Nghiên cứu xác định các đoạn dna barcode cho loài cây pơ mu (fokienia hodginsii) phục vụ cho giám định loài

Trong suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện trường Đại học Lâm Nghiệp, để vượt qua khó khăn, thử thách đạt kết mong muốn học tập sống, ngồi cố gắng thân, tơi cịn nhận quan tâm, giúp đỡ từ thầy cô, gia đình bạn bè Nhân dịp này, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo tận tình hướng dẫn, giảng dạy tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu rèn luyện trường Đại học Lâm Nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Văn Huân TS i Thị Mai Hương trực tiếp hướng dẫn, bảo giúp đỡ thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Đ c biệt, khóa luận nhận hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nước "Xây dựng sở liệu mã vạch ADN (DNA barcode) cho số loài lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế" PGS.TS Hà Văn Huân làm Chủ nhiệm Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp trường Đại học Lâm Nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho tơi có môi trường tốt để học tập, nghiên cứu rèn luyện Cuối c ng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cơ, gia đình, bạn bè - người động viên, khích lệ tơi suốt trình học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Do q trình thực cịn có nhiều hạn chế m t thời gian, kiến thức kinh nghiệm khơng tránh khỏi thiếu sót định Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp tơi hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực oàn Th i nh n Ụ Ụ L I C M N i MỤC LỤC ii D NH MỤC TỪ VI T T T iv D NH MỤC CÁC NG vi D NH MỤC CÁC HÌNH vii Đ T V N Đ CH NG T NG QU N T I LI U 1.1 T ng quan đôi tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Pơ mu 1.1.2 Đ c điểm hình thái 1.1.3 Đ c điểm sinh học 1.1.4 Công dụng 1.1.5 Giá trị kinh tế, khoa học bảo tồn 1.2 T ng quan DN barcode DN mã vạch 1.2.1 Giới thiệu DN barcode 1.2.2 Các đ c điểm trình tự DN barcode 1.2.3 Một số locus sử dụng phương pháp DN barcode thực vật 1.2.4 Ứng dụng DN barcode thực vật 13 CH NG MỤC TI U, N I DUNG, V T LI U V PH NG PHÁP NGHI N CỨU 15 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 15 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.3.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 2.3.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 ii 2.4.1 Phương pháp tách chiết DN t ng số 17 2.4.2 Kiểm tra kết tách chiết DN t ng số 18 2.4.3 Phương pháp nhân gen đích b ng k thuật PCR 19 2.4.4 Tinh sản phẩm PCR 21 CH NG K T QU V TH O LU N 22 3.1 Kết tách chiết DN t ng số 22 3.2 Kết nhân v ng gen nghiên cứu b ng k thuật PCR 22 3.3 Phân tích kết 23 3.3.1 Xác định phân tích trình tự DN v ng gen nghiên cứu 23 3.3.2 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA .35 CH NG K T LU N V KI N NGH 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Kiến nghị 37 T I LI U TH M KH O iii Ụ T Các chữ viết tắt V TT T Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Base pair C p base bp CBOL Consortium for the Barcode of Life Convention on International Trade CITES in Endangered Species of Wild Fauna and Flora Chloroplast DNA CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA (ADN) of Life Công ước buôn bán quốc tế loài nguy cấp gen lục lạp cpDNA Cytb Consortium for the Barcode Cetyl trimethylammonium bromide Cytochrome b Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EBA Extraction Buffer A Đệm tách EBB Extraction Buffer B Đệm tách EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid triphosphate axit ethylenediamine tetraacetic Foward-Primer Mồi xuôi IGS Intergenic Spacer vùng liên gen ITS Internal Transcribed Spacer v ng DN n m gen kb Kilobase (1000 base) 1000 c p base mtDNA Mitochondrial DNA DN ty thể Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamide adenine phosphate dinucleotide phosphate National Center for Biotechnology Trung tâm Quốc gia Thông F-Primer NAD(P)H NCBI iv Information tin Công nghệ sinh học ORF Open Reading Frame Khung đọc m PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone Restriction fragment length Phân tích đa hình trình tự polymorphism DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate Reverse primer Mồi ngược RFLP SDS R-Primer TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA RN vận chuyển UV Tia cực tím Untraviolet v Ụ B G ảng 2.1 Kí hiệu mẫu Pơ mu sử dụng cho nghiên cứu 15 ảng 2.2 Thành phần đệm tách 100µl 16 ảng 2.3 Thành phần đệm tách 100µl 16 ảng 2.4 Thành phần đệm TE 100µl 16 ảng 2.5 Các c p mồi sử dụng 19 ảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng với lồi Fokienia hodginsii ngân hàng gen NCBI 26 ảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen rbcL tương đồng với lồi Fokienia hodginsii ngân hàng gen NCBI 30 ảng 3.3 Một số lồi có trình tự gen trnH-psb tương đồng với lồi Fokienia hodginsii ngân hàng gen NCBI 34 ảng 3.4 ảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA 36 vi Ụ Ì Hình 1.1 Hình ảnh Pơ mu Hình 2.1 Chu trình nhiệt nhiệt độ T gắn mồi thay đ i phụ thuộc mồi 20 Hình 3.1 Kết tách chiết DN t ng số mẫu Pơ mu 22 Hình 3.2 Kết nhân gen matK, rbcL trnH-psbH 23 Hình 3.3 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK loài Pơ mu Fokienia hodginsii Dunn Henry & H.H.Thomas nghiên cứu với loài Chamaecyparis lawsoniana NCBI 25 Hình 3.4 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo b i NC I 27 Hình 3.5 Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL loài Pơ mu Fokienia hodginsii Dunn Henry & H.H.Thomas nghiên cứu với loài Chamaecyparis lawsoniana NCBI 29 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo b i NC I 31 Hình 3.7 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psb loài Pơ mu 33 (Fokienia hodginsii Dunn Henry & H.H.Thomas nghiên cứu với loài Chamaecyparis lawsoniana NCBI 33 Hình 3.8 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo b i NC I 35 vii TV Pơ mu Fokienia chi họ Hoàng đàn Cupressaceae), trung gian hai chi Chamaecyparis Calocedrus, m t di truyền học chi Fokienia gần gũi với chi thứ Chi có lồi cịn sống pơ mu Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas) lồi cịn dạng hóa thạch Fokienia ravenscragensis Tại Việt Nam, pơ mu loại gỗ quý có m i thơm đ c trưng, vân gỗ đ p không bị mối mọt phá hoại Vì thế, gỗ pơ mu d ng để làm đồ m thuật, gia dụng Ngoài ra, rễ pơ mu có tinh dầu giá trị kinh tế cao Sản phẩm chưng cất từ thân, đ c biệt từ rễ pơ mu, tinh dầu d ng hóa m phẩm y học nên bị khai thác mạnh tr nên khan Hiện gỗ pơ mu phân bố rải rác nơi xa dân Tái sinh kém, sinh trư ng chậm nên số lượng giảm nhanh chóng Hiện nay, pơ mu xếp vào loài nguy cấp n m Sách đỏ Việt Nam năm 1996 Vì việc bảo tồn nguồn gen cho pơ mu điều cần thiết Trước đây, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu dựa thị hình thái ho c đ c tính sinh lý sinh hóa bên nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại truyền thống nhiều trường hợp g p nhiều khó khăn hạn chế, như: nhiều sinh vật có hình thái giống thực tế lại khác hệ thống phân loại hệ gen khác , ngược lại nhiều sinh vật có hình thái khác lại gần hệ thống phân loại hệ gen giống M t khác, phương pháp phân loại dựa đ c điểm hình thái khó phân biệt khác biệt biến dị lồi Đ c biệt, mẫu vật có nguồn gốc sinh vật bị biến đ i hình thái, như: mẫu sinh vật chết, bị chơn v i đất, cơng trình xây dựng, qua chế biến khơng thể xác định b ng thị hình thái Do đó, địi hỏi cần có phương pháp định danh phân loại đại khắc phục hạn chế Việc ứng dụng gen mã vạch, xác định đoạn DN phương pháp định danh, sử dụng đoạn DN barcode chuẩn ngắn n m genome sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Phương pháp xác định đoạn DN barcode áp dụng ph biến cho lồi thực vật có giá trị kinh tế cao Từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu xác định đoạn DNA barcode cho loài cây Pơ mu (Fokienia hodginsii) phục vụ giám định loài” để phân loại, lựa chọn xây dựng liệu gen, quý góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý quốc gia G T n qu n v u n ôi t T G U T U n n hi n c u c phân c mu Pơ mu Fokienia Henry et Thomas chi nhỏ biết loài Fokienia hodginsii Đây loài Hạt trần quý giá phân bố rộng nhiều địa phương đất nước ta Song nghiên cứu m t thực vật học hóa học [21] Bản hân o i ho h c [21] Giới (regnum) Plantae Ngành (divisio) Pinophyta ớp (class) Pinopsida Bộ (ordo) Pinales Cupressaceae (familia) Cupressoideae Phân h (subfamilia) Chi (genus) Fokienia A.HENRY & H.H.THOMAS Loài (species)  F hodginsii hân Việt Nam Pơ mu phân bố Hồng Su Phì, Quản tỉnh Hà Giang Đồng Văn, , Lào Cai Sa Pa, Mường Khương , Lai Châu T a Ch a, Than Uyên, Phong Th , Điện iên Tuần Giáo , Yên Trấn Yên, Trạm Tấu , Sơn La ắc n , Hịa ình Mai Châu , Nghệ n Qu Châu, Quế Phong, Thanh Chương , Hà T nh Hương Khê , Thừa Thiên Huế, Kon Tum Kon Plongo , Gia Lai, Đắk Lắk Krông ông , Lâm Đồng Lạc Dương Khánh Hòa [6] Trên giới Pơ mu tìm thấy Trung Quốc Lào [6] KX832622.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen thể hình 3.4 Range 1: to 616GraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1083 bits(586) 0.0 606/616(98%) 0/616(0%) Plus/Minus Query GAGGTTCTCACTGTTCCTTTGGAATTCTTATGTGTATGAATGTGAATCGTTTTTAATTCC ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 616 GAGGTTCTCCCTGTTCCTTTGGAATTCTTATGTGTATGAATGCGAATCGTTTTTAATTCC Query 61 Sbjct 556 Query 121 Sbjct 496 Query 181 Sbjct 436 Query 241 Sbjct 376 Query 301 Sbjct 316 Query 361 Sbjct 256 Query 421 Sbjct 196 Query 481 Sbjct 136 Query 541 Sbjct 76 Query 601 Sbjct 16 60 557 TCTTATTAAACGAATTTTGAATTCACAACCATTGTTATATGGATCTTTTCCCGATCGAAC |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| TCTTATTAAACGAATTTTGAATTCACAATCATTGTTATATGGATCTTTTCCCGATCGAAC 120 TCATTTTGAGAAAAAGATCAAAGATATTGTTCTATTTCCTCCTCATAAAATTTCAACAAA |||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| TCATTTTGAGAAAAAGATAAAAGATATTGTTCTATTTCCTCCTCATAAAATTTCACCAAA 180 AAAGATCTGGTTGCTAAAGGATTCTTTCATCCATTATGTGAGATATGAAGAAAGATCCCT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| AAAGATCTGGTTGCTAAAGGATTCTTTCATCCATTATGTGAGATATGGAGAAAGATCCCT 240 TATAGCTCTAAAGGGTACGCACCTTCAAGTGAAAAAATGTAGATATCATCTGTTTCATTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATAGCTCTAAAGGGTACGCACCTTCAAGTGAAAAAATGTAGATATCATCTGTTTCATTT 300 TTGGCAATACTATTTTCATCTTTGGTTTCAACCGTATAGGATATCCAGTCTTGAATTATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| TTGGCAATACTATTTTCATCTTTGGTTTCAACCGTATAGGATATGCAGTCTTGAATTATC 360 TAAGACTTCtttttcttttttaggtttttttATGCATGTTAAAATGAGACCTCTCGTGGT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAAGACTTCTTTTTCTTTTTTAGGTTTTTTTATGCATGTTAAAATGAGACCTCTCGTGGT 420 TAGAGCCAAAATGCTAGATGATTTATTCATTACCGATCTGATTACCAATGAATTAAACTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGAGCCAAAATGCTAGATGATTTATTCATTACCGATCTGATTACCAATGAATTAAACTC 480 AACAGCTCCGATTAGATCAATTCTTTTTTCTTTGGCTAAAGAAAAGTTTTGTGACATCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACAGCTCCGATTAGATCAATTCTTTTTTCTTTGGCTAAAGAAAAGTTTTGTGACATCTC 540 AGGGTGGCCAATTAGTAAATTGTCTTGGACCAGTCTATCAGATGATGATATCCTCGATCG |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| AGGGTGGCCAATTAGTAAATTGTCTTGGACCAGTTTATCAGATGATGATATCCTCGATCG 600 ATTCGATCGAATTTGG |||||||||||||||| ATTCGATCGAATTTGG 497 437 377 317 257 197 137 77 17 616 nh 3 Sự sai khác tr nh tự đoạn gen matK loài Pơ mu (Fokienia hodginsii (Dunn) A enry & Thomas) nghiên cứu với loài Chamaecyparis lawsoniana NCBI 25 Từ kết thu được, nhận thấy tỷ lệ tương đồng trình tự gen matK lồi Pơ mu (Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas) nghiên cứu với trình tự đoạn gen matK loài Chamaecyparis obtusa NC I 98 có 10 điểm sai khác: Thay b ng C vị trí số 10 Thay T b ng C vị trí số 43 Thay C b ng T vị trí số 89 Thay C b ng vị trí số 139 Thay b ng C vị trí số 176 Thay b ng G vị trí số 228 Thay C b ng G vị trí số 345 Thay b ng C vị trí số 360 Thay T b ng C vị trí số 361 10 Thay C b ng T vị trí số 575 Tiếp tục so sánh với đoạn gen matK số lồi có trình tự tương đồng ngân hàng gen NC I b ng cách sử dụng công cụ L ST để thiết lập phát sinh chủng loại Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng d ng so sánh với lồi Pơ mu trình bày bảng 3.1 Bản ột s oài c tr nh t n mat t ơn n với oài Fokienia hodginsii ngân hàng gen NCBI STT s Tên loài MG269834.1 Tỷ t ơn n 100% Chamaecyparis hodginsii Callitropsis vietnamensis plastid KP099645.1 96% Chamaecyparis lawsoniana Chamaecyparis formosensis Thujopsis dolabrata KX832622.1 LC177668.1 KX832628.1 98% 99% 97% Calocedrus macrolepis KX832621.1 97% Calocedrus formosana KX832620.1 97% Calocedrus formosana Thuja standishii AB831010.1 KX832627.1 97% 96% 10 Callitropsis nootkatensis plastid KP099642.1 96% 26 Kết xây dựng phát sinh chủng loại thể nh  hình 3.4 Cây phân loại dựa vào tr nh tự đoạn matK tạo NCBI h n x t: Từ phân loại dựa số liệu trình tự gen matK, ta thấy: Lồi Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas có quan hệ gần gũi với loài theo thứ tự sau: Chamaecyparis hodginsii, Chamaecyparis lawsoniana, Chamaecyparis formosensis, Thujopsis dolabrata, Thuja standishii, Calocedrus formosana, Calocedrus macrolepis, Callitropsis nootkatensis plastid, Callitropsis vietnamensis plastid 3.3 r nh tự đoạn gen rbcL Trình tự gen rbcL phân tích có kích thước 599bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tương đồng 100 27 Kết giải trình tự đoạn gen rbcL mẫu Pơ mu sau: ATGTCACCAAAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTCGGATTCAAAGCG GGTGTTAAAGATTACAGATTAACTTATTATACTCCGGAATATCAGA CCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTCACTCCTCAACC TGGAGTGCCCCCCGAAGAAGCGGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATC TTCCACTGGTACGTGGACCACTGTTTGGACCGATGGACTTACCAGT CTTGATCGCTACAAGGGGCGATGCTATGATATTGAACCCGTTCCTG GAGAGGAAACTCAATTTATTGCCTATGTAGCTTACCCTTTGGATCT TTTTGAAGAAGGCTCTGTAACTAACCTGTTTACTTCTATTGTAGGT AATGTATTTGGATTCAAAGCTTTACGGGCTCTACGTCTGGAAGATT TACGAATTCCTCCTTCTTATTCAAAAACTTTTCAAGGCCCACCACA TGGTATTCAAGTAGAAAGAGATAAATTAAACAAATATGGTCGTCC TTTGTTGGGATGTACTATCAAACCAAAATTGGGTCTATCTGCCAAG AATTATGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATT TTAC Từ tương đồng trình tự gen rbcL lồi Pơ mu Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas , nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Pơ mu Do lấy trình tự mẫu đại diện cho lồi để phân tích kết So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen rbcL loài Pơ mu (Fokienia hodginsii (Dunn) Henry & H.H.Thomas với trình tự gen lồi Chamaecyparis lawsoniana công bố ngân hàng gen quốc tế NC I với mã số KX832622.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen thể hình 3.5 28 Range 1: to 599GraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1079 bits(584) 0.0 594/599(99%) 0/599(0%) Plus/Plus Query Sbjct Query 61 Sbjct 61 Query 121 Sbjct 121 Query 181 Sbjct 181 Query 241 Sbjct 241 Query 301 Sbjct 301 Query 361 Sbjct 361 Query 421 Sbjct 421 Query 481 Sbjct 481 Query 541 Sbjct 541 nh ATGTCACCAAAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTCGGATTCAAAGCGGGTGTTAAAGATTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGTCACCAAAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTCGGATTCAAAGCGGGTGTTAAAGATTAC 60 AGATTAACTTATTATACTCCGGAATATCAGACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTC |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| AGATTAACTTATTATACTCCGGAATATCAGACAAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTC 120 CGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTGCCCCCCGAAGAAGCGGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| CGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTGCCCCCCGAAGAAGCGGGGGCAGCAGTAGCTGCTGAA 180 TCTTCCACTGGTACGTGGACCACTGTTTGGACCGATGGACTTACCAGTCTTGATCGCTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTTCCACTGGTACGTGGACCACTGTTTGGACCGATGGACTTACCAGTCTTGATCGCTAC 240 AAGGGGCGATGCTATGATATTGAACCCGTTCCTGGAGAGGAAACTCAATTTATTGCCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGGGCGATGCTATGATATTGAACCCGTTCCTGGAGAGGAAACTCAATTTATTGCCTAT 300 GTAGCTTACCCTTTGGATCTTTTTGAAGAAGGCTCTGTAACTAACCTGTTTACTTCTATT |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| GTAGCTTACCCTTTAGATCTTTTTGAAGAAGGCTCTGTGACTAACCTGTTTACTTCTATT 360 GTAGGTAATGTATTTGGATTCAAAGCTTTACGGGCTCTACGTCTGGAAGATTTACGAATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAGGTAATGTATTTGGATTCAAAGCTTTACGGGCTCTACGTCTGGAAGATTTACGAATT 420 CCTCCTTCTTATTCAAAAACTTTTCAAGGCCCACCACATGGTATTCAAGTAGAAAGAGAT |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCCTGCTTATTCAAAAACTTTTCAAGGCCCACCACATGGTATTCAAGTAGAAAGAGAT 480 AAATTAAACAAATATGGTCGTCCTTTGTTGGGATGTACTATCAAACCAAAATTGGGTCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAATTAAACAAATATGGTCGTCCTTTGTTGGGATGTACTATCAAACCAAAATTGGGTCTA 540 TCTGCCAAGAATTATGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTAC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTGCCAAGAATTATGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTAC 60 120 180 240 300 360 420 480 540 599 599 Sự sai khác tr nh tự đoạn gen rbc loài Pơ mu (Fokienia hodginsii (Dunn) A enry & Thomas) nghiên cứu với loài Chamaecyparis lawsoniana NCBI 29 Từ kết thu được, nhận thấy tỷ lệ tương đồng trình tự gen rbcL lồi Pơ mu Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas) nghiên cứu với trình tự đoạn gen rbcK loài Chamaecyparis lawsoniana NC I 99 có điểm sai khác: Thay C b ng vị trí số 93 Thay T b ng C vị trí số 177 Thay G b ng vị trí số 315 Thay b ng G vị trí số 340 Thay T b ng G vị trí số 427 Tiếp tục so sánh với đoạn gen rcbL số lồi có trình tự tương đồng ngân hàng gen NC I b ng cách sử dụng công cụ L ST để thiết lập phát sinh chủng loại Một số lồi có trình tự gen rbcL tương đồng d ng so sánh với loài Pơ mu trình bày bảng 3.2 Bản ột s ồi c tr nh t n rbc t ơn n với oài Fokienia hodginsii ngân hàng gen NCBI STT s Tên loài Tỷ t ơn Chamaecyparis hodginsii MG269834.1 100% Callitropsis vietnamensis plastid KP099645.1 98% Chamaecyparis lawsoniana KX832622.1 99% Chamaecyparis formosensis LC177668.1 99% Thujopsis dolabrata KX832628.1 99% Calocedrus macrolepis KX832621.1 99% Calocedrus formosana KX832620.1 99% Calocedrus formosana AB831010.1 99% Thuja standishii KX832627.1 99% 10 Callitropsis nootkatensis plastid KP099642.1 98% 30 n Kết xây dựng phát sinh chủng loại thể nh  hình 3.6 Cây phân loại dựa vào tr nh tự đoạn rbc tạo NCBI h n x t: Từ phân loại dựa số liệu trình tự gen rbcL, ta thấy: Lồi Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas có quan hệ gần gũi với loài theo thứ tự sau: Chamaecyparis hodginsii, Chamaecyparis lawsoniana, Chamaecyparis formosensis, Thujopsis dolabrata, Thuja standishii, Calocedrus formosana, Calocedrus macrolepis, Callitropsis nootkatensis plastid, Callitropsis vietnamensis plastid 3.3 r nh tự đoạn gen trnH-psbA Trình tự gen trnH-psb phân tích có kích thước 435bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tương đồng 100 31 Kết giải trình tự đoạn gen trnH-psb mẫu Pơ mu sau: CGCGCGTGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGGAACCACTTG GCTACGTCCGCCCCAAACTAATTGGCAGTCTCTGTCTACGGTCATT CCATTTCAAGAATGGTTCTAAGCCCCGAAAATGAACTAATAATGA AACTATGCGATTAGATATTATGTATCCATGGCTGAATGGTAAAAGC ACCCAACTCATAATTGGGAAGTCGCGGGTTCAATTCCTGCTGGATG CACAGTAAACAGTTATTGTGCTCTGCTCGCAATAACTTTAAATTAG ACGGAAAAAGCAGTACCAGACCTTTCGGTTTTGGTACTGCTTTCTT TTTTGCTTTTCAAAGATTGAAAGACACTAACAATCCAGAGTAATTA GCCGTCTATAGAATTAGCTTCAACAGCAGCTAGATCCAGAGGGAA GTTGTGAGCGTTACGCTCGTGCATAAC Từ tương đồng trình tự gen trnH-psbA lồi Pơ mu Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas), nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Pơ mu Do lấy trình tự mẫu đại diện cho lồi để phân tích kết So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA loài Pơ mu (Fokienia hodginsii Dunn Henry & H.H.Thomas với trình tự gen lồi Chamaecyparis lawsoniana công bố ngân hàng gen quốc tế NC I với mã số KX832622.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen thể hình 3.7 32 Range 1: to 219GraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 394 bits(213) 4e-114 217/219(99%) 0/219(0%) Plus/Plus Query 142 Sbjct Query 202 Sbjct 61 Query 262 Sbjct 121 Query 322 Sbjct 181 GATTAGATATTATGTATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAGT |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATTAGATATTATGCATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAGT 201 CGCGGGTTCAATTCCTGCTGGATGCACAGTAAACAGTTATTGTGCTCTGCTCGCAATAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCGGGTTCAATTCCTGCTGGATGCACAGTAAACAGTTATTGTGCTCTGCTCGCAATAAC 261 TTTAAATTAGACGGAAAAAGCAGTACCAGACCTTTCGGTTTTGGTACTGCTTTCTTTTTT ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTCAATTAGACGGAAAAAGCAGTACCAGACCTTTCGGTTTTGGTACTGCTTTCTTTTTT 321 GCTTTTCAAAGATTGAAAGACACTAACAATCCAGAGTAA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTTTTCAAAGATTGAAAGACACTAACAATCCAGAGTAA 60 120 180 360 219 Range 2: 220 to 358GraphicsNext MatchPrevious MatchFirst Match Alignment statistics for match #2 Score Expect Identities Gaps Strand 257 bits(139) 6e-73 139/139(100%) 0/139(0%) Plus/Plus Query Sbjct 220 Query 61 Sbjct 280 Query 121 Sbjct 340 CGCGCGTGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGGAACCACTTGGCTACGTCCGCCCCAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCGCGTGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGGAACCACTTGGCTACGTCCGCCCCAAAC 60 TAATTGGCAGTCTCTGTCTACGGTCATTCCATTTCAAGAATGGTTCTAAGCCCCGAAAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAATTGGCAGTCTCTGTCTACGGTCATTCCATTTCAAGAATGGTTCTAAGCCCCGAAAAT 120 GAACTAATAATGAAACTAT ||||||||||||||||||| GAACTAATAATGAAACTAT 279 339 139 358 Range 3: 358 to 461GraphicsNext MatchPrevious MatchFirst Match Alignment statistics for match #3 Score Expect Identities Gaps Strand 159 bits(86) 2e-43 98/104(94%) 0/104(0%) Plus/Minus Query 157 Sbjct 461 Query 217 Sbjct 401 ATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAGTCGCGGGTTCAATTCC 216 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAGTCGCGGGTTCAATTCC 402 TGCTGGATGCACAGTAAACAGTTATTGTGCTCTGCTCGCAATAA ||||||||||||| ||| |||||||| |||||||| |||||| TGCTGGATGCACAATAAGCAGTTATTACACTCTGCTCACAATAA 260 358 Range 4: 462 to 536GraphicsNext MatchPrevious MatchFirst Match Alignment statistics for match #4 Score Expect Identities Gaps Strand 139 bits(75) 2e-37 75/75(100%) 0/75(0%) Plus/Plus Query 361 Sbjct 462 Query 421 Sbjct 522 TTAGCCGTCTATAGAATTAGCTTCAACAGCAGCTAGATCCAGAGGGAAGTTGTGAGCGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGCCGTCTATAGAATTAGCTTCAACAGCAGCTAGATCCAGAGGGAAGTTGTGAGCGTT ACGCTCGTGCATAAC ||||||||||||||| ACGCTCGTGCATAAC 420 521 435 536 nh Sự sai khác tr nh tự đoạn gen trn -psbA loài Pơ mu (Fokienia hodginsii (Dunn) A enry & Thomas) nghiên cứu với loài Chamaecyparis lawsoniana NCBI 33 Từ kết thu được, nhận thấy tỷ lệ tương đồng trình tự gen trnHpsb loài Pơ mu Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas) nghiên cứu với trình tự đoạn gen rbcK lồi Chamaecyparis lawsoniana NC I 99 có điểm sai khác: Thay T b ng C vị trí số 157 Thay G b ng vị trí số 230 Thay G b ng vị trí số 243 Thay T b ng C vị trí số 244 Thay G b ng vị trí số 245 Thay G b ng vị trí số 254 Thay vị trí số 265 b ng C Tiếp tục so sánh với đoạn gen trnH-psb số lồi có trình tự tương đồng ngân hàng gen NC I b ng cách sử dụng công cụ L ST để thiết lập phát sinh chủng loại Một số lồi có trình tự gen trnH-psb tương đồng d ng so sánh với lồi Pơ mu trình bày bảng 3.3 Bản ột s oài c tr nh t n trnH-psb t ơn n với oài Fokienia hodginsii ngân hàng gen NCBI STT s Tên loài Tỷ t ơn Chamaecyparis hodginsii MG269834.1 99% Callitropsis vietnamensis plastid KP099645.1 85% Chamaecyparis lawsoniana KX832622.1 99% Chamaecyparis formosensis LC177668.1 98% Thujopsis dolabrata KX832628.1 93% Calocedrus macrolepis KX832621.1 90% Calocedrus formosana KX832620.1 90% Calocedrus formosana AB831010.1 90% Thuja standishii KX832627.1 91% 10 Callitropsis nootkatensis plastid KP099642.1 85% 34 n Kết xây dựng phát sinh chủng loại thể hình 3.8 nh Cây phân loại dựa vào tr nh tự đoạn rbc tạo NCBI  h n x t: Từ phân loại dựa số liệu trình tự gen trnH-psbA, ta thấy: Lồi Fokienia hodginsii (Dunn) A.Henry & H.H.Thomas có quan hệ gần gũi với loài theo thứ tự sau: Chamaecyparis hodginsii, Chamaecyparis lawsoniana, Chamaecyparis formosensis, Thujopsis dolabrata, Thuja standishii, Calocedrus formosana, Calocedrus macrolepis, Callitropsis nootkatensis plastid, Callitropsis vietnamensis plastid 3.3 So s nh năn phân i t c o n tr nh t matK, rbcL trnH- psbA Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen matK, rbcL trnHpsb Fokienia hodginsii Dunn Henry & H.H.Thomas với trình tự gen lồi Chamaecyparis lawsoniana, ta lập bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psb bảng 3.4 35 Bản Bản so s nh năn phân i t c o n tr nh t matK, rbcL trnH-psbA Tên đoạn gen matK rbcL trnH-psbA Số điểm sai khác 10 Kích thước trình tự 616 599 435 Tỷ lệ sai khác  1,62% 0,83% 1,61% h n x t: Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK, rbcL trnH- psb loài Pơ mu với loài Chamaecyparis lawsoniana: trình tự đoạn gen matK có 10 điểm sai khác, trình tự đoạn gen rbcL có điểm sai khác trình tự đoạn gen trnH-psb có điểm sai khác Tỉ lệ sai khác trình tự matK cao 1,62 khả phân biệt lồi gen matK tốt tỉ lệ sai khác trình tự rbcL thấp 0,83 đồng nghĩa với khả phân biệt loài gen Tỉ lệ sai khác trình tự trnHpsb 1,61 thấp matK 1,62 nên đoạn gen trnH-psb không đáng kể 0,1 cao rbcL cho kết tương quan có độ xác khơng nhỏ Kết tương quan loài mà gen trnH-psb thị hoàn toàn ph hợp với phân loại lồi trước dựa vào hình thái M c d vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psb thể xác định xác lồi cần định danh 36 để có G T U V G t u n 1.Đã tách chiết tinh DN t ng số mẫu Pơ mu 2.Đã nhân thành công gen matK, rbcL trnH-psb b ng k thuật PCR từ DN t ng số mẫu thu 3.Đã xác định trình tự đoạn gen matK, rbcL trnH-psb Pơ mu Với gen matK tìm sai khác có hệ thống sử dụng định danh lồi Gen trnH-psb có sai khác loài nhỏ gen matK lớn gen rbcL sử dụng định danh lồi Gen rbcL có sai khác lồi nhỏ gen cịn lại sử dụng cách độc lập để định danh đánh giá đa dạng Ngồi d ng kết hợp với đoạn gen khác để làm tăng độ xác định danh đánh giá i nn h  Cơng bố trình tự gen matK, rbcL trnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau  Tiếp tục xác định đoạn DN barcode khác đối tượng Pơ  Tiếp tục thu thập mẫu Pơ mu mu v ng địa lý khác để đánh giá tồn diện tính đa dạng di truyền loài  Nghiên cứu ứng dụng mã vạch DN liệu DN barcode cho loài thực vật  để xây dựng s Việt Nam Sử dụng gen matK, rbcL trnH-psbAvào việc giám định loài Pơ mu Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định loài khác nh m phân loại cách xác cụ thể 37 T T UT GV UT T Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Thăng 2008 , “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NX Đại học Quốc Gia Hà Nội Hồ Hu nh Th y Dương 2005 , Sinh học phân tử, NX Giáo Dục – Hà Nội, trang 191-198 Khuất Hữu Thanh 2006 , Kỹ thuật gen nguyên l ứng d ng, NXB Khoa học k thuật Hà Nội Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi 2004 , Kỹ thuật di truyền ứng d ng, NX Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lượng 2002 , Công nghệ gen NX Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Triệu Văn Hưng 2007 , âm sản gỗ iệt Nam, Dự án H trợ Chuyên ngành Lâm sản gỗ Việt Nam – Pha II, trang 724-727 T UT G Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W 2003 , “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 Hollings worth Pm, G.S Little Dp 2011 , “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PloS ONE, 65 Kress W J., Erickson D L 2008 , “DN barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 10 Miwa H, O.I Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et, Al 2009 ,”Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, Gene, 441, pp 169 – 175 11 Ole S and Gitte P 2009 , “How many loci does it take to DN barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 12 Shaw J., Lickey E ., Schilling E E., Small R.L 2007 ,” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 13 Storchova H., M S Olson 2007 , “The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 14 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian , and Eske W 2007 ,” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 15 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto renas M ., Culham , Chase M W 2000 , “ phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS of ribosomal DN ”, Lindleyana (15), pp.96114 16 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders 2009 , “DN barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources(9), pp.1086-1091 17 Vijayan K and Tsou C H 2010 , “DN barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 1540 18 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R 2010 “DN barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 19 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J 2010 , “Use of ITS2 region as theuniversal DN barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 20 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010 “ uthentication of Taxillus chinensis using DN barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 WEBSITE 21 https://vi.wikipedia.org/Pơ_mu