Ứng dụng sinh học phân tử để định loại các chủng cầu trùng gà tại một số huyện ngoại thành hà nội và phân tích kiểu gen chủng phổ biến nhất

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ ĐỊNH LOẠI CÁC CHỦNG CẦU TRÙNG GÀ TẠI MỘT SỐ HUYỆN NGOẠI THÀNH HÀ NỘI VÀ PHÂN TÍCH KIỂU GEN CHỦNG PHỔ BIẾN NHẤT HÀ NỘI – Năm 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ ĐỊNH LOẠI CÁC CHỦNG CẦU TRÙNG GÀ TẠI MỘT SỐ HUYỆN NGOẠI THÀNH HÀ NỘI VÀ PHÂN TÍCH KIỂU GEN CHỦNG PHỔ BIẾN NHẤT Ngƣời thực : Trần Khánh Trang MSV : 637084 Lớp : K63CNSHA Khóa : K63 Giáo viên hƣớng dẫn : TS Bùi Khánh Linh PGS TS Đồng Huy Giới HÀ NỘI – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu cơng trình nghiên cứu khóa luận trung thực không chép kết nghiên cứu khoa học trước Tơi xin cam đoan tài liệu, sở lý thuyết, kiến thức chun ngành, thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc phần tài liệu tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan minh trƣớc Học Viện Hội đồng Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên thực Trần Khánh Trang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập thực đề tài khóa luận, ngồi nỗ lực thân tơi cịn nhận hỗ trợ giúp đỡ nhiệt tình từ tập thể, cá nhân trường Tôi cảm thấy vô biết ơn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc Học viện nông nghiệp Việt Nam, BCH khoa thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học, Học viện nông nghiệp Việt Nam dạy suốt năm tháng giảng đường Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đồng Huy Giới, Trưởng môn Sinh học - khoa Công nghệ Sinh học TS Bùi Khánh Linh, Trưởng môn Ký Sinh Trùng – khoa Thú Y, hướng dẫn, dạy cho suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Để hồn thành luận văn này, tơi cịn nhận động viên, khích lệ vơ to lớn người thân bạn bè Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn với tình cảm cao q Trong suốt q trình thực tập khóa luận chưa có nhiều kinh nghiệm thực tế dựa vào kiến thức học thời gian hạn hẹp nên không tránh khỏi sai sót Kính mong nhận nhận xét quý thầy cô để giúp cho kiến thức báo cáo khóa luận tơi hồn thiện nữa, đồng thời có thêm nhiều kinh nghiệm bổ ích cho tơi phát triển thân sau Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên thực Trần Khánh Trang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP viii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung 2.2 Phân loại cầu trùng gà 2.3 V ng đời phát triển cầu trùng 2.4 Đặ điểm ị h t 2.5 Sinh ệnh họ 2.6 C ph ng ph p h n đo n ệnh ầu tr ng g 2.7 Các nghiên cứu di truyền Eimeria 11 2.7.1 Cấu trúc di truyền quần thể 11 2.7.2 Markers đ ợc sử dụng nghiên cứu di truyền 13 2.7.3 Nghiên cứu di truyền dựa ph ng ph p khuế h đại DNA – PCR 14 PHẦN ĐỐI TƯỢNG-NỘI DUNG-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối t ợng, thời gian, địa điểm vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Đối t ợng nghiên cứu 18 iii 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 3.1.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 18 3.2 Nội dung nghiên cứu 18 3.3 Ph ng ph p nghiên ứu 19 3.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 19 3.3.2 Ph ng ph p xét nghiệm phù tinh noãn nang cầu trùng gà 19 3.3.3 Tách DNA tổng số từ noãn nang cầu trùng 20 3.3.4 Phản ứng PCR x 3.3.5 Ph định chủng cầu trùng 20 ng ph p điện di DNA 21 3.3.6 Phân tích số liệu trình tự đoạn ITS-1 22 3.3.7 Phân tích phát sinh lồi đoạn trình tự ITS-1 22 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Định loại cầu trùng ph 4.1.1 Xét nghiệm phù x 4.1.2 Kết x ng ph p PCR sử dụng cặp mồi ITS-1 23 định mẫu ng tính với bệnh cầu trùng 23 định chủng cầu trùng ph ng ph p PCR 24 4.2 Phân tích kiểu trình tự vùng ITS-1 chủng phổ biến thu thập địa điểm nghiên cứu 29 4.2.1 So sánh giá trị phần trăm t ng đồng đoạn trình tự ITS-1 lồi E tenella 30 đoạn trình tự ITS-1 lồi E tenella 4.2.2 Phân tích phát sinh lồi từ địa điểm nghiên cứu 32 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN VÙNG ITS-1 45 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách loại mồi ITS -1 đặc hiệu cho loài Eimeria sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Kết xét nghiệm mẫu phân thu thập từ trại hăn nuôi địa bàn ba huyện thuộc Hà Nội 23 Bảng 4.2 Kết xét nghiệm PCR sử dụng cặp mồi ITS-1 để phân loại chủng cầu trùng 26 Bảng 4.3: Giá trị phần trăm mứ độ t ng đồng v đoạn trình tự 31 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân loại lồi cầu trùng gà phổ biến dựa vào vị trí ký sinh hình thái nỗn nang Hình 2.2 V ng đời cầu trùng gà Hình 4.1 Kết điện di DNA khuế h đại đoạn ITS-1 lồi Eimeria 25 Hình 4.2 Cây phát sinh lồi sử dụng ph ng ph p Maximum Likelihoo (mơ hình Kimura-2) đoạn ETS-1 33 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT μg: microgram μl: microlit g: gram cs.,: ộng (t giả i o n ) et al.,: ộng (t giả i o n ngo i) RNA: Ribonucleic acid DNA: Deoxyribonucleic Acid E tenella: Eimeria tenella E brunetti: Eimeria brunetti E maxima: Eimeria maxima E mitis: Eimeria mitis E necatrix: Eimeria necatrix E praecox: Eimeria praecox E acervulina: Eimeria acervulina HVNNVN: Họ viện Nông nghiệp Việt Nam KST: Ký sinh trùng PBS: Phosphate Buffered – Saline vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Để định lo i hủng ầu tr ng, nghiên ứu tiến h nh thu thập mẫu trại hăn nuôi gia ầm (đối t ợng l g ta) huyện Só S n, Đơng Anh Ch ng Mỹ, thu đ ợ tổng ộng 21 mẫu phân, tiến h nh loại s ph ng ph p xét nghiệm phân ph nổi, ph t thấy noãn nang ầu tr ng g 15 mẫu Sau đó, thự xét nghiệm PCR x cho 15 mẫu ộ thông qua định lo i sử ụng đoạn mồi ITS- ng tính trên, ph t thấy tổng ộng lo i Eimeria, ao gồm 12/15 mẫu lo i E.tenella (80%), 9/15 mẫu lo i E.maxima (60%), 4/15 mẫu lo i E.mitis (26,7%), 10/15 mẫu lo i E.acervulina (66,7%) 10/15 mẫu lo i E.praecox (66,7%) Bên ạnh đó, để hỗ trợ ho nghiên ứu đa ạng i truyền sâu h n đóng góp v o ơng uộ kiểm so t ệnh ầu tr ng (ví ụ điển hình nh sản xuất vaccine), chúng tơi phân tích thêm trình tự vùng ITS-1 hủng phổ iến l E tenella (vì hủng n y không hỉ phổ iến nghiên ứu n y m n với địa điểm kh giới, tiến h nh so s nh với trình tự ó sẵn để tìm kh lập đ ợ từ địa điểm Só S n, Đơng Anh v Ch đồng ao với đoạn trình tự đ ợ ó kh iệt với hỉ số khoảng iệt) phân ng Mỹ ó mứ độ t ng ông ố GenBank, nhiên h i truyền trung ình đoạn trình tự 0,05 Phân tí h ây ph t sinh lo i ho thấy trình tự thuộ ng nh nh với hủng E.tenella Ấn Độ, Mỹ, Trung Quố v Nam Phi, với trình tự E3 (Ch ng Mỹ) thuộ ng nh nh nhỏ h n với hủng Nam Phi viii Bảng 4.3: Giá trị phần trăm mức độ tƣơng đồng đoạn trình tự Chủng Egypt - E.tenella South Africa - E.tenella China South SG1 - E.tenella China East HG - E.tenella US - E.tenella China ShangHai - E.tenella India - E.tenella E3 CM E.tenella E1 SS E.tenella 10 E2 DA E.tenella 11 China - E.maxima 12 Neospora caninum 13 Toxoplasma gondii 10 11 12 13 100 87.35 87.39 78.3 67.03 64.86 75.24 88.48 88.48 88.48 35.98 34.84 33 100 96.99 90 93.86 95.31 95.67 98.15 97.42 97.42 35.19 34.41 31.44 100 91.97 94.6 96.4 96.4 97.46 97.45 96.01 35.27 35.27 32.08 100 89.56 91.57 91.57 91.97 91.97 90.76 34.21 36.44 31 100 95.55 98.4 96.8 97.5 96.09 42.28 39.33 47.58 100 99.11 98.22 98.93 97.51 41.91 39.11 38.53 100 98.58 99.29 97.86 33.66 33.67 30.87 100 99.29 97.86 36.1 35.94 31.93 100 98.21 36.1 35.69 32.07 100 36.1 35.16 31.07 100 40.86 48.75 100 63.88 100 Trình tự E1 SS v E2 DA đ ợ phân lập lần l ợt từ Só S n v Đơng Anh, hủng E3 CM đ ợ phân lập từ Ch ng Mỹ C đoạn trình tự n lại đ ợ lấy từ GenBank 31 Ba đoạn trình tự ITS-1 E tenella từ nghiên ứu n y, E1 SS E.tenella phân lập từ Só S n, E2 DA E.tenella phân lập từ Đơng Anh v E3 CM E.tenella phân lập từ Ch t ng Mỹ, với hiều i khoảng 278-280 p, ó mứ độ ng đồng ao với đoạn trình tự đ ợ ông ố GenBank (Bảng 4.3.) Ba đoạn trình tự E1 SS, E2 DA v E3 CM ó mứ độ t ng đồng với cao (trong khoảng từ 97,86 đến 99,29%), nhiên ó kh qua hỉ số khoảng ằng ph iệt, thể h i truyền trung ình đoạn trình tự 0,05; tính ng ph p ML (sử ụng mơ hình Tamura tham số) Mứ độ t ng đồng trình tự E3 so với E1 SS v E2 DA lần l ợt l 99,29% v 97,86% Chủng E.tenella Ai Cập ó kh iệt lớn so với trình tự thu đ ợ từ nghiên ứu ó mứ độ t so với đoạn trình tự kh hủng n lại, v a ng đồng với hủng n y cao (88,48%) 4.2.2 Phân tích phát sinh lồi từ đoạn trình tự ITS-1 lồi E tenella địa điểm nghiên cứu Đa ạng i truyền trình tự ITS-1 ph t nghiên ứu n y (n = 3) đ ợ phân tí h với trình tự LN609784.1), Trung Quố ng Eimeria từ Mỹ (Genbank: (Genbank: FJ449692.1), Ấn Độ (Genbank: JX853831.1) v Ai Cập (Genbank: JQ061003.1) đ ợ Phân tích phát sinh lồi sử ụng ph ông ố GenBank ng ph p Maximum likelihood (ML) đ ợ tiến h nh ằng phần mềm MEGA (Tamura et al., 2013) Mơ hình thay nu leoti e ph hợp với tập ữ liệu đ ợ x định ằng h sử ụng Model-Test MEGA7, mơ hình Kimura-2 Thơng số Bootstrap ựa 1000 lần lặp lại v gi trị phần trăm đ ợ thể nút Cây phát sinh lồi đ ợ minh hoạ ằng Hình 4.3 32 Hình 4.2 Cây phát sinh loài sử dụng phƣơng pháp Maximum Likelihood (mơ hình Kimura-2) đoạn ETS-1 Phần trăm gi trị ootstrap (lặp lại 1000 lần) đ ợ thể nút Thanh tỷ lệ ho iết thay trình tự vị trí E1 SS, E2 DA v E3 CM l đoạn trình tự thu đ ợ từ nghiên ứu C đoạn trình tự ITS-1 E.tenella đ ợ giải trình tự v phân tí h thí nghiệm n y ó mứ độ t Mặ ng đồng cao với ây ph t sinh lo i Hình 4.3 ho thấy nghiên ứu thuộ ng nhóm với trình tự đ ợ ơng ố đoạn trình tự thu đ ợ từ trình tự đ ợ nhiên trình tự E3 thu đ ợ từ nghiên ứu ho thấy mứ độ t họn để so s nh, ng đồng giống với hủng E.tenella phân lập từ Nam Phi (Genbank: MN727042.1) h n, hai hủng n y thuộ ng nh nh Mứ độ t ng đồng trình tự E3 CM với hủng E.tenella Nam Phi l 98,15%, thấp h n so s nh trình tự E3 CM với hủng Ấn Độ (98,58%), trình tự E1SS (99,29%) v trình tự E2 DA (97,86%) Bên ạnh đó, ó sai kh qua hỉ số khoảng đoạn trình tự đ ợ thể h i truyền trung ình (mean overall genetic distance) trình tự phân lập, đ ợ x định l 0,05 Trình tự E1 SS v E2 DA đ ợ phân 33 lập lần l ợt từ Só S n v Đông Anh, hủng E3 CM đ ợ phân lập từ Ch Mỹ Mặ khoảng kh h mặt địa lý l không qu lớn, nhiên iệt nhỏ trình tự ng ng ó hủng E.tenella thu đ ợ Bên ạnh đó, o số l ợng mẫu tiến h nh giải trình tự n hạn hế thời gian tiến h nh thí nghiệm, nên ó thể h a ph t hết đ ợ trình tự ITS đa ạng kh lo i E.tenella n tồn ngo i thự địa Theo nghiên ứu Blake et al., 2015, phân tí h genotype hủng Eimeria thu thập từ Ấn Độ, Ai Cập, Libya v Nigeria ho thấy đa ạng ao haplotype Trong đó, 98% v 87,5% haplotype n y đặ tr ng ho v ng ụ thể, ho thấy iversifi ation) rõ r ng ấp độ phân hóa/đặ hiệu v ng (allopatri hủng n y Ngo i ra, nghiên ứu n y n hứng minh, liều gây nhi m 100-1000 noãn nang, việ gây mi n ị h với hủng ó mối quan hệ xa i truyền hỉ ó khả ảo hộ ệnh khoảng 65 87% Do đó, nghiên ứu húng ần tiến h nh thêm nhiều hủng phân lập nhiều vị trí kh nhằm x định kh iệt đặ hiệu ựa yếu tố địa lý Giải trình tự lo us x định (ví ụ nh ITS hoặ COX) đ ợ sử ụng rộng rãi để phân lập kiểu gen Eimeria thự địa kỹ thuật n y t ng đối r , ó thể đ ợ thự với nguồn lự hạn hế ph ng thí nghiệm v đ ợ hỗ trợ ởi kho l u trữ trình tự GenBank Mặ trình tự ITS khơng thể mứ độ t héo đ ợ hứng minh mối quan hệ tiến hóa ựa ng quan với hủng Eimeria kh hoạt động mi n ị h nhau, nh ng hủng n y ó thể đ ợ phân iệt với ựa v o trình tự ITS (Barta et al 1998) Do đó, x định trình tự ITS hủng từ thự địa ó thể hữu í h việ đ nh gi đa ạng hủng Một ph ng ph p điện i mao mạ h ựa PCR sử ụng đoạn mồi ho trình tự ITS-2 rDNA nhân Eimeria đ ợ ph t triển (Canta essi et al, 2008) Kỹ thuật n y đ ợ ứng ụng với Eimeria Ú không hỉ phân iệt đ ợ tất ả ảy lo i Eimeria iết 34 ó thể lây nhi m ho g m (gọi l nx định đ ợ a iến thể i truyền riêng iệt đ n vị phân loại hoạt động OTU-X, OTU-Y OTU-Z; Morris et al., 2007; Canta essi et al., 2008), ho thấy việ phân tí h trình tự ITS ó thể giúp x định iến thể Những thông tin thu thập từ địa ph ản đoạn ITS Eimeria ng ó thể giúp phân loại hủng l u hành Trình tự ITS thu đ ợ từ nghiên ứu mặ ao nh ng ó thể kh đ ợ o ó mứ độ đa ạng khơng iệt Sự thay đổi nu leoti e v ng ITS-1 o v i n i tr (Woo et al., 2000; Bhaskaran et al., 2010; Kumar et al., 2015) Trong nghiên ứu Saroj Kumar et al., 2015 Ấn Độ, o ó thay kh trình tự hỉ ó thể khuế h đại đoạn trình tự neste Ú o ó sai kh hủng ầu tr ng hai n , i E maxima sử ụng ặp primer trình tự đ ợ tạo so với đoạn mồi xuôi đầu 5‟, ho thấy việ thiết kế đoạn mồi l sai kh t ần thiết Mặ ng tự không đ ợ ph t thấy vậy, trình tự nghiên ứu Eimeria l tế o đ n ội phần lớn v ng đời húng, ngoại trừ giai đoạn l ỡng ội ngắn ( iploi ) qu trình sinh sản hữu tính Sự xuất đa ạng i truyền ó thể đ ợ đ y nhanh ởi giai đoạn hữu tính, o qu trình n y tạo hội ho thụ tinh héo ( ross-fertilization) v phân ly/t i tổ hợp nhi m sắ thể sau đó, đặ iệt Eimeria l lo i sinh sản với v ng đời nhanh, số l ợng noãn nang thải nhiều, t ợng đồng nhi m xảy phổ iến (Blake et al., 2015) Nhiều nghiên ứu tìm hiểu ph t triển hế kh ng thuố ngừa ầu tr ng Eimeria v đ a nhiều giả thuyết kh (Jeffers et al., 1978) Tuy nhiên, ý kiến phổ iến ph t triển kh ng thuố l đột iến nội sinh xảy ầu trùng (Jeffers et al., 1974) Thời gian hệ ngắn tạo hội ho kiện tiến hóa nhanh hóng, ví ụ khả nhân lên hoặ khả gây ệnh kh 2012) Vì vậy, (A u-Akkada et al., ấu hiệu họn lọ quần thể g Eimeria ự kiến đa 35 ạng, ao gồm họn lọ theo ph hoặ họn lọ ng ph p điều trị ự ph ng (sử ụng thuố ), ân ằng ởi mi n ị h sau lây nhi m tự nhiên Việ sử ụng va ine ó thể ẫn đến họn lọ đa ạng, phụ thuộ v o ản hất v đa ạng quần thể địa ph thuố ngừa ầu tr ng, ng Do việ sử ụng liên tụ v kéo i loại đột iến đ ợ quan s t thấy quần thể ầu tr ng qu trình họn lọ liên tụ n y Những đột iến n y ó thể liên quan đến ph t triển kh ng thuố (Weppelman et al., 1977) Phân tí h trình tự ITS giúp ó i nhìn tổng quan an đầu tr p ụng kỹ thuật kh để phân tí h ấu trú quần thể, đặ tính to n ộ hệ gen, ng nh mứ độ đa ạng kh ng nguyên gây đ p ứng mi n ị h, yếu tố quan trọng qu trình ph t triển va ine Đã h n 100 năm kể từ ệnh ầu tr ng gây tổn hại lớn ng nh hăn nuôi gia ầm, nh ng nhiều lỗ hổng n tồn công tác ph ng ngừa ệnh Hiện nay, l ợng gia ầm nuôi tăng đ ng kể nhằm đảm ảo l ng thự phụ thuộ v o ho to n ân số Đồng thời, ng ời hăn nuôi ố gắng giảm loại thuố ngừa ầu tr ng ( o kh ng kh ng sinh, tồn ảnh h ởng luật ph p) v thay ằng hính x loại va ine ó khả tiêu iệt nhiều hủng hoặ l hủng ụ thể Tuy nhiên, xuất kiểu gen lạ trở th nh th h thứ va ine Trong tr ng th KS v nỗ lự ph t triển kiểu gen n y ó thể đ ợ kiểm so t ằng thuố ngừa ầu ng mại, húng lại ó thể l n trốn khỏi mi n ị h tạo ởi loại va ine h nh Việ hiểu sâu h n đa ạng i truyền, ấu trú quần thể v khả tiến ho ần trở nên quan trọng h n việ kiểm so t ầu tr ng Bản hất qu trình tiến ho tinh héo Eimeria h a đ ợ l m rõ ao gồm tỷ lệ thụ quần thể thự địa v t i tổ hợp i truyền Việ ph t triển ấu hiệu i truyền to n ộ hệ gen, hoặ ri osome v ty thể ó ý nghĩa việ hiểu h quần thể Eimeria phản ứng tiếp xú với thuố hoặ va ine ngừa ầu tr ng, v t ng t 36 vật hủ - KST PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Xét nghiệm PCR x định lo i sử ụng đoạn mồi ITS-1 ph t thấy tổng ộng lo i Eimeria, ao gồm 12/15 mẫu lo i E.tenella (80%), 9/15 mẫu lo i E.maxima (60%), 4/15 mẫu lo i E.mitis (26,7%), 10/15 mẫu lo i E.acervulina (66,7%) 10/15 mẫu lo i E.praecox (66,7%) Phân tích thêm trình tự vùng ITS-1 hủng đ ợ x định l phổ iến nhất: E Tenella, phân lập đ ợ từ địa điểm Só S n, Đơng Anh v Ch Mỹ ó mứ độ t ng đồng ao với đoạn trình tự đ ợ GenBank, nhiên ó kh iệt với hỉ số khoảng ình đoạn trình tự l 0,05 Và phát sinh lồi thuộ ng ông ố h i truyền trung ng ho thấy trình tự ng nh nh với hủng E.tenella Ấn Độ, Mỹ, Trung Quố v Nam Phi, với trình tự E3 (Ch ng Mỹ) thuộ ng nh nh nhỏ h n với hủng Nam Phi 5.2 Kiến nghị Từ kết ho thấy tính ứng ụng cao ph tử PCR, nhờ định anh hính x trại hăn ni, tìm kh đ ợ ng ph p phân hủng ầu tr ng l u h nh iệt phân tí h trình tự v ng ITS-1 mẫu thu thập đ ợ , nhiên o thời gian kinh phí hạn hế nên số l ợng mẫu thu thập cịn ít, nhóm nghiên ứu hỉ ó thể phân tí h kiểu gen lo i Eimeria tenella Vậy nên nhóm nghiên ứu kiến nghị tiếp tụ nghiên ứu phân tử, ổ sung thêm thông tin mứ độ đa ạng gen tất ả trùng: Tiếp tụ thu thập mẫu, định loại lo i ầu tr ng để x l u h nh, phân tí h mứ độ đa ạng gen v ng ITS-1 thự địa 37 lồi ầu định tình trạng lo i từ mẫu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nƣớc B i Kh nh Linh, Nguy n Văn Thọ, D Ph ng Đứ Hiếu, Nguy n Văn ng, Nguy n Thị Hồng Chiên, Nguy n Thị Nhiên, Trần Hải Thanh, Nguy n Việt Linh Lê Thị Lan Anh, Nguy n Thị Ho i v Ch u Thị Luyến 2018 Đ nh gi thự trạng nhi m ầu tr ng g (Eimeria spp) địa n số tỉnh miền Bắ Việt Nam KHKT Chăn nuôi số 229 89-93 Hồng Thạch Tình hình nhi m cầu trùng gà Eimeria Bệnh cầu trùng gà thả v ờn ni khu vực TP Hồ Chí Minh vùng lân cận Tạp chí KHKT Thú y số – 1997 Lê Văn Năm (2004), Bệnh ầu tr ng gia sú gia ầm Nh xuất ản Nông nghiệp, H Nội, tr 46 L ng Tấn Phát, Bùi Trần Anh Đ o Khảo sát tình hình bệnh cầu trùng giống gà Ai Cập L ng Ph ợng huyện Sóc S n - Hà Nội Khoa học Kỹ thuật Thú y 2011, số tr.37-43 Nguy n Thị Kim Lan, Nguy n Thị Lê, Phạm Sỹ Lăng v Nguy n Văn Quang (2008) Ký sinh tr ng họ Thú y Nh xuất ản Nông Nghiệp, H Nội tr 264-280 Tài liệu tham khảo nƣớc Aarthi S, Dhinakar Raj G, Raman M, Gomathinayagam S, Kumanan K Molecular prevalence and preponderance of Eimeria spp among chickens in Tamil Nadu, India Parasitol Res 2010 Sep;107(4):1013-7 doi: 10.1007/s00436-010-1971-2 Epub 2010 Jul PMID: 20607286 Barta JR, Coles BA, Schito ML, Fernando MA, Martin A, Danforth HD (1998) Analysis of intra-specific variation among five strains of Eimeria maxima from North America Int J Parasitol 28:485–492 Beck HP, Blake D, Dardé M-L, Felger I, Pedraza-Díaz S, RegidorCerrillo 38 J, Gómez-Bautista M, Ortega-Mora LM, Putignani L, Shiels B, Tait A, Weir W (2009) Molecular approaches to diversity of populations of apicomplexan parasites Int J Parasitol 39:175–189 Bhaskaran M.S., Venkatesan L., Aadimoolam R., Jayagopal H.T & Sriraman R., 2010, „Sequence diversity of internal transcribed spacer-1 (ITS-1) region of Eimeria infecting chicken and its relevance in species identification from Indian field samples‟, Parasitology Research 106(2), 513 10.1007/s00436-009-1696-2 10 Blake, D P., Qin, Z., Cai, J., & Smith, A L (2008) Development and validation of real-time polymerase chain reaction assays specific to four species of Eimeria Avian Pathology, 37(1), 89– 94 doi:10.1080/03079450701802248 11 Blake, D.P., Tomley, F.M., 2014 Securing poultry production from the ever-present Eimeria challenge Trends Parasitol 30, 12–19 12 Blake, D.P.; Clark, E.L.; Macdonald, S.E.; Thenmozhi, V.; Kundu, K.; Garg, R.; Jatau, I.D.; Ayoade, S.; Kawahara, F.; Moftah, A.; et al 2015 Population, genetic, and antigenic diversity of the apicomplexan Eimeria tenella and their relevance to vaccine development Proc Natl Acad Sci USA 2015, 112, e5343–e5350 13 Brown Jordan A, Blake D, Beard J, et al Molecular Identification of Eimeria Species in Broiler Chickens in Trinidad, West Indies Vet Sci 2018;5(1):12 Published 2018 Jan 22 doi:10.3390/vetsci5010012 14 Brown Jordan, A., Blake, D., Beard, J., Beharry, A., Serrette, L., Soleyn, A., et al., 2018, „Mole ular i entifi ation of Eimeria species in broiler hi kens in Trini a , West In ies‟, Veterinary S ien es 5(1), 12 https://doi.org/10.3390/vetsci5010012 15 Cantacessi, C., Riddell, S., Morris, G.M., Doran, T., Woods, W.G., Otranto, D., Gasser, R.B., 2008 Genetic characterization of three unique 39 operational taxonomic units of Eimeria from chickens in Australia based on nuclear spacer ribosomal DNA Vet Parasitol 152, 226–234 16 Carvalho F.S., Wenceslau A.A., Teixeira M., Albuquerque G.R Molecular diagnosis of Eimeria species affecting naturally infected Gallus gallus Genet Mol Res 2011a;10:996–1005 17 Chapman, H D., Jeffers, T K., & Williams, R B (2010) Forty years of monensin for the control of coccidiosis in poultry Poultry Science, 89(9), 1788–1801 doi:10.3382/ps.2010-00931 18 Clark, E L., Macdonald, S E., Thenmozhi, V., Kundu, K., Garg, R., Kumar, S., Blake, D P (2016) Crypti Eimeria genotypes are ommon across the southern but not northern hemisphere International Journal for Parasitology, 46(9), 537–544 doi:10.1016/j.ijpara.2016.05.006 19 Conway D P and M E Mckenzie (2007) Poultry Coccidiosis Diagnostic and Testing Procedures Ames Iowa 3th pp 7-168 20 Cook S.M., Higuchi D.S., McGowan A.L., Schrander J.S., Withanage G.S.K & Fran is M.I., 2010, „Polymerase chain reaction-based identity assay for pathogenic turkey Eimeria‟, Avian Diseases 54(4), 1152–1156 10.1637/9271-020310-Reg.1 21 Fernandez, S., Costa, A.C., Katsuyama, Â.M et al A survey of the interand intraspecific RAPD markers of Eimeria spp of the domestic fowl and the development of reliable diagnostic tools Parasitol Res 89, 437–445 (2003) https://doi.org/10.1007/s00436-002-0785-2 22 FERNANDEZ, S., PAGOTTO, A., FURTADO, M., KATSUYAMA, Â, MADEIRA, A., & GRUBER, A (2003) A multiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of the seven Eimeria species that infect domestic fowl Parasitology, 127(4), 317-325 doi:10.1017/S0031182003003883 23 Fornace KM, Clark EL, Macdonald SE, Namangala B, Karimuribo E, 40 Awuni JA, Thieme O, Blake DP, Rushton J Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken farms in Africa and indication of economic profitability PLoS One 2013 Dec 31;8(12):e84254 doi: 10.1371/journal.pone.0084254 PMID: 24391923; PMCID: PMC3877271 24 Gari, Getachew & Getachew, Tilahun & Dorchies, Philippe (2008) Study on Poultry Coccidiosis in Tiyo District, Arsi Zone, Ethiopia International Journal of Poultry Science 10.3923/ijps.2008.251.256 25 Gasser, R B., Skinner, R., Fadavi, R., Richards, G., & Morris, G (2005) High-throughput capillary electrophoresis for the identification and differentiation of seven species ofEimeria from chickens ELECTROPHORESIS, 26(18), 3479–3485 doi:10.1002/elps.200500103 26 Gebretnsae, H., Gebreyohannes, M., Tesfaye A (2014) Prevalence of poultry coccidosis in Gondar town, North West Ethiopia AmericanEurasian J Sci Res 9(5):129-135 27 Hamid, P.H., Kristianingrum, Y.P., Wardhana, A.H., Prastowo, S & Silva, L.M.R.D., 2018, „Chi ken o i iosis in Central Java, In onesia: A re ent up ate‟, Veterinary Me i ine International 2018(8515812), https://doi.org/10.1155/2018/8515812 28 Haug, A., Thebo, P., Mattsson, J.G., 2007 A simplified protocol for molecular identification of Eimeria species in field samples Vet Parasitol 146, 35–45 29 Hnida J, Duszynski D (1999) Taxonomy and systematics of some Eimeria species of murid rodents as determined by the ITS-1 region of the ribosomal gene complex Parasitol 119:349–357 30 Huang, Y., Ruan, X., Li, L & Zeng, M., 2017, „Prevalen e of Eimeria species in domestic chickens in Anhui provin e, China‟, Journal of Parasitic Diseases 41(4), 1014–1019 https://doi.org/10.1007/s12639-0170927-1 41 31 Huang, Y., Ruan, X., Li, L., & Zeng, M (2017) Prevalence of Eimeria species in domestic chickens in Anhui province, China Journal of Parasitic Diseases, 41(4), 1014–1019 doi:10.1007/s12639-017-0927-1 32 Jenkins, K MISKA, AND S KLOPP 2006a Application of polymerase chain reaction based on ITS1 rDNA to speciate Eimeria Avian Diseases 50: 110–114 33 Kaboudi K, Umar S, Munir MT Prevalence of Coccidiosis in Free-Range Chicken in Sidi Thabet, Tunisia Scientifica (Cairo) 2016;2016:7075195 doi: 10.1155/2016/7075195 Epub 2016 Apr 24 PMID: 27213084; PMCID: PMC4860226 34 Kawahara F, Zhang G, Mingala CN, Tamura Y, Koiwa M, Onuma M, Nunoya T Genetic analysis and development of species-specific PCR assays based on ITS-1 region of rRNA in bovine Eimeria parasites Vet Parasitol 2010 Nov 24;174(1-2):49-57 doi: 10.1016/j.vetpar.2010.08.001 Epub 2010 Aug 11 PMID: 20817404 35 Kumar S, Garg R, Moftah A, Clark EL, Macdonald SE, Chaudhry AS, Sparagano O, Banerjee PS, Kundu K, Tomley FM, Blake DP An optimised protocol for molecular identification of Eimeria from chickens Vet Parasitol 2014 Jan 17;199(1-2):24-31 doi: 10.1016/j.vetpar.2013.09.026 Epub 2013 Sep 28 PMID: 24138724; PMCID: PMC3858809 36 Kumar S., Garg R., Banerjee P.S., Ram H., Kundu K., & Kumar S et al 2015a, „Genetic diversity within ITS-1 region of Eimeria species infecting chickens of north India‟, Infection, Genetics and Evolution 36, 262–267 10.1016/j.meegid.2015.09.023 37 Kumar, S., Garg, R., Moftah, A., Clark, E.L., Macdonald, S.C., Chaudhry, A.S., Sparagano, O., Banerjee, P.S., Kundu, K., Tomley, F.M., Blake, D.P., 2014 An optimise proto ol for mole ular i entifi ation of Eimeria from 42 chickens Vet Parasitol 199, 24–31 38 Lan L.-H.; Sun, B.-B.; Zuo, B.-X.-Z.; Chen, X.-Q.; Du, A.-F (2017) Prevalence and drug resistance of avian Eimeria species in broiler chicken farms of Zhejiang province, China Poultry Science, (), doi:10.3382/ps/pew499 39 Lew, A.E., Anderson, G.R., Minchin, C.M., Jeston, P.J., Jorgensen, W.K., 2003 Inter and intra strain variation and PCR detection of the internal transcribed spacer l (ITS-1) sequences of Australian isolates of Eimeria species from chickens Vet Parasitol 112, 33–50 40 Lien, Y.Y., Sheu, S.C., Liu, H.J., Chen, S.C., Tsai, M.Y., Luo, S.C., Wu, K.C., Liu, S.S., Su, H.Y., 2007 Cloning and nucleotide sequencing of the second internal transcribed spacer of ribosomal DNA for three species of Eimeria from chickens in Taiwan Vet J 173, 184–189 41 Matsu ayashi, Makoto et al “Morphologi al an mole ular i entifi ation of Eimeria spp in ree ing hi ken farms of Japan.” The Journal of veterinary medical science vol 82,5 (2020): 516-519 doi:10.1292/jvms.190661 42 Schnitzler BE, Thebo PL, Mattsson JG, Tomley FM, Shirley MW (1998) Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken Avian Pathol 27:490–497 43 Shirley MW, Smith AL, Blake DP Challenges in the successful control of the avian coccidia Vaccine 2007 Jul 26;25(30):5540-7 doi: 10.1016/j.vaccine.2006.12.030 Epub 2006 Dec 26 PMID: 17224208 44 Shirley MW, Smith AL, Tomley FM The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination Adv Parasitol 2005;60:285-330 doi: 10.1016/S0065-308X(05)60005-X PMID: 16230106 45 Stucki U, Braun R, Roditi I Eimeria tenella: characterization of a 5S 43 ribosomal RNA repeat unit and its use as a species-specific probe Exp Parasitol 1993 Feb;76(1):68-75 doi: 10.1006/expr.1993.1008 PMID: 8467900 46 Su YC, Fei AC, Tsai FM (2003) Differential diagnosis of five avian Eimeria species by polymerase chain reaction using primers derived from the Internal Transcribed Spacer-1 (ITS-1) sequence Vet Parasitol 117:221–227 47 Tran Duc Hoan , Javaid Ali Gadahia and Riaz Ahmed Legharia, Molecular Identification of Eimeria species Infection in Chickens in Surrounding Areas of the Red River Delta in Vietnam, International Journal of Livestock Research ISSN 2277-1964 ONLINE Vol 4(7) O t‟14 Hosted@www.ijlr.org DOI 10.5455/ijlr.20140925111501 Page 48 Vrba, V., Blake, D.P., Poplstein, M., 2010 Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken Vet Parasitol 174, 183–190 49 Williams R B., A C Bushell, J M Répérant, T G Doy, J H Morgan, M W Shirley, P Yvoré, M M, Car and Y Fremont (1996) A survey of Eimeria species in commerciallyreared chickens in France during 1994 Avian Pathol Vol 25 (1) pp 110-130 50 Woods, W.G., Richards, G., Whithear, K.G., Anderson, G.R., Jorgensen, W.K., Gasser, R.B., 2000 High-resolution electrophoretic procedures for the identification of five Eimeria species from chickens, and detection of population variation Electrophoresis 21, 3558–3563 Zhao, X., Duszynski, D.W., Loker, E.S., 2001 A simple method of DNA extraction for Eimeria species J Microbiol Methods 44, 131–137 44 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN VÙNG ITS-1 >1st_BASE_4239254_E1_ETF2 forward_primer_ CCNATTTNCTGCACGGTTTTTCTACTTTTTAAAATGGATGGAATTTTT TGCTGCTGCAAGGATATATAGCAGTAGTATGTACGTGGGCGATCGGG GGGGTGGTGGCGCATGCACGGGCTCGCGTGGGGTCTGTCGGTGGCAG CCCCAGCGCGCCGGCGCCAGCCCCGTGATCGTCGATCGCGCACGTAC GTGGAGGGGATTATGAGAGGAGAAGACGCGCACGGGGCTGTGTCGT ATGCAGAGCGCTCGAAC >1st_BASE_4239255_E1_ETR reverse_primer_ CGGGGCTTCTCTCTCATAATCCCCTCCACGTACGTGCGCGATCGACG ATCACGGGGCTGGCGCCGGCGCGCTGGGGCTGCCACCGACAGGCCC CACGCGAGCCCGTGCATGCGCCACCACCCCCCCGATCGCCCACGTAC ATACTACTGCTATATATCCTTGCAGCAGCAAAAAATTCCATCCATTTT TAAAAAGTAGAAAAACCGTTGCAGAGAAAAACAGATTCAAGGGTTG CGATGGACTAAATTAA >1st_BASE_4239256_E2_ETF2 forward_primer_ CTCGAGGTATTCTGTCTAGCTTTTTAAAATGGATGGAATTTTTTGCTG CTGCAAGGATATATAGCAGTAGTATGTACGTGGGCGATCGGGGGGGT GGTGGCGCATGCACGGGCTCGCGTGGGGCCTGTCGGTGGCAGCCCCA GCGCGCCGGCGCCAGCCCCGTGATCGTCGATCGCGCACGTACGTGGA GGGGATTATGAGAGGAGAAGACGCGCACGGGGCTGTGTCGTATGCA GAGCGCTACGACC >1st_BASE_4239257_E2_ETR reverse_primer_ AGGGAAATTAATCTCTTAATCCCCTACACGTACGTGCGCGATCGACG ATCACGGGGCTGGCGCCGGCGCGCTGGGGCTGCCACCGACAGGCCC CACGCGAGCCCGTGCATGCGCCACCACCCCCCCGATCGCCCACGTAC ATACTACTGCTATATATCCTTGCAGCAGCAAAAAATTCCATCCATTTT TAAAAAGTAGAAAAACCGTTGCAGAGAAAAACAGATTCAAGGGTTG CGATGGACTAAATTAA >1st_BASE_4239258_E3_ETF2 forward_primer_ TAGTTTTTAAAATGGATGGAATTTTTTGCTGCTGCAAGGATATATAGC AGTAGTATGTACGTGGGCGATCGGGGGGGTGGTGGCGCATGCACGG GCTCGCGTGGGGCCTGTCGGTGGCAGCCCCAGCGCGCCGGCGCCAGC CCCGTGATCGTCGATCGCGCACGTACGTGGAGGGGATTATGAGAGGA GAAGACGCGCACGGGGCTGTGTCGTATGCAGAGCGCTCGACT >1st_BASE_4239259_E3_ETR reverse_primer_ ATCAACTACACGTACGTGCGCGATCGACGATCACGGGGCTGGCGCCG GCGCGCTGGGGCTGCCACCGACAGGCCCCACGCGAGCCCGTGCATGC GCCACCACCCCCCCGACCGCCCACGTACATACTACTGCTATATATCCT TGCAGCAGCAAAAAATTCCATCCATTTTTAAAAAGTAGAAAAACCGT TGCAGAGAAAAACAGATTCAAGGGTTGCGATGGACTAAATTAG 45