawsoniae, họ Cà phê (Rubiaceae) vào năm 1984 [119] Sau đó, hợp chất dược tìm thấy số lồi thuộc chi Actinidia [118], loài Parthenocissus tricuspidata [144] Đây lần acid 24hydroxy corosolic phân lập từ loài thuộc chi Salvia Acid ursolic (9) 97 Acid ursolic hợp chất triterpen khung ursan, lần tìm thấy năm 1920 táo [145] Đây hợp chất phổ biến rau, nhiều loài thực vật Tác dụng sinh học acid ursolic nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu Theo đó, acid ursolic chứng minh có tác dụng kháng u nhiều dịng tế bào ung thư thử nghiệm in vivo in vitro, tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống đái tháo đường, bảo vệ gan, hạ mỡ máu, bệnh tim mạch…[145], [146] Acid ursolic phân lập từ Đan sâm nghiên cứu trước [16] Acid oleanolic (10) Cũng giống hợp chất acid ursolic (9), acid oleanolic triterpen phổ biến tìm thấy khoảng 1620 lồi thực vật Đây hợp chất đặc trưng loài thực vật thuộc họ Ô liu (Oleaceae) Tên gọi acid oleanolic đặt theo tên lồi liu (Olea europaea) [147] Đây triterpen khung olean có cơng thức phân tử C30H48O3 (M=456) Trong nhiều thập kỷ qua, hợp chất sử dụng Trung Quốc để làm thuốc bảo vệ gan Hợp chất acid oleanolic chứng minh có nhiều tác dụng quý sức khỏe người bật tác dụng chống ung thư, tác dụng chống viêm, tác dụng chống oxy hóa [147], [148] Acid maslinic (11) Acid maslinic hợp chất triterpen khung olean có cơng thức phân tử C30H48O4 Hợp chất có cấu trúc gần giống với hợp chất acid oleanolic (10), khác xuất thêm nhóm OH vị trí C-2 Acid maslinic hợp chất phổ biến giới thực vật Acid maslinic lần phân lập từ loài Táo gai Crataegus oxyacantha L., họ Hoa hồng (Rosaceae) vào năm 1927 [149] Hợp chất hợp chất có liu (Olea europaea) với hàm lượng đạt khoảng 0,8% [149] Các kết nghiên cứu cho thấy, acid maslinic có nhiều tác dụng sinh học đáng ý bảo vệ tim mạch, bảo vệ thần kinh, kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, chống oxy hóa, bảo vệ gan Hợp chất chứng minh có tác dụng ức chế enzym protease HIV-1 98 với tỷ lệ ức chế 100% nồng độ 17,9 µg/mL [150] Có thể thấy rằng, acid maslinic nguồn nguyên liệu tiềm cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc chống HIV quan tâm Acid maslinic phân lập từ số loài thuộc chi Salvia S grandiflora, S menthaefolia [151] Đây báo cáo có mặt acid maslinic thành phần hóa học Đan sâm Acid asiatic (12) Acid asiatic (12), triterpenoid khung ursan phân lập lần vào năm 1999 Maquart cộng từ rau má Centella asiatica, họ Hoa tán (Apiaceae), loài thực vật phổ biến nhiều quốc gia gới [152] Tên gọi acid asiatic bắt nguồn từ tên loài Centella asiatica Ngoài rau má, acid asiatic tìm thấy thành phần hóa học khoảng 50 lồi thực vật [153] Hợp chất sinh tổng hợp thơng qua đóng vịng squalen [153] Acid asiatic báo cáo có nhiều hoạt tính dược lý đáng ý chống ơxy hóa, chống viêm, điều chỉnh q trình apoptosis, thứ mang lại hiệu điều trị nhiều bệnh lý khác [152], [153] Hợp chất chứng minh có tác dụng hạ huyết áp, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch, kháng khuẩn kháng u mạnh nghiên cứu tiền lâm sàng Trong nghiên cứu in vitro in vivo, acid asiatic báo cáo có ảnh hưởng đến nhiều enzym, thụ thể, yếu tố tăng trưởng, yếu tố phiên mã, protein apoptosis tín hiệu tế bào [153] Đây lần acid asiatic phân lập từ Đan sâm Iriflophenon 2-O-α-L-rhamnopyranosid (13) Iriflophenon 2-O-α-L-rhamnopyranosid (13) dẫn xuất benzophenonO-glycosid phân lập lần từ loài Davallia solida, họ Davalliaceae Rancon cộng vào năm 2001 [126] Iriflophenon 2-O-α-Lrhamnopyranosid (13) số dẫn xuất benzophenon glycosid báo cáo có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư Feng J cộng năm 2011 nghiên cứu phân lập hoạt chất có khả ức chế enzym α-glucosidase từ loài Aquilaria sinensis, họ Trầm 99 Theo đó, iriflophenon 2-O-α-L- rhamnopyranosid (13) thể tác dụng ức chế tốt mơ hình khảo nghiệm với giá trị IC50 366,7 µM (mạnh chất đối chứng dương acarbose IC50= 576,2 µM) [154] Đây lần iriflophenon 2-O-α-L-rhamnopyranosid (13) phân lập từ loài thuộc chi Salvia Acid rosmarinic (14) Acid rosmarinic (14), dẫn xuất este của acid caffeic acid 3,4dihydroxyphenyl lactic, phân lập lần vào năm 1958 từ lồi Rosmarinus officinalis, họ Hoa mơi (Lamiaceae) [155] Tên gọi acid rosmarinic đặt theo tên loài Rosmarinus officinalis Đây hợp chất phổ biến thực vật, tìm thấy nhiều lồi thuộc họ Boraginaceae họ Lamiaceae [155], [156] Acid rosmarinic báo cáo có nhiều tác dụng sinh học đáng ý chống ơxy hóa, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan, chống đái tháo đường, chống ung thư kháng viêm Tác dụng chống viêm acid rosmarinic chứng minh qua nghiên cứu in vitro in vivo nhiều mơ hình gây viêm khác viêm khớp, viêm đại tràng viêm da dị ứng [156], [157] Acid rosmarinic tìm thấy thành phần hóa học dược liệu Đan sâm Methyl rosmarinat (15) Ethyl rosmarinat (16) Các hợp chất methyl rosmarinat (15) ethyl rosmarinat (16) dẫn xuất methyl este ethyl este acid rosmarinic (14) Methyl rosmarinat (15) phân lập từ rễ Đan sâm lần acid rosmarinic vào năm 1989 [16], ethyl rosmarinat (16) chưa công bố từ Đan sâm thực nghiên cứu luân án Ethyl salvianolat A (17) Ethyl salvianolat A (17) dẫn xuất ethyl este acid salvianolic A Acid salvianolic A phân lập lần từ Đan sâm Li L cộng vào năm 1984 xác định thành phần acid phenolic thân nước bên cạnh acid salvianolic B dược liệu Đan sâm [47] Acid salvianolic A chứng minh có số tác dụng sinh học, đáng ý tác dụng chống ung thư với khả ức chế nhiều đường tín hiệu [158] Ethyl salvianolat A 100 (17) phân lập lần từ rễ loài khác thuộc chi Salvia S yunnanensis nghiên cứu Zhang ZF cộng vào năm 2008 [133] Trong nghiên cứu ethyl salvianolat A báo cáo có tác dụng ức chế số enzym HIV-1 Reverse transcriptase, Protease Integrase với giá trị IC50 56,38; 12,03; 14,54 µg/mL [133] Đây lần hợp chất ethyl salvianolat A phân lập từ dược liệu Đan sâm 4.1.2 Kết định lượng đồng thời số Tanshinon rễ Đan sâm Những kết nghiên cứu công bố cho thấy, hợp chất Tanshinon bao gồm tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) hợp chất dược liệu Đan sâm Các hợp chất chứng minh có tác dụng tăng cường tuần hồn máu, bảo vệ tim mạch, chống ung thư, chống viêm, tác dụng dược liệu Đan sâm y học cổ truyền y học đại [13], [136], [137], [142] Hàm lượng Tanshinon Đan sâm quy định Dược điển số quốc gia Tiêu chí định lượng chuyên luận Đan sâm Dược điển Trung Quốc 2010 có quy định hàm lượng tổng 03 Tanshinon bao gồm tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) dược liệu Đan sâm khơng thấp 0,25% tính theo dược liệu khô kiệt, nhiên sử dụng 01 chất chuẩn ngoại tanshinon IIA (5) [60] Dược điển Mỹ quy định hàm lượng tổng 03 Tanshinon dược liệu Đan sâm bao gồm tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) khơng 0,2%, sử dụng 01 chất chuẩn ngoại tanshinon IIA (5) Chuyên luận Đan sâm Dược điển Việt Nam Dược điển Đài Loan sử dụng tanshinon IIA (5) làm chất chuẩn tiêu chí định lượng với quy định hàm lượng tối thiểu dược liệu khô kiệt 0,2% [138], [139] Cho đến có vài nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích, đánh giá chất lượng dược liệu Đan sâm Việt Nam Các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC với detector PDA để phân tích hàm lượng tanshinon IIA (5) mẫu Đan sâm [8], [159], [160] Kết cho thấy, hàm lượng tanshinon IIA mẫu Đan sâm thu hái dao động khoảng 101 0,13-8,50 mg/g [8], [159], [160] Thời gian phân tích tanshinon IIA mẫu nghiên cứu lớn 15 phút [8], [159], [160] Theo tra cứu, chưa có nghiên cứu phân tích định lượng đồng thời 03 hoạt chất Tanshinon tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) dược liệu Đan sâm thu hái Việt Nam báo cáo Do đó, xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng 03 Tanshinon chính, từ đánh giá chất lượng dược liệu Đan sâm cần thiết Trong nghiên cứu này, tiến hành tham khảo điều kiện phân tích cơng bố, khảo sát số điều kiện phân tích HPLC tốc độ rửa giải, hệ dung mơi chương trình dung mơi rửa giải theo điều kiện thực tế để xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 03 hợp chất tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) mẫu dược liệu Đan sâm (Mục 2.2.2.4) Phương pháp phân tích thẩm định đạt yêu cầu khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, độ xác, tính đặc hiệu phù hợp để định lượng 03 hợp chất tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) dược liệu Đan sâm Phương pháp xây dựng đơn giản, nhanh (thời gian phân tích cho mẫu < 15 phút), dễ thực hiện, áp dụng nhiều đơn vị kiểm nghiệm để đánh giá chất lượng dược liệu Đan sâm chế phẩm từ Đan sâm thị trường Ngoài ra, luận án chúng tơi áp dụng quy trình xây dựng để phân tích, định lượng đồng thời tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) số mẫu dược liệu Đan sâm thu hái Trung Quốc Việt Nam Kết bảng 3.18 cho thấy, có khác hàm lượng Tanshinon mẫu nghiên cứu Mẫu thu hái Hà Giang có hàm lượng 03 diterpenoid cao mẫu nghiên cứu với hàm lượng tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) 1,023; 2,385; 1,199 mg/g Mẫu Đan sâm Trung Quốc có hàm lượng diterpenoid thấp so với mẫu thu hái Việt Nam Có 02 mẫu Đan sâm thu hái Hà Giang Lâm Đồng có hàm lượng tanshinon IIA 2,385 mg/g 2,116 mg/g, đạt yêu cầu theo Dược điển Việt Nam V [138] Hàm lượng tổng 03 tanshinon 102 mẫu Đan sâm (Bảng 3.18) thu hái Việt Nam lớn 0,25% (đạt yêu cầu theo Dược điển Trung Quốc Dược điển Mỹ) Do điều kiện nên nghiên cứu này, tiến hành định lượng mẫu Đan sâm thu hái 04 địa phương bao gồm Sa Pa, Hà Giang, Lai Châu, Lâm Đồng 01 mẫu Đan sâm Trung Quốc Cần có thêm nghiên cứu, thu hái định lượng nhiều mẫu Đan sâm nhiều vùng nữa, từ đánh giá xác chất lượng dược liệu Đan sâm địa phương Các kết nghiên cứu luận án tạo sở khoa học, góp phần gợi ý cho việc nâng cấp chuyên luận Đan sâm Dược điển Việt Nam sau 4.2 VỀ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ Trên giới Việt Nam, bệnh ung thư gia tăng nhanh chóng Mỗi năm nước có khoảng 200.000 ca ung thư mới, có 75.000 ca tử vong khiến Việt Nam trở thành quốc gia có tỷ lệ ung thư mức báo động Các loại ung thư thường gặp ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vú, ung thư dày, ung thư máu,…Số trường hợp mắc ung thu máu ngày tăng, đặc biệt người trẻ tuổi trẻ em (chiếm 30% thể ung thư) [161] Trong phương pháp điều trị ung thư, phương pháp hóa trị liệu đóng vai trị chủ yếu Nhiều thuốc điều trị ung thư nghiên cứu đưa vào sử dụng Từ năm cuối kỷ 20, nghiên cứu tập trung vào thuốc tác dụng chọn lọc mức độ phân tử Trong phương pháp nghiên cứu hoạt chất chống ung thư theo chế chết rụng tế bào ung thư apoptosis mang lại kết quan trọng Một số hoạt chất theo hướng nghiên cứu này, có chất có nguồn gốc tự nhiên đưa vào điều trị [162], [163] Trong y học cổ truyền, Đan sâm dùng thuốc bổ máu điều trị bệnh tim mạch Gần tác dụng chống ung thư Đan sâm, đặc biệt thành phần Tan phát thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học [13], [16] Trong nghiên cứu này, tiến hành sàng lọc, đánh giá tác dụng kháng u cao chiết từ dược liệu Đan sâm dòng tế bào ung thư máu HL-60 Kết nghiên cứu rằng, cao chiết phân đoạn Hex có tác dụng tốt nhất, sau đến cao tổng EtOH (Hình 3.26) Các báo cáo 103 công bố cho thấy, hợp chất Tanshinon thân dầu tập trung chủ yếu phân đoạn Hex Đan sâm Các hợp chất Tanshinon Đan sâm chứng minh có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư máu HL-60 [134], [135], [140] Do đó, tác dụng tốt cao phân đoạn Hex thành phần mang lại Kết sàng lọc bước đầu giúp định hướng cho trình phân lập theo hoạt tính sinh học Tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh 03 dòng tế bào ung thư máu bao gồm HL-60, Jurkat U937 06 hợp chất Tanshinon (1-6) (các hợp chất phân lập từ phân đoạn Hex có tác dụng tốt nhất) Ngoại trừ chất số 1, hợp chất 2-6 thể tác dụng tốt dòng tế bào thử nghiệm (Hình 3.27 Bảng 3.19) Từ cấu trúc hợp chất Tan kết thử hoạt tính kháng u đưa số đặc điểm liên quan cấu trúc tác dụng sinh học sau: hoạt tính chất 1, yếu chất 2, cho thấy, vịng A bão hịa với 02 nhóm vị trí C-4 hai vịng B, C khơng bão hịa có 02 nhóm quinon vị trí ortho có tác dụng tế bào ung thư máu, đặc biệt tế bào HL60 Tác dụng chất số nhiều khác biệt với chất số có hay khơng có liên kết đơi vị trí C-15/C-16 vịng furan D khơng ảnh hưởng tới hoạt tính gây độc tế bào ung thư Trijuganon C (2) có hoạt tính mạnh 03 chất 2, cho thấy nhóm carboxylic vị trí C-4 vịng A đóng vai trị quan trọng tạo khác biệt, làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thư Sự phân tích liên quan cấu trúc tác dụng sinh học giúp định hướng tối ưu hóa cấu trúc, tổng hợp hoạt chất có tác dụng mạnh so với chất dẫn đường nghiên cứu phát triển thuốc Bên cạnh Tanshinon, hợp chất lại (7-17) đánh giá tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư máu HL-60 Kết cho thấy, hợp chất 7, 9, 10, 13, 15-17 có tác dụng mơ hình thử nghiệm với giá trị IC50 từ 8,9-26,8 µM (Bảng 3.21) Trong đó, hợp chất iriflophenon 2-O-α-Lrhamnopyranosid (13) thể tác dụng mạnh (IC50=8,9 µM) Hợp chất benzophenon-O-glycosid (13) tìm thấy lần từ loài Davallia solida, 104 họ Davalliaceae [126] Đây lần hợp chất 13 phân lập từ lồi thuộc chi Salvia Theo tra cứu, chưa có nghiên cứu tác dụng tế bào ung thư máu 13 báo cáo Đây đóng góp nghiên cứu việc tìm kiếm hoạt chất có tác dụng chống ung thư máu từ thiên nhiên Các nghiên cứu chuyên sâu cần tiến hành để tìm hiểu chế tác dụng kháng u hợp chất 13 Chất số (trijuganon C) có tác dụng ức chế tốt số Tanshinon (1-6) thử nghiệm 03 dịng tế bào ung thư máu Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tác dụng hợp chất số dòng tế bào ung thư khác tế bào thường Kết cho thấy, trijuganon C thể tác dụng mạnh trên 03 dòng tế bào ung thư đường ruột bao gồm DLD-1, COLO 205, Caco-2 (IC50 < 10 µM) Ngồi ra, hợp chất có tác dụng tốt dịng tế bào ung thư đường ruột HCT-15, ung thư tuyến tiền liệt PC-3, LNCap FGC, ung thư phổi MCF-7 Hợp chất trijuganon C (2) khơng gây độc 02 dịng tế bào thường WRL 68 NB1RGB (Bảng 3.20) Các kết nghiên cứu rằng, chất số nguyên liệu tiềm cho nghiên cứu nhiều loại ung thư khác Hợp chất trijuganon C (2) lần phân lập từ loài Salvia trijuga vào năm 1991 [112] Cho đến nay, theo tra cứu chưa có cơng bố tác dụng sinh học hợp chất báo cáo Do đó, việc tìm tác dụng kháng ung thư mạnh chất số đóng góp bật luận án Để làm rõ chế gây độc tế bào ung thư máu HL-60 hợp chất có liên quan đến chế chết rụng tế bào apoptosis hay khơng, nhóm nghiên cứu tiến hành phân tích biểu đặc trưng tế bào bao gồm phân tích hình thái học phân mảnh DNA Kết thí nghiệm cho thấy, tế bào ung thư HL-60 xử lý trijuganon C (2) dẫn đến ngưng tụ chất nhiễm sắc chromatin phân mảnh DNA (Hình 3.28) Do đó, tác dụng chống tăng sinh dòng tế bào ung thư máu HL-60 thơng qua kích thích q trình apoptosis Q trình gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trình phức tạp trải qua nhiều giai đoạn có tham gia nhiều phân tử sinh học 105 tế bào Về chế phân tử vào có hay khơng liên quan tới ty thể (mitochondria), trình apoptotis chia thành hai đường chế ngồi hay kích hoạt protein caspase chế nội hay chế ty thể [108], [109], [164] Để làm rõ chế gây chết tế bào theo chương trình apoptosis cấp độ phân tử trijuganon C (2), luận án tiến hành nghiên cứu kiểm tra tác động trijuganon C (2) protein caspase chức ti thể Kết thử nghiệm biểu protein sử dụng kĩ thuật Western blot cho thấy, trijuganon C (2) có khả hoạt hóa protein PARP caspase-3, Ngoài ra, phân mảnh DNA gây trijuganon C (2) bị triệt tiêu có mặt chất ức chế caspase (Hình 3.29) Protein caspase-3 đóng vai trị quan trọng kích hoạt q trình apoptosis, PARP protein chất nội sinh caspase‐3 Sự hoạt hóa caspase-3 cần phân cắt caspase khởi đầu bao gồm caspase-8 caspase-9 [165], [166] Như trình apoptosis tế bào gây có liên quan đến q trình hoạt hóa caspase-3, Đây thông tin quan trọng cho việc phát triển thuốc chống ung thư nghiên cứu chế tác dụng chống ung thư Ty thể đóng vai trị quan trọng với sống tế bào Chức ty thể bị suy giảm biểu quan trọng trình apoptosis Sự giải phóng protein cytochrome c từ ty thể vào dịch bào (cytosol) dẫn đến suy giảm độ bền, chức màng ty thể dẫn đến hoạt hóa caspase-9 q trình apoptosis [167], [168] Chức ty thể thay đổi dẫn đến hoạt hóa caspase-9 hoạt hóa caspase-3 theo thứ tự dẫn đến trình chết rụng apoptosis tế bào HL-60 [167], [168] Để đánh giá khả gây rối loạn chức ty thể trijuganon C (2), nhóm nghiên cứu tiến hành kiểm tra tác dụng trijuganon C (2) tới nhân tố protein cytochrome c độ bền màng ty thể Kết protein cytochrome c giải phóng khỏi ty thể tích tụ dần dịch bào theo thời gian khả thẩm thấm tế bào HL-60 bị suy giảm xử lý với trijuganon C (2) (Hình 3.30) Như trình chết rụng tế bào apoptosis gây theo hai chế bao gồm chế ngoại (kích hoạt protein caspase) chế ty thể Tổng hợp kết nghiên cứu thấy 106 rằng, hợp chất nguyên liệu tiềm cho nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư máu 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Về hóa học - Đã chiết xuất phân lập 17 hợp chất tinh khiết từ phận rễ Đan sâm Các hợp chất xác định dihydrotanshinon I (1), trijuganon C (2), trijuganon B (3), cryptotanshinon (4), tanshinon IIA (5), tanshinon I (6), acid 7β,24-dihydroxy ursolic (7), acid 24-hydroxy corosolic (8), acid ursolic (9), acid oleanolic (10), acid maslinic (11), acid asiatic (12), iriflophenon 2-O-α-L-rhamnopyranosid (13), acid rosmarinic (14), methyl rosmarinat (15), ethyl rosmarinat (16) ethyl salvianolat A (17) - Trong số 17 hợp chất, có 03 hợp chất (7-8 13) lần phân lập từ loài thuộc chi Salvia, 04 hợp chất (11, 12, 16 17) lần tìm thấy Đan sâm - Đã xây dựng phương pháp phân tích, định lượng đồng thời 03 hoạt chất Tanshinon bao gồm tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) dược liệu Đan sâm Phương pháp phân tích xây dựng đơn giản, nhanh chóng, dễ thực hiện, đạt yêu cầu khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, độ xác, tính đặc hiệu Áp dụng quy trình xây dựng để phân tích, định lượng đồng thời tanshinon I (6), tanshinon IIA (5) cryptotanshinon (4) số mẫu dược liệu Đan sâm thu hái Trung Quốc Việt Nam Về tác dụng sinh học - Cao chiết EtOH cao phân đoạn n-hexan từ rễ Đan sâm có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư máu HL-60 - Các hợp chất Tanshinon (2-6) có tác dụng ức chế 03 dòng tế bào ung thư máu bao gồm HL-60, Jurkat U937 Trong đó, hợp chất trijuganon C (2) có tác dụng ức chế mạnh với giá trị IC50 6,1; 8,9 13,4 µM - Các hợp chất 7, 9, 10, 13, 15-17 có tác dụng ức chế dịng tế bào ung thư máu HL-60 với giá trị IC50 từ 8,9-26,8 µM Trong đó, chất số 13 thể tác dụng mạnh (IC50=8,9 µM) 108 - Hợp chất thể tác dụng ức chế mạnh (IC50 < 10 µM) trên 03 dòng tế bào ung thư đường ruột bao gồm DLD-1 (IC50 6,1 µM), COLO 205 (IC50 7,2 µM), Caco-2 (IC50 8,4 µM) Ngồi ra, hợp chất có tác dụng tốt dòng tế bào ung thư đường ruột HCT-15 (IC50 13,2 µM), ung thư tuyến tiền liệt PC-3 (IC50 11,2 µM), LNCap FGC (IC50 13,7 µM), ung thư phổi MCF-7 (IC50 16,7 µM) Hợp chất trijuganon C (2) khơng gây độc 02 dịng tế bào thường WRL 68 NB1RGB - Hợp chất có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư HL-60 thơng qua kích thích q trình apoptosis - Hợp chất gây trình apoptosis theo hai chế bao gồm chế ngoại (hoạt hóa protein PARP caspase-3, 9) chế ty thể KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu chế, tác dụng gây độc tế bào ung thư hợp chất trijuganon C (2) cấp độ phân tử, nghiên cứu tác dụng chống ung thư in vivo hợp chất trijuganon C (2) - Nghiên cứu, đánh giá hàm lượng hoạt chất trijuganon C (2) dược liệu Đan sâm trồng Việt Nam - Nghiên cứu phát triển chế phẩm từ Đan sâm theo hướng kháng ung thư phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng 109 ... đồng thời số Tan rễ Đan sâm Nghiên cứu về tác dụng chống ung thư - Đánh giá tác dụng ức chế phát triển số dòng tế bào ung thư - Nghiên cứu chế gây chết tế bào theo chương trình + Nghiên cứu chế.. .thư rễ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), họ Hoa môi (Lamiaceae)? ?? với 02 mục tiêu sau: Xác định cấu trúc hóa học số hợp chất hàm lượng Tanshinon rễ Đan sâm Đánh giá tác dụng chống ung thư. .. Mùa hoa từ tháng 5-8, mùa tháng 7-10 Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [1], [4] 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐAN SÂM Thành phần hóa học Đan sâm chủ yếu cơng bố nhà khoa học Trung