Nghiên cứu xác định các đoạn dna barcode cho loài sa mộc (cunninghamia lanceolata) phục vụ giám định loài

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đƣợc khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - trƣờng Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình tơi suốt q trình thực khóa luận trƣờng, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Văn Huân tận tình giúp đỡ bảo tơi q trình hồn thành khóa luận Với kiến thức kỹ thầy truyền dạy khơng giúp tơi hồn thành khóa luận mà tài sản quý báu theo giúp tơi sau Khóa luận nhận đƣợc hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nƣớc " Xây dựng sở liệu mã vạch ADN (DNA barcode) cho số loài lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế" PGS.TS Hà Văn Huân làm Chủ nhiệm Cảm ơn TS Bùi Thị Mai Hƣơng tận tình giúp đỡ bảo tơi để tơi thực đƣợc khóa luận Cảm ơn anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học quan tâm giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên hỗ trợ suốt thời gian qua Mặc dù có nhiều cố gắng để hồn thành khóa luận cách hồn chỉnh nhất, song khơng thể tránh khỏi thiếu sót Do vậy, tơi mong đƣợc góp ý thầy bạn để kiến thức tơi đƣợc hồn thiện Xn Mai, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Phạm Thị Trang i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu sa mộc (Cunninghamia lanceolata) 1.1.1 Nguồn gốc Sa mộc (hay sa mu) có tên khoa học (Cunninghamia lanceolata) 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Giá trị sử dụng 1.2 Tổng quan mã vạch DNA (DNA barcode) 1.2.1 Giới thiệu mã vạch DNA 1.2.2 Ứng dụng DNA barcode thực vật CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu 2.3.2 Vật liệu nghiên cứu 2.3.3 Dụng cụ, hóa chất sử dụng 2.3.4 Tách chiết DNA tổng số 11 2.3.5 Nhân số đoạn ADN mã vạch 12 2.3.6 Tinh sản phẩm PCR 15 ii CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 16 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 16 3.2.1 Gen matK 17 3.2.2 Gen rbcL 17 3.2.3 Gen trnH-psbA 17 3.2.4 Gen ITS2 18 3.2.5 Gen ITS 18 3.3 Phân tích kết 18 3.3.1 Trình tự đoạn gen matK 18 3.3.2 Trình tự đoạn gen rbcL 22 3.3.3 Trình tự đoạn gen trnH-psbA 26 3.3.4 Trình tự đoạn gen ITS2 29 3.3.5 Trình tự gen ITS 32 3.3.6 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA, ITS2, ITS 36 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Các chữ viết Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tắt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Bp Base pair Cặp base CBOL Consortium for the Barcode Consortium for the of Life Barcode of Life Convention on International CITES Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora cpDNA CTAB DNA (ADN) Chloroplast DNA Công ƣớc bn bán quốc tế lồi nguy cấp gen lục lạp Cetyl trimethylammonium Cetyl trimethylammonium bromide bromide Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid triphosphate triphosphate dNTP 10 EBA Extraction Buffer A Đệm tách A 11 EBB Extraction Buffer B Đệm tách B Ethylenediaminetetraacetic axit ethylenediamine acid tetraacetic 12 EDTA 13 F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi 14 IGS intergenic spacer vùng liên gen iv 15 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base 16 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể Nicotinamide adenine Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate National Center for Trung tâm Quốc gia Biotechnology Information Thông tin Công nghệ 17 18 NAD(P)H NCBI sinh học Khung đọc mở 19 ORF Open Reading Frame 20 PCR Polymerase Chain Reaction 21 PVP polyvinyl pyrrolidone polyvinyl pyrrolidone 22 RFLP restriction fragment length Phân tích đa hình trình tự polymorphism DNA 23 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 24 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 25 SDS sodium dodecyl sulphate sodium dodecyl sulphate 26 R-Primer Reverse primer Mồi ngƣợc 27 TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA 28 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 29 UV Untraviolet Tia cực tím v Phản ứng chuỗi polymerase DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần đệm tách A (100ml)………………………………… 10 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách B (100ml) 10 Bảng 2.3 Các cặp mồi sử dụng 13 Bảng Thành phần phản ứng PCR 14 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với loài Michelia mediocris Dandy ngân hàng gen NCBI 21 Bảng Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với loài Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook ngân hàng gen NCBI 25 Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với loài 28 Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook ngân hàng gen NCBI 28 Bảng 3.4 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với loài 31 Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook ngân hàng gen NCBI 31 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với loài 35 Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook ngân hàng gen NCBI 35 Bảng 3.6 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự 36 matK, rbcL trnH-psbA,ITS2 36 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 hình thái Sa mộc Hình 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số mẫu Sa mộc 16 Hình 3.2 kết nhân vùng gen 17 Hình 3.3 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK loài Cunninghamia lanceolatavà loài Cunninghamia lanceolata isolate 21 Hình 3.4 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI 22 Hình 3.5 Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL lồi Cunninghamia lanceolata Cunninghamia lanceolata isolate 24 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo NCBI 25 Hình 3.7 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA loài Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hookvà loài Cunninghamia lanceolata isolate 27 Hình 3.8 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI 28 Hình 3.9 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS2 loài Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hookvà loài Cunninghamia lanceolata isolate 30 Hình 3.10 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS2 tạo NCBI 31 Hình 3.11 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS lồi Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hookvà loài Cunninghamia lanceolata isolate 34 Hình 3.12 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS2 tạo NCBI 35 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên đa dạng phong phú với nhiều lồi động vật, thực vật nấm có giá trị kinh tế cao Trong đó, giới thực vật có tính đa dạng cao lồi Đến có khoảng 350.000 loài thực vật đƣợc định dạng Từ thời xa sƣa nhà khoa học biết cách xếp thực vật theo trật tự định để nhận biết chúng cách dễ dàng Tuy nhiên, việc xếp thực vật vào nhóm chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh hình thái đặc điểm sinh lí hóa bên nhờ vào bảng hƣớng dẫn định loại có sẵn Phƣơng pháp nhiều trƣờng hợp cịn gặp số khó khăn hạn chế nhƣ nhiều lồi có hình thái giống nhƣng lại khác hệ thống phân loại Ngƣợc lại số lồi khác hình thái nhƣng lại gần hệ thống phân loại ( hệ gen giống nhau) Ngoài với mẫu phân biệt dƣới lồi mẫu có nguồn gốc sinh vật biến đổi sinh thái nhƣ chết, bị vùi dƣới đất qua chế biến khơng thể xác định đƣợc thị hình thái Nhờ vào phát triển nhanh chóng cơng nghệ khoa học nói chung nhƣ kĩ thuật sinh học phân tử nói riêng cho phép khắc phục đƣợc hạn chế kể đồng thời cho phép xác định đƣợc khác biệt lồi trí cá thể lồi cách xác Việc ứng dụng gen mã vạch, xác định đoạn DNA barcode phƣơng pháp định danh, sử dụng đoạn DNA chuẩn ngắn nằm genome sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Phƣơng pháp xác định đoạn DNA barcode đƣợc áp dụng phổ biến cho lồi thực vật có giá trị kinh tế cao Sa mộc gỗ lớn có giá trị kinh tế cao cho gỗ, làm cảnh, số phận nhƣ vỏ rễ đƣợc dùng làm thuốc Ở Việt Nam, Sa mộc đƣợc trồng vùng biên giới phía bắc nhƣ: Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Lạng Sơn, Cao Bằng, Quảng Ninh Gỗ Sa mộc đƣợc đánh giá cao có hƣơng thơm bền tƣơng tự nhƣ hồng sam Bắc Mỹ bách Nhật Bản Sa mộc đƣợc quan tâm nghiên cứu tiêu biểu nhƣ: nghiên cứu thực trạng phát triển rừng trồng Sa mộc huyện Hoàng Sƣ Phì tỉnh Hà Giang Kĩ thuật trồng Sa mộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam nghiên cứu… Do đó, tơi thực đề tài “Nghiên cứu xác định đoạn DNA barcode cho loài Sa mộc (Cunninghamia lanceolata) phục vụ giám định loài” CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu sa mộc (Cunninghamia lanceolata) 1.1.1 Nguồn gốc Sa mộc (hay sa mu) có tên khoa học (Cunninghamia lanceolata) Liên giới: Eukaryote ( sinh vật nhân thực) Gới (regnum): Plantae (Thực vật) Lớp (class) : Pinopsida Bộ (ordo) : Pinales Họ (familia): Cupressaceae Chi (genus) : Cunninghamia Loài (species) : C.lanceolata 1.1.2 Đặc điểm sinh học Cây gỗ lớn, cao 30 m, đƣờng kính tới 200 cm Thân tròn thẳng Vỏ nâu xám nâu, nứt dọc Phân cành thấp, cành mọc vịng, thẳng góc với thân, xếp thành nhiều tầng Tán hẹp hình trụ vafs.gov.vn/vn/2014/07/ky-thuat-trong-samu Hình 1.1 hình thái Sa mộc 3.3.3 Trình tự đoạn gen trnH-psbA Trình tự gen trnH-psbA đƣợc phân tích có kích thƣớc 511bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu Sa mộc nhƣ sau: CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGAGCCACTTGGCTACA TCCGCCCCTCCGCTCTAATTTCCACCATTCATGATTATTGTATTGAGT CTTTCTTACTTTCTGAGATACAGATATTGAACATAAAATGCCAATCCT GTAAATTGTAAATGTACAAAAAAATTCTTTTATGAAAAAAAAAAGAA AATGATTTTGAGGAACATACAGAAATTACGATACAGATCGGTACAGA ACAAAAATATGATATTTGATCATGAACCAGCCAACAATAATGTTTTC TTAAGTTGAAATAAAGAAATGAAAATGGCAAAAATGTTTATGTGAAT AAAACACTACTGAATCGAACGGATCAATACCCAACTTCTTGATAGAA CAAGAAGTTGGGTATTGATCGGATCCTTCAACGACTCATATACACTA AGACTGAAGTATTATCCATTTGTAGATGGAACTTCAACAGCAGCTAG GTCTAGAGGGAAATTGTGAGCATTACGTTCATGCATAAC Từ tƣơng đồng trình tự, chúng tơi nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể lồi Sa mộc Do tơi lấy trình tự để phân tích So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA loài Sa mộc Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook, với mã số KP095777.1 với trình tự với trình tự gen lồi Cunninghamia lanceolata isolate cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số JQ512289.1 , ta có: Sự sai khác trình tự đoạn gen đƣợc thể nhƣ sau: Tỷ lệ tƣơng đồng 99% có điểm sai khác: Range 1: to 590GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1059 bits(1174) 0.0 589/590(99%) 0/590(0%) Plus/Minus Query 18 CAATCCACTGCCTTTGAACCACTTGGCTACGTCCGCCCCAAACTAATTGACAGTCTCTGT 77 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 590 CAATCCACTGCCTTTGAACCACTTGGCTACGTCCGCCCCAAACTAATTGACAGTCTCTGT 531 Query 78 CTACGATCATTCCAAGAAGAATTGTTCTAAGTCCCGAAAATGGACTAATATATTATTAGT 137 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 26 Sbjct 530 CTACGATCATTCCAAGAAGAATTGTTCTAAGTCCCGAAAATGGACTAATATATTATTAGT 471 Query 138 TATTAGTTCGTCAGTTCAGTTGGCAAGCTCTGACCGGACATTAAAGTGATGCATTGCAAG 197 Sbjct 470 TATTAGTTCGTCAGTTCAGTTGGCAAGCTCTGACCGGACATTAAAGTGATGCATTGCAAG 411 Query 198 ATAAATCACCTTCAATGCAACTTTCGAACAAGTTAGTTGTATTTCTTTATTTGTTTATTG 257 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 410 ATAAATCACCTTCAATGCAACTTTCGAACAAGTTAGTTGTATTTCTTTATTTGTTTATTG 351 Query 258 AAAACAAAACAATAGTCAAATTGGGTACCCAATTTAAGATCTGAGCCGATACTTATGATT 317 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 350 Query 318 AAAACAAAACAATAGTCAAATTGGGTACCCAATTTAAGATCTGAGCCGATACTTATGATT 291 ATGAAAATCAATTTGtttttttGCATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAA 377 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 290 ATGAAAATCAATTTGTTTTTTTGCATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAA 231 Query 378 TTGGGAAGTCGCGGGTTCAATTCCTGCTGGATGCACAATAAACAGTTATTGCACTCTGCT 437 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 230 TTGGGAAGTCGCGGGTTCAATTCCTGCTGGATGCACAATAAACAGTTATTGCACTCTGCT 171 Query 438 CGCAATAACTTTTAGACGGAAAAAAGCAGTACCAAACCTTTCGGTTTTGGTACTGttttt 497 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 170 CGCAATAACTTTTAGACGGAAAAAAGCAGTACCAAACCTTTCGGTTTTGGTACTGTTTTT 111 Query 498 ttCCCTTTTCAAGAATTGAAACACATTAACAATCCATCGGACTGAGTAATTAGCCGTCTA 557 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110 TTCCCTTTTCAAGAATTGAAACACATTAACAATCCATCGGACTGAGTAATTAGCCGTCTA Query 558 TAGAATTAGCTTCAACAGCAGCTAGATCCAGAGGGAAGTTGTGAGCGTTA 51 607 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 50 TAGAATTAGCTTCAACAGCAGCTAGATCCAGAGGGAAGTTGTGAGCATTA Hình 3.7 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA loài Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hookvà loài Cunninghamia lanceolata isolate Từ hình chúng tơi nhận thấy có điểm sai khác trình tự gen trnHpsbA nghiên cứu với trình tự đoạn gen trnH-psbA loài Cunninghamia lanceolata isolate biết trƣớc 1.Thay G A vị trí 604 27 Tiếp tục so sánh với đoạn gen trnH-psbA số lồi có trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST, thiết lập đƣợc phát sinh chủng loại nhờ phầm mềm tin sinh học Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Sa mộc đƣợc trình bày bảng 3.4 Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với loài Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ tƣơng Cunninghamia lanceolata KP09577.1 đồng 100% Cunninghamia lanceolata isolate KC427270.1 99% Sequoia sempervirens KR075871.1 84% Taxodium distichum LC177556.1 81% Taiwania flousiana KC427274.1 85% Metasequoia glyptostroboides KR061358.1 82% Glytostrobus pensilis KU302768.1 84% Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể hình 3.9 Hình 3.8 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI 28 Từ phát sinh chủng loại dựa trình tự gen trnH-psbA, ta thấy lồi Cunninghamia lanceolata có quan hệ gần gũi với loài theo thứ tự nhƣ sau: Cunninghamia lanceolata isolate ,Glytostrobus pensilis, Taxodium distichum, Metasequoia glyptostroboides, Sequoia sempervirens, Taiwania flousiana 3.3.4 Trình tự đoạn gen ITS2 Trình tự gen ITS2 đƣợc phân tích có kích thƣớc, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu Sa mộc nhƣ sau: ATGCGATACTTAGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAATCATCGA GTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCGAGGGCACGTCT GCTTGGGCGTCGCACTCCAAAGTCGCCCTCCAGGACGGAGGAGCGG AGATGGTCGTCCGTGCCCGTCGGCGGTGCGGTCGGCTGAAATGAGCA CGAGGTCCGTCGCCCCGACGCGACGAGCGGTGGCCCATCCGGGTCGG CGTTGGTTTGCGCGGGGCGGACGAGGCCGAGCGTGGAACTTTAGCCG GGACACGGCGGCTCGCCAACGCGCGGGCATACGCCGGGTCCCTGTCG CGTCCCCAGGTCAGGCGTGAATACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAAT AAGCGGAGGA Từ tƣơng đồng trình tự, chúng tơi nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể lồi Sa mộc Do tơi lấy trình tự để phân tích So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen ITS2 lồi Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook, cơng bố ngân hàng gen NCBIvới mã số AF387523.1với lồiCunninghamia lanceolata isolate có mã số MF349136.1 ngân hang gen NCBI ta có: Sự sai khác trình tự đoạn gen đƣợc thể nhƣ sau: 29 Tỷ lệ tƣơng đồng 99% có điểm sai khác: Range 1: to 326GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score 597 bits(323) Query 21 Expect Identities Gaps 8e-167 325/326(99%) 0/326(0%) TGCAGAATCCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCGA Strand Plus/Plus 80 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct TGCAGAATCCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCGA 60 Query 81 GGGCACGTCTGCTTGGGCGTCGCACTCCAAAGTCGCCCTCCAGGACGGAGGAGCGGAGAT 140 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 Query 141 GGGCACGTCTGCTTGGGCGTCGCACTCCAAAGTCGCCCTCCAGGACGGAGGAGCGGAGAT 120 GGTCGTCCGTGCCCGTCGGCGGTGCGGTCGGCTGAAATGAGCACGAGGTCCGTCGCCCCG 200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 GGTCGTCCGTGCCCGTCGGCGGTGCGGTCGGCTGAAATGAGCACGAGGTCCGTCGCCCCG 180 Query 201 ACGCGACGAGCGGTGGCCCATCCGGGTCGGCGTTGGTTTGCGCGGGGCGGACGAGGCCGA 260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 ACGCGACGAGCGGTGGCCCATCCGGGTCGGCGTTGGTTTGCGCGGGGCGGACGAGGCCGA 240 Query 261 GCGTGGAACTTTAGCCGGGACACGGCGGCTCGCCAACGCGCGGGCATACGCCGGGTCCCT 320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 241 Query 321 GCGTGGAACTTTAGCCGGGACACGGCGGCTCGCCAACGCGCGGGCATATGCCGGGTCCCT GTCGCGTCCCCAGGTCAGGCGTGAAT 300 346 |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 GTCGCGTCCCCAGGTCAGGCGTGAAT 326 Hình 3.9 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS2 loài Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hookvà loài Cunninghamia lanceolata isolate Từ hình chúng tơi nhận thấy có điểm sai khác trình tự gen trnHpsbA nghiên cứu với trình tự đoạn gen ITS2 lồi Cunninghamia lanceolata isolate biết trƣớc 1.Thay C T vị trí 309 Tiếp tục so sánh với đoạn gen ITS2 số lồi có trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST, thiết lập đƣợc phát sinh chủng loại nhờ phầm mềm tin sinh học 30 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Sa mộc đƣợc trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng với loài Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ Cunninghamia lanceolata tƣơng AF387523.1 100% Cunninghamia lanceolata isolate đồng MF349136.1 99% Sequoia sempervirens HQ414215.1 91% Taxodium distichum AF387256.1 90% Taiwania flousiana AF387524.1 90% Metasequoia glyptostroboides AF387527.1 91% Glytostrobus pensilis KF977876.1 91% Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể hình 3.10 Hình 3.10 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS2 tạo NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa trình tự gen ITS2, ta thấy lồi Cunninghamia lanceolata có quan hệ gần gũi với loài theo thứ tự nhƣ sau: Cunninghamia lanceolata isolate ,Glytostrobus pensilis, Taxodium distichum, Metasequoia glyptostroboides, Sequoia sempervirens, Taiwania flousiana 31 3.3.5 Trình tự gen ITS Trình tự gen ITS đƣợc phân tích có kích thƣớc, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen ITS mẫu Sa mộc nhƣ sau: AGTGAACCTGCGGTAGGATCATTGTCGGTTCGGGGCCCCGAAT TGTGTAGGGGGGAGGCGAACGAGGCCGTCAGGCCGGACTCGTCTCCT GTCCCGGCCCTCGCTCTCGACGGCGTGTGGGCGATCGGACACCGCAG AGCGGCTCCGCAGGTAGTCCATATCGCCGTCGGCCCGAGGTGATCGA GGGCCGCGGTCGAGCGCATCTCCTTCGGCGTGGCGAGTCGTCGTGTC CGATTTCGATTGCGACGGGTGCATCTCGGCGACGTCCGTCGCCGGGG GGTCCTGCCCCGTCGCGTCGGAAGAGGTTCGGCCATCGCCCGCGGAG GCGGGGTGCCTCGGCTGCGCGCGCGGCCGTTAAGACCAGGGATCCGT CGGCTTTACGGCGGCAAGTCGGGTCGGCCGCAATCCCCCCCGTTGCG TCGCCCAGGGGGCTACGCCGTTTGGAGCGCTCCTCGCCGCGGACGGG TGCACTCGCGTAAATCGCGGGGCAGGACCCCCCGTCCGGCTGCGCGG TTCTCTCGAGGCGGCCTCTACCTCCGCGGCGCGGCGGGGCGGGGACA CGCCGTTCCCCGGTGCCCCTCTCGGGAGGCCTCGCCCTCTCGAGCCG GGGGAATCGTGGGACGGATCGTGTCAAACCCTACACGCATCGGTGCA ACCCGCACCAATTTAAAACGCCAACACTTAAGTGCGGTCGGGACGCC ATGCGCGTCTCGGCCGCCGGTAAACAACGAGAACAACACGACTCTCG GCAACGGATATCTCGGCTCTCGCCACGATGAAGAATGTAGCGAAATG CGATACTTAGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAATCATCGAGTCTTTG AACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCGAGGGCACGTCTGCTTGGG CGTCGCACTCCAAAGTCGCCCTCCAGGACGGAGGAGCGGAGATGGT CGTCCGTGCCCGTCGGCGGTGCGGTCGGCTGAAATGAGCACGAGGTC CGTCGCCCCGACGCGACGAGCGGTGGCCCATCCGGGTCGGCGTTGGT TTGCGCGGGGCGGACGAGGCCGAGCGTGGAACTTTAGCCGGGACAC GGCGGCTCGCCAACGCGCGGGCAT 32 Từ tƣơng đồng trình tự, chúng tơi nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Sa mộc Do tơi lấy trình tự để phân tích So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen ITS loài Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook, công bố ngân hàng gen NCBI với mã số KP093072.1với lồi Cunninghamia lanceolata isolate có mã số MF349136.1 ngân hang gen NCBI ta có: Sự sai khác trình tự đoạn gen đƣợc thể nhƣ sau: Tỷ lệ tƣơng đồng 99% có điểm sai khác: Range 1: to 792GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alig nment stati sti cs fo r matc h #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1424 bits(1578) 0.0 791/792(99%) 0/792(0%) Plus/Plus Query 308 CGGCCATCGCCCGCGGAGGCGGGGTGCCTCGGCTGCGCGCGCGGCCGTTAAGACCAGGGA 367 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct CGGCCATCGCCCGCGGAGGCGGGGTGCCTCGGCTGCGCGCGCGGCCGTTAAGACCAGGGA 60 Query 368 TCCGTCGGCTTTACGGCGGCAAGTCGGGTCGGCCGCAATcccccccGTTGCGTCGCCCAG 427 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 Query 428 TCCGTCGGCTTTACGGCGGCAAGTCGGGTCGGCCGCAATCCCCCCCGTTGCGTCGCCCAG 120 GGGGCTACGCCGTTTGGAGCGCTCCTCGCCGCGGACGGGTGCACTCGCGTAAATCGCGGG 487 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 GGGGCTACGCCGTTTGGAGCGCTCCTCGCCGCGGACGGGTGCACTCGCGTAAATCGCGGG 180 Query 488 GCAGGACCCCCCGTCCGGCTGCGCGGTTCTCTCGAGGCGGCCTCTACCTCCGCGGCGCGG 547 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 GCAGGACCCCCCGTCCGGCTGCGCGGTTCTCTCGAGGCGGCCTCTACCTCCGCGGCGCGG 240 Query 548 CGGGGCGGGGACACGCCGTTCCCCGGTGCCCCTCTCGGGAGGCCTCGCCCTCTCGAGCCG 607 ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 CGGGGCGGGAACACGCCGTTCCCCGGTGCCCCTCTCGGGAGGCCTCGCCCTCTCGAGCCG 300 Query 608 GGGGAATCGTGGGACGGATCGTGTCAAACCCTACACGCATCGGTGCAACCCGCACCAATT 667 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 GGGGAATCGTGGGACGGATCGTGTCAAACCCTACACGCATCGGTGCAACCCGCACCAATT 360 Query 668 TAAAACGCCAACACTTAAGTGCGGTCGGGACGCCATGCGCGTCTCGGCCGCCGGTAAACA 727 Sbjct 361 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAAACGCCAACACTTAAGTGCGGTCGGGACGCCATGCGCGTCTCGGCCGCCGGTAAACA 33 420 Query 728 ACGAGAACAACACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCCACGATGAAGAATGTA 787 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 ACGAGAACAACACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCCACGATGAAGAATGTA 480 Query 788 GCGAAATGCGATACTTAGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGC 847 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 481 GCGAAATGCGATACTTAGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGC 540 Query 848 AAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCGAGGGCACGTCTGCTTGGGCGTCGCACTCCAAAGTCG 907 Sbjct 541 AAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCGAGGGCACGTCTGCTTGGGCGTCGCACTCCAAAGTCG 600 Query 908 CCCTCCAGGACGGAGGAGCGGAGATGGTCGTCCGTGCCCGTCGGCGGTGCGGTCGGCTGA 967 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 601 CCCTCCAGGACGGAGGAGCGGAGATGGTCGTCCGTGCCCGTCGGCGGTGCGGTCGGCTGA 660 Query 968 AATGAGCACGAGGTCCGTCGCCCCGACGCGACGAGCGGTGGCCCATCCGGGTCGGCGTTG 1027 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 661 Query 1028 AATGAGCACGAGGTCCGTCGCCCCGACGCGACGAGCGGTGGCCCATCCGGGTCGGCGTTG 720 GTTTGCGCGGGGCGGACGAGGCCGAGCGTGGAACTTTAGCCGGGACACGGCGGCTCGCCA 1087 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 721 GTTTGCGCGGGGCGGACGAGGCCGAGCGTGGAACTTTAGCCGGGACACGGCGGCTCGCCA Query 1088 ACGCGCGGGCAT 780 1099 |||||||||||| Sbjct 781 ACGCGCGGGCAT 792 Hình 3.11 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS loài Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hookvà loài Cunninghamia lanceolata isolate Từ hình chúng tơi nhận thấy có điểm sai khác trình tự gen trnHpsbA nghiên cứu với trình tự đoạn gen ITS loài Cunninghamia lanceolata isolate biết trƣớc 1.Thay G A vị trí 548 Tiếp tục so sánh với đoạn gen ITS số lồi có trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST, thiết lập đƣợc phát sinh chủng loại nhờ phầm mềm tin sinh học 34 Một số lồi có trình tự gen ITS tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Sa mộc đƣợc trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng với loài Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ Cunninghamia lanceolata AF387523.1 tƣơng 100% Cunninghamia lanceolata isolate đồng K3P093072.1 99% Sequoia sempervirens HQ414215.1 79% Taxodium distichum AF387256.1 78% Taiwania flousiana AF387524.1 82% Metasequoia glyptostroboides AF387527.1 79% Glytostrobus pensilis KF977876.1 78% Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể hình 3.12 Hình 3.12 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS2 tạo NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa trình tự gen ITS, ta thấy lồi Cunninghamia lanceolata có quan hệ gần gũi với loài theo thứ tự nhƣ sau: Cunninghamia lanceolata isolate ,Glytostrobus pensilis, Taxodium distichum, Metasequoia glyptostroboides, Sequoia sempervirens, Taiwania flousiana 35 3.3.6 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnHpsbA, ITS2, ITS Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen matK, rbcL trnHpsbA,ITS2, ITS với trình tự gen loài, ta lập đƣợc bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA,ITS2, ITS nhƣ sau: Bảng 3.6 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA,ITS2 Tên đoạn gen MatK RbcL trnH- ITS2 ITS psbA Số điểm sai khác 1 1 Kích thƣớc trình 890 599 621 381 1099 0.17% 0.16% 6.82% 0.09% tự Tỷ lệ sai khác 0.11 Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK Cunninghamia lanceolata với Cunninghamia lanceolata isolate có điểm sai khác,rbcL, trnHpsbA đoạn rbcL có điểm sai khác Tỷ lệ sai khác matK, rbcL, trnHpsbA ITS2, ITS lần lƣợt (0.11% :0.17% : 0,16%:6,82%, 0,09%) Tỉ lệ sai khác gen ITS2 cao 6.82% Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định xác lồi cần định danh 36 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã thu thập đƣợc đầy đủ 03 mẫu Sa mộc (Cunninghamia lanceolata) Tách chiết đƣợc DNA tổng số 03/03 mẫu lồi Sa mộc (Cunninghamia lanceolata) Nhân thành cơng đoạn gen matK, rbcL trnH-psbA, ITS2, ITS từ DNA tổng số Sa mộc kỹ thuật PCR Xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen matK, rbcL trnHpsbA, ITS2, ITS loài 4.2 Kiến nghị Đƣa trình tự gen matK, rbcL trnH-psbA, ITS2, ITS lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau Tiếp tục thu thập mẫu Sa mộc nghiên cứu thêm để đánh giá tồn diện tính đa dạng di truyền loài Nghiên cứu ứng dụng mã vạch ADN để xây dựng sở liệu DNA barcode cho loài thực vật Việt Nam Sử dụng kết hợp đoạn gen matK, rbcL trnH-psbA vào việc giám định loài Sa mộc Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [2] Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoesis), Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, pp 123124 [3] Nguyễn Đức Lƣợng (2002), Công nghệ gen, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [4] Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2008), Công nghệ sinh học, tập 2, Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ [5] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật TIẾNG ANH [6] Alvarez I.W.J.F (2003), Ribosomal ITS sequences and plant phylogentic inference, Molecµlar Phylogentics ang Evolution, 29, pp 417-434 [7] Bailey C.D.C.T.G Harris S.A Hughes C.E (2003), Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes, Molecµlar Phylogentics and Evolution, 29, pp 435-455 [8] B.H.M (1999), Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation, Molecµlar Ecology, 8: 513-525 [9] CBOL Plant Working Group (2009), A DNA barcode for land plants, 106: 12794-12797 [10] Chen S.Y.H Han J Liu C Song J Et Al (2010), Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcodes for identyfying medicinal plant species, PloS ONE 5: e8613 [11] Fazekas A.J.S.R Newmaster S.G Hollingsworth P.M (2010), Stopping the stutter : Improvements in sequence quality from regions with mononucleotide repeats can increase the usefµlness of non - coding regions for DNA barcoding, Taxaon, 59: 694-697 [12] Gao T.Y.H Song J Liu C Zhu Y Et Al (2010), Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 116-121 [13] Gonzalez M.A.B.C Engel J Mori S.A Pe Tronelli P Et Al (2009), Identification of Amazonian trees with DNA barcodes, PloS ONE, 4:e7483 [14] Hebert P.D.N., C.A Ball S.L., De Waard J.R (2003), Biological indentification through DNA barcodes, Proc R Soc Land B Biol Sci, 270: 313321 [15] Hilu K.W.L.H (1997), The matK gene: sequence variation and application in plant systematics, American Journal of Botany, 84: 830-839 [16] Hollingsworth Pm, G.S Little Dp (2011), Choosing and using a Plant DNA barcode, PLoS ONE, 65 [17] Jaakola L.S.M Haggman H (2010), Novel approaches based on DNA barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species, Food Chemistry, 123, pp 494-500 [18] J.S (2001), Biogcographic patterns and cryptic speciation in bryophytes, Journal of Biogcography, 28: 253-261 [19] Kress, J.W., K.J., Zimmer, E.A., Weigt, L.A & Janzen, D.H (2005), Use of DNA barcodes to identify flowering plants, Proc Natl Acad Sci USA, 102: 8369-8374 [20] Lahaye R.V.D.B.M Bogarin D.Warner J Pupµlin F Et Al (2008), DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots, PNAS, 105: 2923-2928 [21] Mark Y.S.H.P.D.N (2008), Barcode of Life, Scientific American, pp 8288 [22] Miwa H., O.I Matsuia, Hascgawa M, Akiyama H, Et Al (2009), Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, Bryophytes), Gene, 441: 169175 [23] Ogden R M.H.N Cowan R.S Chua L Groves M Et Al (2008), SNP based method for the genetic identification of ramin Gonystylus spp Timber and products: applied research meeting CITES enforcement needs, Endangered Species Research, 9: 255-261 [24] Ratnasingham S.H.P.D.N (2007), BOLD: the barcode of life data system, Mol Ecol Notes, 7, pp 355-364 [25] Ren B.Q.X.X.G Chen Z.D (2010), Species identification of Alnus (Betµlaceae) using nrDNA and cpDNA genetic markers, Molecµlar Ecology Resources, 10: 594-605 [26] Saunders, G.W (2005), Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary appraisal holds promise for future applications, Phil Trans R Soc B, 360, pp 1879-1888 [27] Shaw J.L.E.B Schilling E.E Small R.L (2007), Comparison of whole chloropast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III, American Journal of Botany, 94: 275-288 [28] Srimara R.S.U Sreejayan N Ravikanth G Gurumurthy Br Et Al (2010), Assesing species admixtures in raw drug trade of Phyllanthus, a hepatoprotective plant using molecµlar tools, Journal of Ethnopharmacology, 130: 208-215 [29] Stech M.K.E Loonen Mjje, Vrieling K Kruijer J.D (2011), Bryophyte DNA sequences from faeces of an arctic herbivore, barnacke goose (Branta leucopsis), Molecµlar Ecology Resources, 11, pp 404-408 [30] Tautz, D Arctander, P Minelli, A Thomas, R.H & Vogler, A.P (2003), A plea for DNA taxanomy, Trends Ecol., 18: 70-74 [31] Von Crautlein M.K.H Pietilainen M Rikkinen J (2011), DNA barcoding: a tool for improved taxon identification and detection of species diversity, Biodiversity and Conservation, 20: 373