Nghiên cứu xác định các đoạn dna barcode cho loài áo cộc (lirodendron chinense) phục vụ giám định loài

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐOẠN DNA BARCODE CHO LOÀI ÁO CỘC (LIRIODENDRON CHINENSE) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LOÀI NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Bùi Thị Mai Hương Sinh viên thực : Trần Phương Thảo Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình tơi suốt q trình thực khóa luận trường, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Phong, TS Bùi Thị Mai Hương tận tình giúp đỡ bảo tơi q trình hồn thành khóa luận Đặc biệt, đề tài “Nghiên cứu xác định đoạn DNA barcode cho Loài Áo cộc (Liriodendron chinense) phục vụ giám định loài” TS Nguyễn Văn Phong làm Chủ nhiệm Với kiến thức kỹ thầy cô truyền dạy khơng giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn tài sản q báu theo giúp tơi sau Cảm ơn anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học quan tâm giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên hỗ trợ suốt thời gian qua Mặc dù cố gắng chắn khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót Vì vậy, tơi mong nhận ý kiến đánh giá, góp ý để tạo tiền đề vững cho công việc sau Xuân Mai, ngày … tháng … năm 2020 Sinh viên Trần Phương Thảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 11 1.1 Tổng quan Áo cộc: 11 1.1.1 Phân loại khoa học: 11 1.1.2 Phân bố: .11 1.1.3 Đặc điểm sinh học: 12 1.1.4 Giá trị sử dụng: 14 1.1.5 Một số đề tài nghiên cứu có liên quan đến lồi Áo cộc trích dẫn đánh giá tổng quan: .14 1.2 Tổng quan DNA barcode (DNA mã vạch): 15 1.2.1 Giới thiệu mã vạch DNA barcode: .15 1.2.2 Một số DNA barcode sử dụng: 17 1.2.3 Ứng dụng DNA barcode thực vật: .24 CHƯƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu: 26 2.2 Nội dung nghiên cứu: 26 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu: 26 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu: .26 2.3.2 Hóa chất sử dụng: 26 2.3.3 Thiết bị sử dụng: 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu: .28 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số: 35 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kĩ thuật PCR: 35 3.3 Phân tích kết quả: 36 3.3.1 Xác định phân tích trình tự DNA vùng gen nghiên cứu: 36 3.3.2 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự: 49 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 4.1 Kết luận: 51 4.2 Kiến nghị: 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Bp Base pair Cặp base CBOL Consortium for the Barcode Consortium for the Barcode of of Life Life Convention on International CITES Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora cpDNA CTAB Cytb 10 DNA Công ước bn bán quốc tế lồi nguy cấp Chloroplast DNA Bộ gen lục lạp Cetyl trimethylammonium Cetyl trimethylammonium bromide bromide Cytochrome b Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid triphosphate triphosphate (DNA) 11 dNTP 12 EBA Extraction Buffer A Đệm tách A 13 EBB Extraction Buffer B Đệm tách B Ethylenediaminetetraacetic Axit ethylenediamine acid tetraacetic 14 EDTA 15 F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi 16 IGS Intergenic Spacer Vùng liên gen 17 ITS Internal Transcribed Spacer Vùng DNA nằm gen 18 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base 19 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể 20 NAD(P)H Nicotinamide adenine Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate National Center for Trung tâm Quốc gia Thông Biotechnology Information tin Công nghệ sinh học 21 NCBI 22 ORF Open Reading Frame Khung đọc mở 23 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase 24 PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone 25 RFLP 26 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 27 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 28 SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate 29 R-Primer Reverse primer Mồi ngược Restriction fragment length polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA 30 TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA 31 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 31 UV Untraviolet Tia cực tím DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 – Hình thái Áo cộc 12 Hình 1.2 – Hình thái Áo cộc 13 Hình 1.3 – Hình thái hoa Áo cộc .13 Hình 1.4 – Hình thái Áo cộc .13 Hình 3.1 – Kết tách chiết DNA tổng số mẫu Áo cộc 35 Hình 3.2 - Kết PCR gen matK, TrnH-psbA, rbcL, ITS2 mẫu Áo cộc .36 Hình 3.3 - Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK .38 Hình 3.4 - Sự sai khác trình tự đoạn gen matK lồi Áo cộc với trình tự với trình tự gen lồi Liriodendron chinenes 40 Hình 3.5 - Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL .42 Hình 3.6 - Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL lồi Áo cộc với trình tự với trình tự gen lồi Liriodendron chinenes .45 Hình 3.7 - Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn TrnH-psbA 46 Hình 3.8 - Sự sai khác trình tự đoạn gen TrnH-psbA lồi Áo cộc với trình tự với trình tự gen loài Liriodendron chinenes 48 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 – Phân loại khoa học Áo cộc .11 Bảng 1.2 - Thông tin số mồi DNA barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 21 Bảng 2.1 - Thành phần đệm tách A 26 Bảng 2.2 - Thành phần đệm tách B 27 Bảng 2.3 - Thành phần đệm TE .27 Bảng 2.4 - Trình tự thông tin cặp mồi sử dụng .31 Bảng 2.5 - Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 3.1 - Một số lồi có trình tự đoạn gen matK tương đồng với loài Áo cộc .37 Bảng 3.2 - Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI đoạn trình tự matK 38 Bảng 3.3 - Một số loài có trình tự gen rbcL tương đồng với lồi Áo cộc .42 Bảng 3.4 - Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI đoạn trình tự rbcL .43 Bảng 3.5 – Một số lồi có trình tự gen TrnH-psbA tương đồng với loài Áo cộc 46 Bảng 3.6 - Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI đoạn trình tự TrnH-psbA 47 Bảng 3.7 - Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL, TrnH-psbA .49 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Áo Cộc (Liriodendron chinense) loài địa Châu Á miêu tả khoa học lần năm 1903, ghi sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “bị đe dọa” (T), nhóm thực vật bị đe dọa VU A1c, d, B1+2b, e (sách đỏ Việt Nam , 2007), sách đỏ giới (IUCN) (2014) với trạng thái nguy thấp/ gần bị đe dọa (Status: Lower Risk/near threatened ver 2.3) Chi Liriodendron thuộc họ Magnoliaceae phát triển từ loại gốc Oligocene, phù hợp với khí hậu ấm áp Hiện có hai lồi cịn lại chi này, L.tulipifera phân bố phía đơng Hoa Kỳ, lại L.chinense (Áo cộc) nằm vùng núi có độ cao 450 m đến 1800 m miền nam Trung Quốc miền bắc Việt Nam Hình dáng tổng thể Áo cộc gọn gàng, số có bóng mát lớn, có hình dạng áo phơng, mùa thu sắc chuyển từ vàng sang xanh lá, hoa màu vàng có hình dạng giống hoa tulip Áo cộc mười sáu kiểu che phủ rừng, mức độ thống trị loài tạo khác biệt cộng đồng sinh thái [20], khơng cịn có giá trị nguồn mật hoa để sản xuất mật ong, nguồn thực phẩm hoang dã, lồi cho bóng mát lớn đồn điền đô thị [2] Gỗ loài sử dụng loạt sản phẩm thiết yếu như: nội thất, pallet, khung xây dựng [5], [15] Ngồi ra, chiết xuất hóa học từ gỗ chứng minh hữu ích có tác dụng chống khối u, chống đơng máu cho lồi động vật ăn cỏ [11] alcaloid kháng khuẩn [1] Tuy nhiên, Áo cộc bị đe dọa liệt kê danh sách lồi thực vật có nguy tuyệt chủng hiệu sinh sản thấp (Fu, Jin 1992, Wang cộng sự, 2012), tỷ lệ nảy mầm hạt thấp, điều ảnh hưởng lớn tới việc nhân giống phổ biến nhanh chóng loài GGTGTTTAAGATTATAAACTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGA TACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACTCGGAGTTCCGCCTG AGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAAC TGTGTGGACCGATGGACTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTAC CACATCGAACCCGTTGCTGGGGAGACCGATCAATATATTGTTTATGTAGCTTA CCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGT GGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGC GAATTCCTCCTGCTTATATCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCCCATGGCATCCAA GTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTA TTAAACCAAAATTGGGGTTATCCGCCAAGAACTACGGTAGGGCGGTTTATGA ATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTACCAAGGATGATGAGAACGTGAACTCCC AACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCTTATTTTGTGCCGAAGCACTTTAT AAAGCGCAGGCCGAAACAGGTGAAATCAAAGGGCATTACTTGA Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen rbcL loài Áo cộc cách sử dụng cơng cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Áo cộc trình bày bảng 3.3 41 Bảng 3.3 - Một số lồi có trình tự gen rbcL tương đồng với loài Áo cộc ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Liriodendron chinense KU170538.1 Liriodendron tulipifera MK477550.1 Degeneria vitiensis L12643.1 Magnolia decidua NC_042680.1 Kết xây dựng phát sinh chủng loại phần mềm Mega X thể hình 3.5 Hình 3.5 - Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo MegaX 42 Bằng phần mềm Mega X nhận khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác sau Bảng - Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI đoạn trình tự rbcL Magnolia decidua Magnolia decidua Liriodendron tulipifera Liriodendron chinense Degeneria vitiensis Áo cộc Li L Degeneria tulipifera chinense vitiensis Áo cộc 0.02713 0.02713 0.01195 0.03331 0.00297 0.02409 0.00894 0.02409 0.00894 0.03025 Từ phát sinh chủng loại khoảng cách di truyền dựa số liệu trình tự đoạn gen rbcL ta thấy: lồi Áo cộc có quan hệ gen gần với loài Liriodendron chinense, Liriodendron tulipifera với khoảng cách di truyền 0.0084 xa với loài Magnolia decidua với khoảng cách di truyền 0.03331 Sau chúng tơi so sánh cấp độ loài theo đoạn gen rbcL loài Áo cộc với trình tự với trình tự gen lồi Liriodendron chinense công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KU170535.1, nhận sai khác đoạn gen thể sau: Score Expect Identities Gaps Strand 1216 bits(658) 0.0 670/676(99%) 0/676(0%) Plus/Plus Query GGTGTTTAAGATTATAAACTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGAT |||||| |||| || ||| ||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 43 60 Sbjct GGTGTTAAAGAGTACAAATTGAATTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGAT 60 Query 61 ATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACTCGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 ATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACTCGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCT 120 Query 121 GCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACTTACC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 GCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACTTACC 180 Query 181 AGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAACCCGTTGCTGGGGAGACCGAT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 AGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAACCCGTTGCTGGGGAGACCGAT 240 Query 241 CAATATATTGTTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAAC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 CAATATATTGTTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAAC 300 Query 301 ATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACGTCTG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 ATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACGTCTG 360 Query 361 GAAGATCTGCGAATTCCTCCTGCTTATATCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCCCATGGCATC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 GAAGATCTGCGAATTCCTCCTGCTTATATCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCCCATGGCATC 420 Query 421 CAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAA 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 CAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAA 480 Query 481 CCAAAATTGGGGTTATCCGCCAAGAACTACGGTAGGGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGT 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 481 CCAAAATTGGGGTTATCCGCCAAGAACTACGGTAGGGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGT 540 Query 541 GGACTTGATTTTACCAAGGATGATGAGAACGTGAACTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 44 Sbjct 541 GGACTTGATTTTACCAAGGATGATGAGAACGTGAACTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGA 600 Query 601 GACCGTTTCTTATTTTGTGCCGAAGCACTTTATAAAGCGCAGGCCGAAACAGGTGAAATC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 601 GACCGTTTCTTATTTTGTGCCGAAGCACTTTATAAAGCGCAGGCCGAAACAGGTGAAATC Query 661 AAAGGGCATTACTTGA 660 676 ||||| |||||||||| Sbjct 661 AAAGGACATTACTTGA 676 Hình 3.6 - Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL lồi Áo cộc với trình tự với trình tự gen loài Liriodendron chinenes (sự sai khác đánh dấu đỏ) Từ kết thu được, nhận thấy tỷ lệ tương đồng trình tự gen rbcL lồi Áo cộc với trình tự đoạn gen rbcL lồi Liriodendron chinense NCBI 99%, có nucleotide sai khác  Trình tự DNA gen TrnH-psbA: Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen TrnH-psbA nhân có kích thước 382 bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu Kết giải trình tự đoạn gen TrnH-psbA mẫu Áo cộc sau: TATTTAAAGGATTCAATTTTCCCCCTTCATGATTTTTTTATTGGGTTTTTTTT TCTTTTTGGGATACAGATTTTGAACATAAAATGCCAATACTGTAAATTGTA AAAGTTCAAAAAAAAATTCCTTTTTGAAAAAAAAAAAAAAGAAAACAAT TTTGAGGAACGTACAGAAATTACAGTACAGATCGGCACAGAACAAAAAA AAAAATAGGATGTTCGATCATGACCCACCCAACAATAATATTTTCTTAATT TGAAAAAAAAAAATGAAAAGGGCAAAAATGTTTATGTGAGTAAAACCCT ACGGAATCAAACAAATCAATACCCAACTTCTTCATAAAACAAAAATTGGG GTATTGATCTGATCCTTCACCGACTCATAT Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen 45 TrnH-psbA loài Áo cộc cách sử dụng công cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với lồi Áo cộc trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 – Một số lồi có trình tự gen TrnH-psbA tương đồng với loài Áo cộc ngân hàng gen NCBI Mã số STT Tên loài Liriodendron chinenes KU170538.1 Liriodendron tulipifera MK477550.1 Ocotea puberula GQ982304.1 Filipendula glaberrima MH593675.1 Kết xây dựng phát sinh chủng loại phần mềm Mega X thể hình 3.7 Hình 3.7 - Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn TrnH-psbA tạo MegaX 46 Bằng phần mềm Mega X nhận khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác sau Bảng 3.6 - Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI đoạn trình tự TrnH-psbA Ocotea puberula L L Filipendula tulipifera chinense glaberrima Áo cộc Ocotea puberula Liriodendron tulipifera 3.1695 Liriodendron chinense 2.9306 3.4967 Filipendula glaberrima 4.7727 2.3509 4.3353 Áo cộc 3.3969 3.4784 0.0869 4.3803 Từ phát sinh chủng loại khoảng cách di truyền dựa số liệu trình tự đoạn gen TrnH-psbA ta thấy: lồi Áo cộc có quan hệ gen gần với lồi Liriodendron chinense, với khoảng cách di truyền 0.0869 xa với loài Filipendula glaberrima với khoảng cách di truyền 4.3803 Sau chúng tơi so sánh cấp độ loài theo đoạn gen TrnH-psbA loài Áo cộc với trình tự với trình tự gen lồi Liriodendron chinense công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KU170535.1, nhận sai khác đoạn gen thể sau: Score Expect Identities Gaps Strand 534 bits(289) 1e-156 351/382(92%) 0/382(0%) Plus/Plus Query TATTTAAAGGATTCAATTTTCCCCCTTCATGAtttttttattgggtttttttttcttttt 60 ||| ||||||||||||||| | || ||||||||| || ||||| || ||| || |||| | Sbjct TATATAAAGGATTCAATTTCCACCATTCATGATTATTGTATTGAGTCTTTCTTACTTTCT 47 60 Query 61 GGGATACAGATTTTGAACATAAAATGCCAATACTGTAAATTGTAAAAGTTCaaaaaaaaa 120 | ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| || |||||||||| Sbjct 61 GAGATACAGATATTGAACATAAAATGCCAATACTGTAAATTGTAAATGTACAAAAAAAAA 120 Query 121 ttcctttttgaaaaaaaaaaaaaagaaaaCAATTTTGAGGAACGTACAGAAATTACAGTA 180 ||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 TTCCTTTATGAAAAAAAAAAAAAAGAAAACAATTTTGAGGAACGTACAGAAATTACAGTA 180 Query 181 CAGATCGGCACAGAACaaaaaaaaaaaTAGGATGTTCGATCATGACCCACCCAACAATAA 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| |||||||||| Sbjct 181 CAGATCGGCACAGAACAAAAAAAAAAATAGGATGTTCGATCATGAACCAACCAACAATAA 240 Query 241 TATTTTCTTAATTTGaaaaaaaaaaaTGAAAAGGGCAAAAATGTTTATGTGAGTAAAACC 300 ||||||||||| |||||| ||| ||||||||| |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TATTTTCTTAAGTTGAAAGAAAGAAATGAAAATGGCAAAAATGTTTATGTGAGTAAAACA 300 Query 301 CTACGGAATCAAACAAATCAATACCCAACTTCTTCATAAAACAAAAATTGGGGTATTGAT 360 |||| ||||| |||| |||||||||||||||||||||| ||||| || | |||||||||| Sbjct 301 CTACTGAATCGAACAGATCAATACCCAACTTCTTCATAGAACAAGAAGTTGGGTATTGAT Query 361 CTGATCCTTCACCGACTCATAT 360 382 ||||||||||| |||||||||| Sbjct 361 CTGATCCTTCAACGACTCATAT 382 Hình 3.8 - Sự sai khác trình tự đoạn gen TrnH-psbA lồi Áo cộc với trình tự với trình tự gen lồi Liriodendron chinenes (sự sai khác đánh dấu đỏ) Từ kết thu được, nhận thấy tỷ lệ tương đồng trình tự gen TrnH-psbA lồi Áo cộc với trình tự đoạn gen TrnH-psbA loài Liriodendron chinense NCBI 92%, có 29 nucleotide sai khác 48 3.3.2 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự: Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen matK, rbcLvà TrnH-psbA Áo cộc với trình tự gen lồi Liriodendron chinenescơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KU170535.1, ta lập bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL TrnH-psbA bảng 3.7 Bảng 3.7 - Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL, TrnH-psbA Tên đoạn gen matK rbcL TrnH-psbA 29 Kích thước trình tự 543 658 382 Tỷ lệ sai khác 0% 0,9% 7,6% Số điểm sai khác Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK, rbcL TrnH-psbA lồi Áo cộc với trình tự gen lồi Liriodendron chinenes cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KU170535.1 : trình tự đoạn gen matK có điểm sai khác, trình tự đoạn gen rbcL có điểm sai khác trình tự đoạn gen TrnHpsbA có 29 điểm sai khác Tỉ lệ sai khác trình tự TrnH-psbA cao (7,6%) khả phân biệt loài gen TrnH-psbA tốt tỉ lệ sai khác trình tự matK thấp (0%) đồng nghĩa với khả phân biệt loài gen Như vậy, đoạn TrnH-psbA có khả phân biệt cao so với đoạn matK rbcL so sánh loài Áo cộc với loài Liriodondren chinense Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự matK, rbcL TrnH-psbA để xác định xác loài cần định danh 3.2 Thảo luận: Với thị matK chúng tơi thu kết lồi Áo cộc chúng tơi nghiên cứu giống 100% với lồi Áo cộc Trung Quốc lấy ngân hàng gen NCBI Và có sai khác nhỏ với lồi Liriodendron tulipifera Tuy nhiên lại sai khác 49 nhiều so với loài Magnolia pacifica Điều phù hợp với phân loại hình thái thực Yongda Zhong cộng (2018) Huang cộng (1999) loài Liriodendron tulipifera, ta thấy lồi có đặc điểm hình thái hoa giống nhau, nhiên lồi L.chinense có kích thước lớn hơn, nét cắt thùy sâu so với loài Áo cộc hoa lồi Áo cộc có màu cam lồi L.chinense có màu xanh lục vàng nhạt Với thị phân tử TrnH-psbA nhận lồi Áo cộc có quan hệ gần với loài Liriodendron chinense, với khoảng cách di truyền 0.0869 Như với thị cho thấy lồi Áo cộc chúng tơi lấy Việt Nam có sai khác với loài Áo cộc Trung Quốc Như giả định đặc điểm sinh thái Việt Nam Trung Quốc tác động đến sai khác Áo cộc mà chúng tơi nghiên cứu lấy trồng có nguồn gốc từ Trung Quốc Dựa vào kết so sánh đặc điểm hình thái với so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL, TrnH-psbA (Bảng 3.7) loài Áo cộc, ta thấy trình tự cho tỷ lệ sai khác khác không đồng 0%, 0.9% 7.6%; với khác biệt tương đối nhỏ đặc điểm hình thái lồi đem so sánh (Áo cộc L.chinense) Vì vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự matK, rbcL TrnH-psbA so sánh đặc điểm hình thái để xác định xác loài cần định danh 50 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: Đã tách chiết DNA tổng số 03/03 mẫu Áo cộc Đã nhân thành công gen matK, rbcL TrnH-psbA kỹ thuật PCR từ DNA tổng số mẫu thu Đã xác định trình tự đoạn gen matK, rbcL TrnH-psbA Áo cộc Đã xây dựng phát sinh chủng loại dịng Áo cộc Đoạn TrnH-psbA có khả phân biệt cao so với đoạn matK, rbcL so sánh loài Áo cộc với loài Liriodendron chinenese Kết phân tích đoạn gen TrnH-psbA phù hợp với kết hình thái cho thấy lồi Áo cộc có quan hệ gần với loài Liriodendron chinense Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định xác lồi cần định danh 4.2 Kiến nghị: Đưa trình tự gen matK, rbcL, TrnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau Tiếp tục thu thập mẫu Áo cộc vùng địa lý khác để đánh giá tồn diện tính đa dạng di truyền loài Nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA để xây dựng sở liệu DNA barcode cho loài thực vật Việt Nam Sử dụng gen matK, rbcL TrnH-psbA vào việc giám định loài Áo cộc Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể Nhân mã vạch DNA khác đối tượng Áo cộc 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH Bae K and Byun J Screening of leaves of higher plants for antibacterial action Kor J Pharmacogn 1987; 8:1 Beck DE Liriodendron tulipifera L Yellow-poplar In Silvics of North America Harwoods Edited by R.M Burns and B.H Honkala US Dep Agric Agric Handb 654 1990; 2:406-416 Chen S.Y.H Han J Liu C Song J Et Al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS ONE 5: e8613 Gao T.Y.H Song j Liu C Zhu Y Et Al (2010), “Identification of ITS2”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 116 – 121 Han Y, Chagne D, Gasic K, Rikkerink EH, Beever JE, Gardiner SE and Korban SS BAC-end sequence-based SNPs and Bin mapping for rapid integration of physical and genetic maps in apple Genomics 2009; 93:2828 Hebert P.D.N , C.A Ball S L , Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270, pp 313 – 321 Kress, J.W.Wurdack, K.J ,Zimmer, E A ,Weigt, L A & Janzen, D.H (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Molecular Econogy, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 8369 – 8374 Kress, W J., & Erickson, D L., “DNA barcodes: gens, genomics, and bioinformatics”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(8), pp 2761-2762, 2008 52 Li Bin, Lin Furong, Lu Chang, Cai Qifei, Zheng Yongqi, Liu Ru, “Propagation method for soft cuttings of Liriodendron”, 770-774, 2018 10 Mark Y S H.P.D.N (2008), “Barcode of life”, Scientific American, pp 82 – 88 11.Moon MK, Oh HM, Kwon BM, Baek NI, Kim SH, Kim JS and Kim DK Farnesyl protein transferase and tumor cell growth inhibitory activities of lipiferolide isolated from Liriodendron tulipifera Arch Pharm Res 2007; 30:299-302 12 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 13 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, (Hydrocotyle Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 14.Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 15.Williams RS and Feist WC Durability of yellow-poplar and sweetgum and service life of finishes after long-term exposure Forest Products J 2004; 54:96-101 16.Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and 53 systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 17.Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 18.Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 19.Yongda Zhong, Aihong Yang, Shujuan Liu, Lipan Liu, Yanqiang Li, Zhaoxiang Wu and Faxin Yu, “RAD-Seq Data Point to a Distinct Split in Liriodendron (Magnoliaceae) and Obvious East–West Genetic Divergence in L chinense”, 9-10, 2018 20.Zhang LJ, Oswald BP and Green TH Relationships between overstory species and community classification of the Sipsey Wilderness, Ala-bama For Ecol Manage 1999; 114:377-383 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 21.Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 22.Hà Văn Huân (2015), “Mã vạch DNA (DNA barcode): Nguyên lý ứng dụng”, Ngân hàng liệu DNA Việt Nam đăng ngày 13 tháng 12 năm 2015 23.Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123 – 124 24.Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191 -198 54 25.Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 26.Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 27.Nguyễn Thơng (2015), “Phân tích trình tự ITS matK họ gừng Zingiberaceae” TRANG WEB 28.https://vi.wikipedia.org/wiki/%C3%81o_c%E1%BB%99c_(th%E1%BB%B 1c_v%E1%BA%ADt) 55