Phân lập, sàng lọc chủng vibrio spp mang gen độc pira, pirb có khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (ahpnd) trên tôm thẻ chân trắng thu thập tại một số địa điểm ở hải phòng và nam định

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP, SÀNG LỌC CHỦNG VIBRIO SPP MANG GEN ĐỘC PIRA, PIRB CÓ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG THU THẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HẢI PHÒNG VÀ NAM ĐỊNH” Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP, SÀNG LỌC CHỦNG VIBRIO SPP MANG GEN ĐỘC PIRA, PIRB CÓ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG THU THẬP TẠI MỘT SỚ ĐỊA ĐIỂM Ở HẢI PHỊNG VÀ NAM ĐỊNH” Ngƣời thực hiện: PHẠM THÙY DƢƠNG Mã sinh viên: 637116 Lớp: K63CNSHB Giảng viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN THỊ NHIÊN Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn khóa luận đƣợc rõ nguồn gốc Sinh viên thực Phạm Thùy Dƣơng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập hồn thiện Khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh nỗ lực thân, nhận đƣợc động viên giúp đỡ tận tình từ thầy giáo, bạn bè gia đình Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn tới Giám đốc Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học, thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học quan tâm, dạy dỗ tơi q trình học tập rèn luyện trƣờng Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thị Nhiên – Giảng viên Bộ môn Động Vật, Học viện Nông nghiệp Việt Nam hƣớng dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện cho tơi để tơi hồn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp Và đặc biệt, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Yến – cán Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, dành nhiều thời gian, cơng sức giúp đỡ, động viên, góp ý, hƣớng dẫn tơi hồn thiện Khóa luận tốt nghiệp Ngồi ra, tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới CN Thái Minh Phƣơng CN Trần Thu Hà – cán nghiên cứu Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình bảo, giúp đỡ cho tơi ý kiến đóng góp bổ ích q trình thực Khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè động viên, ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2022 ( Ký ghi rõ họ tên ) ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ, KÝ TỰ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình dịch bệnh AHPND giới Việt Nam 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2.Tổng quan bệnh AHPND tôm 1.2.1 Biểu bệnh AHPND 1.2.2 Tác nhân gây bệnh AHPND 1.3.Một số phƣơng pháp phòng bệnh AHPND 14 1.3.1 Sử dụng thuốc kháng sinh 15 1.3.2 Sử dụng chế phẩm vi sinh 16 1.3.3 Bacteriophages 18 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.2 Phạm vi nghiên cứu 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.1 Thu thập mẫu phân lập Vibrio từ mẫu tôm mắc bệnh AHPND 19 2.3.2 Định danh sơ chủng Vibrio phƣơng pháp sinh hóa 19 2.3.3 Xác định chủng Vibrio mang gen độc tố PirA, PirB kỹ thuật PCR 19 iii 2.4 Máy móc thiết bị 19 2.5 Hóa chất mơi trƣờng 20 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.6.1 Phƣơng pháp lấy mẫu phân lập, sàng lọc Vibrio spp 21 2.6.2 Phƣơng pháp định danh sơ chủng Vibrio sàng lọc phƣơng pháp sinh hóa 22 2.6.3 Xác định gen độc tố chủng vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh AHPND phƣơng pháp PCR 24 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân lập, làm sàng lọc chủng vi khuẩn Vibrio từ mẫu tôm bệnh 27 3.2 Kết định danh sơ chủng vi khuẩn Vibrio spp sàng lọc phƣơng pháp sinh hóa 34 3.2.1 Kết kiểm tra phản ứng oxidase 34 3.2.2 Kết kiểm tra phản ứng sinh hóa kit test API 20E 35 3.3 Xác định gen độc tố gây bệnh AHPND phƣơng pháp PCR 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Điều kiện phát triển vi khuẩn V parahaemolyticus 11 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR phân lập gen PirA PirB 25 Bảng 3.1 Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu tôm bệnh Nam Định Hải Phịng mơi trƣờng TCBS 27 Bảng 3.2 Kết định danh môi trƣờng VCP 31 Bảng 3.3 Kết test sinh hóa định danh kit API 20E 35 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy Hình 2.2 Vi khuẩn V parahaemolyticus 12 Hình 2.3 Cấu trúc hình thái vi khuẩn Vibrio harveyi 13 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 26 Hình 3.1 Hình ảnh kết phân lập làm mơi trƣờng TCBS 30 Hình 3.2 Hình ảnh kết định danh mơi trƣờng VCP 33 Hình 3.3 Hình ảnh màu sắc khuẩn lạc số loài Vibrio môi trƣờng VCP 33 Hình 3.4 Hình ảnh kết test oxidase 35 Hình 3.5 Hình ảnh kết phản ứng sinh hóa 37 Hình 3.6 Điện di đồ DNA tổng số chủng Vibrio chọn 39 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen độc tố PirA (A) PirB (B) 40 vi DANH MỤC TỪ, KÝ TỰ VIẾT TẮT Ký hiệu Chữ viết tắt AHPND Acute Hepatoncreatic Necrosis Disease cs cộng DNA Deoxyribonucleic acid FAO Food and Agriculture Organization kpb Kilobase pairs LB Lysogeny Broth NTTS Nuôi trồng thủy sản O/F Oxydative-Fermentative PCR Polemerase Chain Reaction TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar TSB Tryptic Soy Broth TTCT Tôm thẻ chân trắng VASEP Vietnam Associasion of Seafood Exporters and Producers VCP CHROMOGelTM Vibrio Cholerae Parahaemolyticus Agar vii TÓM TẮT KHÓA ḶN TỚT NGHIỆP Tên khóa luận: Phân lập, sàng lọc chủng Vibrio spp mang gen độc PirA, PirB có khả gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tôm thẻ chân trắng thu thập số địa điểm Hải Phòng Nam Định Giảng viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Thị Nhiên Sinh viên thực hiện: Phạm Thùy Dƣơng Lớp: K63CNSHB Tóm tắt báo cáo Mục đích đề tài: Phân lập, sàng lọc đƣợc chủng Vibrio spp mang gen độc PirA, PirB có khả gây bệnh AHPND tôm thẻ chân trắng Phƣơng pháp nghiên cứu: - Phƣơng pháp lấy mẫu phân lập, sàng lọc Vibrio spp - Phƣơng pháp định danh sơ chủng Vibrio spp sàng lọc phƣơng pháp sinh hóa - Phƣơng pháp PCR xác định gen độc tố chủng vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh AHPND Kết nghiên cứu: Xác định đƣợc chủng V parahaemolyticus có mang gen độc PirA, PirB gây bệnh AHPND tôm thẻ chân trắng Kết luận: Đề tài nghiên cứu thành công phân lập, sàng lọc xác định đƣợc chủng Vibrio spp có mang gen độc PirA, PirB gây bệnh AHPND tôm thẻ chân trắng viii 3.2 Kết định danh sơ chủng vi khuẩn Vibrio spp sàng lọc phƣơng pháp sinh hóa Từ kết sàng lọc mơi trƣờng VCP, chúng tơi chọn đƣợc 12 chủng có màu sắc khuẩn lạc giống với V parahaemolyticus, V cholerae V algynolyticus Để kiểm tra lại kết định danh chủng trên, tiếp tục tiến hành định danh phản ứng sinh hóa bao gồm: kiểm tra phản ứng oxidase cách sử dụng đĩa giấy thử oxidase (Himedia, Ấn Độ) thử 20 phản ứng sinh hóa kit API 20E (Biomerieux, Pháp) 3.2.1 Kết kiểm tra phản ứng oxidase Các loài Vibrio spp chủ yếu vi khuẩn hiếu khí, tiến hành kiểm tra phản ứng oxidase để kiểm tra chủng có phải vi khuẩn hiếu khí hay khơng Phản ứng oxidase đƣợc thực dựa nguyên lý nhƣ sau: Các đĩa giấy đƣợc tẩm thuốc thử 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride Nếu vi khuẩn sinh cytochrome c oxidase (một enzyme chuỗi vận chuyển điện tử vi khuẩn) enzyme oxy hóa thuốc thử thành indophenol có màu xanh tím Khi khơng có enzyme, thuốc thử bị khử khơng màu Phản ứng kiểm chứng xem vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí Dùng đầu tăm vơ trùng lấy khuẩn lạc chấm lên đĩa giấy thử đƣợc làm ẩm nƣớc cất vô trùng Quan sát thay đổi màu sắc 5-10 giây Nếu đĩa giấy đổi màu xanh phản ứng dƣơng tính đĩa giấy không đổi màu thể kết âm tính Kết thu đƣợc 12 chủng dƣơng tính với phản ứng oxidase (đĩa giấy đổi màu xanh) Điều chứng tỏ 12 chủng vi khuẩn vi khuẩn hiếu khí Hình ảnh minh họa đƣợc thể Hình 3.4 34 Hình 3.4 Hình ảnh kết test oxidase (A: dương tính; B: đối chứng âm) 3.2.2 Kết kiểm tra phản ứng sinh hóa kit test API 20E Bộ test phản ứng sinh hóa API 20E bao gồm 20 phản ứng sinh hóa khác đƣợc sử dụng để định danh loài vi khuẩn Gram âm Mỗi test bao gồm 20 giếng tƣơng ứng với 20 phản ứng sinh hóa có chứa thuốc thử khử nƣớc Sau cấy dịch vi khuẩn vào giếng đem ủ điều kiện phù hợp, vi khuẩn có giếng tiến hành trao đổi chất phản ứng với thuốc thử có giếng tạo thay đổi màu sắc Dựa vào màu sắc cuối giếng để xác định đặc điểm sinh hóa định danh chủng vi khuẩn Sử dụng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc chủng vi khuẩn cần định danh hòa với ml dung dịch NaCl (0,85%) Dùng micropipette vô trùng hút dịch vi khuẩn nhỏ vào giếng theo cách làm mô tả phần phƣơng pháp mục 2.6.2.2 đem ủ 37oC 24 Sau lấy quan sát màu sắc đối chiếu với bảng màu nhà sản xuất cung cấp Kết phản ứng sinh hóa định danh 12 chủng đƣợc thể Bảng 3.3 35 NĐV 2.2 NĐV 6.1 NĐV 9.1 HPV 2.3 HPV 9.1 NĐV 1.1 NĐV 4.1 NĐV 8.1 HPV 3.2 HPV 5.1 ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OXD Kết định danh HPV 7.1 Ký hiệu chủng NĐV 10.2 Bảng 3.3 Kết test sinh hóa định danh kit API 20E + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + V V cholerae V algynolyticus parahaemolyticus (Ghi chú: “+”: phản ứng dương tính; “-“: phản ứng âm tính) Từ kết phản ứng oxidase kết phản ứng sinh hóa, chúng tơi tiến hành định danh loài cách tra trực tiếp phần mềm APIwebTM Kết dự đốn cho thấy có chủng ký hiệu NĐV 10.2, HPV 7.1 thuộc loài V parahaemolyticus, chủng ký hiệu NĐV 2.2, NĐV 6.1, NĐV 9.1, HPV 2.3, HPV 9.1 thuộc loài V cholerae chủng ký hiệu NĐV 1.1, NĐV 4.1, NĐV 8.1, HPV 3.2, HPV 5.1 thuộc loài V algynolyticus Nhƣ kết trùng 36 khớp với kết định danh sơ mơi trƣờng VCP Hình ảnh minh họa kết phản ứng sinh hóa đƣợc thể Hình 3.5 Hình 3.5 Hình ảnh kết phản ứng sinh hóa A – kết phản ứng sinh hóa chủng HPV 7.1; B – kết định danh chủng HPV 7.1 phần mềm APIwebTM; C – bảng màu đối chứng nhà sản xuất cung cấp 37 3.3 Xác định gen độc tố gây bệnh AHPND phƣơng pháp PCR Tách chiết DNA tổng số Trƣớc đây, V parahaemolyticus đƣợc biết đến tác nhân gây bệnh AHPND Khi phân tích trình tự gen chủng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy Thái Lan, Kondo cs phát gen độc tố PirA PirB đồng thời lại không phát gen chủng V parahaemolyticus không gây bệnh Điều chứng tỏ gen độc tố PirA PirB tác nhân gây bệnh AHPND [Kondo cs., 2014] Ngồi ra, nghiên cứu tìm thấy số lồi Vibrio khác có khả gây bệnh AHPND, nguyên nhân gen gây bệnh pirABvp chuyển ngang lồi (Giang NTT cs, 2016) Vì vậy, để xác định xác chủng Vibrio gây bệnh AHPND cần sử dụng kỹ thuật PCR để xác định có mặt gen độc tố pirABvp Trong khuôn khổ đề tài này, xác định gen độc tố 12 chủng Vibrio Do đó, dựa vào kết định danh lựa chọn hai chủng NĐV 10.2, HPV 7.1 (kết định danh sinh hóa V parahaemolyticus) chọn ngẫu nhiên chủng thuộc loài Vibrio khác NĐV 6.1 (V cholerae) HPV 5.1 (V algynolyticus) DNA tổng số chủng NĐV 6.1, NĐV 10.2, HPV 5.1, HPV 7.1 đƣợc tách chiết theo mơ tả phần phƣơng pháp, sau đƣợc điện di gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lƣợng Kết điện di đƣợc trình bày hình 3.6 Điện di đồ hình 3.6 cho thấy sản phẩm DNA tổng số tách chiết đƣợc tập trung thành băng to, rõ Điều chứng tỏ DNA tổng số tách chiết đƣợc sạch, đứt gãy, đảm bảo chất lƣợng cho nghiên cứu 38 Hình 3.6 Điện di đồ DNA tổng số chủng Vibrio chọn M: thị phân tử DNA 1kb marker; DNA tổng số chủng Vibrio: NĐV 6.1 (giếng 1) , NĐV 10.2 (giếng 2), HPV 5.1 (giếng 3), HPV 7.1 (giếng 4) Phản ứng PCR Để nhận biết chủng vi khuẩn Vibrio spp phân lập từ tơm bệnh có phải tác nhân gây bệnh AHPND hay không, DNA tổng số thu đƣợc từ chủng Vibrio đƣợc sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR phân lập gen PirA, PirB mã hóa kháng nguyên độc tố nhị phân PirAB gây bệnh AHPND tôm với hai cặp primer đặc hiệu đƣợc nêu mục 2.6.3 thực với thành phần phản ứng (Bảng 2.1) theo chu trình phản ứng đƣợc nêu phần phƣơng pháp nghiên cứu Các sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Kết điện di sản phẩm PCR đƣợc trình bày hình 3.7 39 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen độc tố PirA (A) PirB (B) M: thị phân tử DNA kb marker; DNA tổng số chủng Vibrio: NĐV 6.1 (giếng 1) , NĐV 10.2 (giếng 2), HPV 5.1 (giếng 3), HPV 7.1 (giếng 4) Điện di đồ hình 3.7A cho thấy hai chủng NĐV 10.2 HPV 7.1 xuất băng DNA (sản phẩm PCR khuếch đại gen độc tố PirA) có kích thƣớc khoảng 336 bp tƣơng ứng với kích thƣớc dự đốn Điện di đồ hình 3.7B cho thấy, hai chủng NĐV 10.2 HPV 7.1 xuất băng DNA (sản phẩm PCR khuếch đại gen độc tố PirB) có kích thƣớc khoảng 1317 bp tƣơng ứng với kích thƣớc dự đốn Nhƣ vậy, có hai chủng Vibrio spp NĐV 10.2 Vibrio spp HPV 7.1 mang đồng thời hai gen PirA PirB Tóm lại, từ bốn chủng Vibrio sàng lọc đƣợc hai chủng gây bệnh đƣợc chủng NĐV 10.2 HPV 7.1 mang đồng thời gen PirA PirB gen gây bệnh AHPND TTCT Kết phù hợp với công bố Han cs (2015) gen PirA-like PirB-like có kích thƣớc lần lƣợt 336 bp 1.317 bp mã hố cho protein có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 13 50 kDa chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND tôm Trong công bố khác, nhóm nghiên cứu cho thấy gen độc tố PirA-like PirB-like nằm plasmid có kích thƣớc lớn (69–70 kb) (Han cs., 2015) 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Đã phân lập đƣợc 35 chủng vi khuẩn từ mẫu tôm bệnh thu thập ao nuôi TTCT Hải Phòng Nam Định Sàng lọc chủng vi khuẩn phân lập môi trƣờng ChromoGel™ Vibrio CP Agar, thu đƣợc 12 chủng Vibrio thuộc loài V parahaemolyticus, V cholerae V algynolyticus Tiến hành kiểm tra lại kết cách thử phản ứng sinh hóa sử dụng kit API 20E cho kết trùng khớp Chọn chủng Vibrio để xác định gen độc tố PirA, PirB gây bệnh AHPND phƣơng pháp PCR Kết thu đƣợc chủng thuộc loài V parahaemolyticus chứa đồng thời gen PirA PirB gây bệnh AHPND  Kiến nghị Phân tích trình tự gen độc tố chủng V parahaemolyticus NĐV 10.2 V parahaemolyticus HPV 7.1 để khẳng định xác gen PirA, PirB gây bệnh AHPND Giải trình tự gen 16S RNA để định danh chủng Vibrio Sử dụng hai chủng Vibrio NĐV 10.2 HPV 7.1 để nghiên cứu vi khuẩn có khả kháng lại gen độc tố PirA, PirB để phòng chữa bệnh AHPND 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Quang Tề, Bệnh học thủy sản, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, phần 2, 2006 Đặng Phƣơng Nga ctv, 2007 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio nƣớc nuôi tôm Bacillus subtilis HY1 Lactococcus Lactis CC4K Tạp chí Cơng nghệ sinh học 5(3): trang 383 – 390 Đặng Thị Lụa, Nguyễn Viết Khuê, Phan Thị Vân Non – Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tơm ni, Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 5: 690-698, 2016 Giang NTT, Toàn PV, Hùng PQ Hội chứng hoại tử gan tụy tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) ni thƣơng phẩm Ninh Thuận Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản 2016; 1:32-40 Kiều Ngọc Hà, Tình hình dịch bệnh tơm ni năm 2013, Trung tâm thông tin Thủy sản, Tổng cục thủy sản, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, 2013 Lụa ĐT, Khuê NV, Vân PT Non-Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tôm nuôi Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2016;14(5):690-698 Nguyễn Thế Hiển, Quách Văn Tây, Bùi Quang Tề (2014), “Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính tơm ni tỉnh Sóc Trăng năm 2011”, Khoa học kỹ thuật thú y, Số 1(21) Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Nguyễn Văn Thanh, Đặng Tố Vân Cầm, Vũ Hồng Nhƣ Yến Trần Nguyễn Ái Hằng, Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ dịng vi khuẩn có đặc tính đối kháng Vibrio spp nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển tôm sú Công nghệ sinh học nông nghiệp thủy sản, 2010 42 Nguyễn Văn Khanh, Nguyễn Quang Linh, Trần Thúy Lan, Lê Thị Tuyết Nhân, Trần Quang Khánh Vân, Nguyễn Thị Kim Cơ, Trần Quốc Dung Phân lập sàng lọc chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm thẻ chân trắng nuôi Phong Điền, Thừa Thiên Huế thị phân tử 16S rRNA, Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên, 2019 10.Nguyễn Văn Phúc, Phân lập khảo sát đặc điểm có lợi cho tơm ni số chủng vi sinh vật từ ao nuôi tôm Bến Tre, Luận văn thạc sĩ sinh học, Khoa Vi sinh vật học, Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, 2013 11.Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7905-1:2008 (ISO/TS 21872-1:2007) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phƣơng pháp phát Vibrio spp có khả gây bệnh đƣờng ruột - Phần 1: Phát Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholera 12.Thƣớc TL Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật nƣớc, thực phẩm mĩ phẩm: Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội; 2007 13.Trần Linh Thƣớc (2012), Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật nƣớc, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất Giáo Dục, Tp HCM TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Abdul Wahab Khan, S J Hossain and Sarder Nasir Uddin, 2007 Isolation, Identification and Determination of Antibiotic Susceptibility of Vibrio parahaemolyticus from Shrimp at Khulna Region of Bangladesh Research Journal of Microbiology, 2: 216-227 15 Ana Cano-Gómez, Evan F Goulden, Leigh Owens, Lone Høj (2010) Vibrio owensii sp nov., isolated from cultured crustaceans in Australia FEMS Microbiology Letters, Volume 302, Issue 2, January 2010, Pages 175–181 43 16 Austin B, Zhang XH (2006) "Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates" Letters in Applied Microbiology 43 (2): 119–214 17 Chumpol S, Kantachote D, Rattanachuay P, Vuddhakul V, Nitoda T and Kanzaki H (2016) In vitro and in vivo selection of probiotic purple nonsulphur bacteria with an ability to inhibit shrimp pathogens: acute hepatopancreatic necrosis diseasecausing Vibrio parahaemolyticus and other vibrios Aquacult Res: 1–16 18 Eduardo M Leaño, Mohan CV (2012) Emerging threat in the Asian Shrimp Industry: Early Mortality Syndrome (EMS)/Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific Asian fisheries society Fish health section Electronic newsletter No.10 19 Eduardo, M Leano and Mohan, C.V., 2012 Early Mortality Syndrome (EMS)/ Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS): An emrging threat in the Asian shrimp industry NACA, Bangkok, ThaiLand FAO Fisheries and Aquaculture Report No 1053: 54 20 FAO Shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease strategy manual 2020 21 Flegel, T.W (2012) Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia Journal of Invertebrate Pathology 110:166-173 22 Hai, N.V 2015 The use of probiotics in aquaculture J Appl Microbiol., 119: 917–935 23 Han JE, Tang KF, Lightner DV Genotyping of virulence plasmid from Vibrio parahaemolyticus isolates causing acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp Diseases of Aquatic Organisms 2015;115(3):245-51 24 Han JE, Tang KF, Tran LH, Lightner DV Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the 44 causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp Diseases of Aquatic Organisms 2015;113(1):33-40 25 Jun, J.W., Han, J.E., Giri, S.S., Tang, K.F.J., Zhou, X., Aranguren, L.F., Kim, H.J., Yun, S., Chi, C., Kim, S.G & Park, S.C 2018 Phage application for the protection from acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Penaeus vannamei Ind J Microbiol., 58: 114–117 26 Jun, J.W., Han, J.E., Tang, K.F.J., Lightner, D.V., Kim, J., Seo, S.W & Park, S.C 2016 Potential application of bacteriophage pVp-1: agent combating Vibrio parahaemolyticus strains associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp Aquaculture, 457: 100–103 27 Karunasagar, I., Shivu, M.M., Girisha, S.K., Krohne, G & Karunasagar, I 2007 Biocontrol of pathogens in shrimp hatcheries using bacteriophages Aquaculture, 268: 288– 292 28.Kondo H., Tinwongger S., Proespraiwong P., Mavichak R., Unajak S., Nozaki R., Hirono I., 2014 Draft genome sequences of six strains of Vibrio parahaemolyticus isolated from Early Mortality Syndrome/Acute Hepato- pancreatic Necrosis Disease shrimp in Thailand Genome Announc, 2(2), (e00221-14) 29.Lee CT, Chen IT, Yang YT, Ko TP, Huang YT, Huang JY, et al The opportunistic marine pathogen Vibrio parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin Proceedings of the National Academy of Sciences 2015;112(34):10798-803 30.Lightner D.V., Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.L., Tran L.H., 2012 Early mortality syndrome affects shrimp in Asia Global Aquaculture Advocate 45 31 Mooney A (2012) An emerging shrimp disease in Vietnam, microsporidiosis or liver disease? Available at: http://aquatichealth.net/issues/38607 (accessed 24 Feb 2012) 32.Nishibuchi M, Kaper JB Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium.Infect Immun.1995; 63(6): 2093–2099 33 OIE Immediate notifications, Acute hepatopancreatic necrosis disease (https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?pa ge_refer=MapF ullEventReport&reportid=36209&newlang=en) 2020 34 Panakorn, S., 2012 Opinion article: more on early mortality syndrome in the shrimp Aquaculture Asia Pacific 8(1): 8-10 35.Shin-Jen Lin, Kai-Cheng Hsu, Hao-Ching Wang, et al Structural Insights into the Cytotoxic Mechanism of Vibrio parahaemolyticus PirAvp and PirBvp Toxins 2017 Dec 36 Soto-Rodriguez, S A., Gomez-Gil, B., Lozano-Olvera, R., BetancourtLozano, M., & Morales-Covarrubias, M S (2015) Field and experimental evidence of Vibrio parahaemolyticus as the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease of cultured shrimp (Litopenaeus vannamei) in Northwestern Mexico Applied and Environmental Microbiology 81(5), 1689- 1699 https://doi.org/10.1128/AEM.03610-14 37.Tran Loc, Nunan L, Redman RM, Mohney LL, Pantoja CR, Fitzsimmons K, et al Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp Diseases of Aquatic Organisms 2013;105(1):45-55 38.Vikash Kumar, , Suvra Roy, Bijay Kumar Behera, Peter Bossier and Basanta Kumar Das Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease 46 (AHPND): Virulence, Pathogenesis and Mitigation Strategies in Shrimp Aquaculture 2021, 13, 524 39 Vinod, M.G., Shivu, M.M., Umesha, K.R., Rajeeva, B.C., Krohne, G., Karunasagar, I & Karunasagar, I 2006 Isolation of Vibrio harveyi bacteriophage with a potential for biocontrol of luminous vibriosis in hatchery environments Aquaculture, 255: 117–124 40.Westh T, Wassenaar T M, Hallin PF, Snipen L, Lagesen K, Ussery DW On the origins of a Vibrio species Microb Ecol 2010; 59: 1–13 41.Wang Hailiang, ChundiWang, YangTang, Bochao, SunJieHuang, XiaolingSong Pseudoalteromonas probiotics as potential biocontrol agents improve the survival of Penaeus vannamei challenged with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND)-causing Vibrio parahaemolyticus 2018 42.Bergey DH, Holt JG Bergey's manual of determinative bacteriology: Baltimore: Williams & Wilkins; 1994 43.Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S., 2001 Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in Seafood Applied Environmental Microbiology 67(12): 5819-5823 B TÀI LIỆU LINK INTERNET 44 Báo Ngƣời nuôi tôm Tổng quan tình hình dịch bệnh tơm năm 2020 Đăng ngày 04/0102021 Truy cập ngày 23/06/2022 từ http://nguoinuoitom.vn/tong-quan-tinh-hinh-dich-benh-tren-tom-nam2020/ 45 Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn Sản lƣợng tơm tồn cầu tăng trƣởng đáng kể vào năm 2021 Đăng ngày 18/11/2021 Truy cập ngày 20/08/2022 từ https://www.mard.gov.vn/Pages/san-luong-tom-toan-cautang-truong-dang-ke-vao-nam-2021.aspx 47 46 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Vài nét tình hình ni tơm chân trắng giới Việt Nam Đăng ngày 29/08/2013 Truy cập ngày 20/08/2022 từ https://bom.so/VcX7jE 47 BQ&Q – Thức ăn vật nuôi Tác hại việc lạm dụng kháng sinh nuôi trồng thủy sản Ngày 05/01/2022 Truy cập ngày 29/07/2022 từ https://bom.so/mElYuA 48 TepBac Bệnh phân trắng tôm 2022 Truy cập ngày 22/08/2022 từ https://tepbac.com/tin-tuc/full/benh-phan-trang-tren-tom-31490.html 49 Tổng cục thủy sản Dịch bệnh thủy sản tiếp tục đƣợc kiểm soát Đăng ngày 19/05/2022 Truy cập ngày 22/08/2022 từ https://bom.so/OmoNkE 50.Tổng cục thủy sản Dịch bệnh thủy sản tiếp tục đƣợc kiểm soát Đăng ngày 19/05/2022 Truy cập ngày 22/08/2022 từ https://bom.so/OmoNkE 51 Tổng cục thủy sản Đề án tổng thể phát triển ngành công nghiệp tôm Việt Nam đến năm 2030 Đăng ngày 30/08/2018 Truy cập ngày 20/06/2022 từ https://bom.so/pQe0YW 52 Tổng cục thủy sản Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tôm nuôi nƣớc lợ: nguyên nhân giải pháp phòng ngừa Đăng ngày 21/12/2012 Truy cập ngày 03/06/2022 từ https://bom.so/8r6I8T 53 Thủy sản Việt Nam Nghệ An: Hơn 65 tôm nuôi nhiễm dịch bệnh 08/06/2022 Truy cập ngày 09/08/2022 từ https://thuysanvietnam.com.vn/nghe-an-hon-65-ha-tom-nuoi-nhiem-dichbenh/ 48