Bước đầu xây dựng một số quy trình chế tạo bộ kit lamp trong chẩn đoán echinococcus

BCKQ-YTCC BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ H P Tên đề tài: BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG MỘT SỐ QUY TRÌNH CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN ECHINOCOCCUS U Chủ nhiệm đề tài: ThS BS Nguyễn Thị Anh Vân Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trường Đại học Y tế Cơng cộng Mã số đề tài (nếu có): H Năm 2021 i BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ H P Tên đề tài: Bước đầu xây dựng số quy trình chế tạo kit LAMP chẩn đoán Echinococcus Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Anh Vân Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y tế Công cộng Cấp quản lý: Trường Đại học Y tế Công cộng Mã số đề tài (nếu có): Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2020 đến tháng 8/2021 Tổng kinh phí thực đề tài: 160.300.000 đồng Trong đó: kinh phí SNKH ……… đồng Nguồn khác (nếu có) ……….đồng U H Năm 2021 ii Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp sở Tên đề tài: Bước đầu xây dựng số quy trình chế tạo KIT LAMP chẩn đoán Echinococus Chủ nhiệm đề tài: ThS BS Nguyễn Thị Anh Vân Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y tế Công cộng Cơ quan quản lý đề tài: Trường Đại học Y tế Công cộng Thư ký đề tài: BS Phí Thị Hương Liên Phó chủ nhiệm đề tài ban chủ nhiệm đề tài (nếu có): H P Danh sách người thực chính: - PGS.TS Nguyễn Thu Hương (Trường ĐHYTCC) - CN Nguyễn Phương Thoa (Trường ĐHYTCC) - SV Nguyễn Đức Trung (Trường ĐHYTCC) - ThS Ngô Văn Lăng (Trường ĐHYTCC) - CN Nguyễn Linh Chi (Trường ĐHYTCC) - ThS Nguyễn Minh Tồn (Trường ĐHYTCC) - BS Phí Thị Hương Liên (Trường ĐHYTCC) - Lê Bảo Ngân (Trường Khoa học Tự Nhiên) - Nguyễn Ngọc Hương Ly (Trường Khoa học Tự Nhiên) U H Thời gian thực đề tài từ tháng 12/2020 đến tháng 8/2021 iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADN BIP bp Bst Co Ltd Tiếng Anh đầy đủ Acid Deoxyribonucleic Backward Inner Primer Base Pair Bacillus stearothermophilus Limited Company Cox1 dNTPs Cytochrome c oxydase subunit deoxyribonucleotide triphosphate ELISA Enzyme-Linked immunosorbent Assay FIP FP FN MG HNB K KST KSTSR LAMP Forward Inner Primer False positive False negative) Malachite Green Hydroxy Napthol Blue Kappa NCBI NIMPE P Plasmid PTN PCR Tm RFLP Rnase Nghĩa/Tên tiếng Việt Axit deoxyribonuclotid Mồi ngược Cặp nucleic Công ty trách nhiệm hữu hạn Gen ty thể Cox1 Các nucleotit tự gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP H P Phản ứng miễn dịch hấp phụ liên kết enzym Mồi xi Dương tính giả Âm tính giả Xanh malachit U Hệ số tương đồng Ký sinh trùng Ký sinh trùng sốt rét Loop Isothermal Median Ampification Khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian National Center for Biotechonogy Trung tâm tin sinh học Information quốc gia – Mỹ National Institute of Malariology, Viện Sốt rét – Ký sinh Parasitology and Entomology trùng - Côn trùng trung ương Prevalance Tỷ lệ nhiễm Phân tử ADN vịng, nhỏ, khơng mang hệ gen gen Phịng thí nghiệm Polymerase chairn reaction Phản ứng chuỗi Polymerase Temparature melting Nhiệt độ nóng chảy Restriction fragment length Đa hình đoạn phân cắt polymorphism giới hạn Ribonuclease Enzym loại bỏ ARN H iv Se SR Sp SHPT TN TP WHO Độ nhạy Sốt rét Độ đặc hiệu Sinh học phân tử Âm tính thật Dương tính thật Tổ Chức Y tế giới Sensitivity Specificity True negative True positive World Health Organization H P U H v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Yêu cầu độ dài mồi 24 Bảng 3.2 Yêu cầu nhiệt độ nóng chảy mồi 24 Bảng 4.1 Tập hợp trình tự gen sán dây nhỏ chó ngân hàng gen 31 sử dụng cho thiết kế mồi LAMP chẩn đốn sán dây nhỏ chó 31 Bảng 4.2 Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đốn sán dây nhỏ chó 32 Bảng 4.3 Kết hoạt động cặp mồi F3-B3 đặc hiệu Echinococcus spp 34 Bảng 4.4 Báo cáo quan sát chất thị màu MG nồng độ khác 35 Bảng 4.5 Kết khảo sát ngưỡng phát mồi LAMP 40 H P Bảng 4.6 Khảo sát ngưỡng phát Kít chẩn đốn sán dây nhỏ chó 40 Bảng 4.7 Kết xác định độ nhạy độ đặc hiệu Kít LAMP so với qPCR 42 Bảng 4.8 Kết xét nghiệm Echinococcus-LAMP chế tạo mồi Salant CS, 2012 42 U Bảng 4.9 Thành phần kít 43 Bảng 4.10 Thành phần phản ứng LAMP 43 H Bảng 4.11 Điều kiện phản ứng LAMP 43 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân bố trường hợp Echinococcosis Đơng Nam Á Hình 2.2 A Nang nước não thùy thái dương phải B Ba nang não hydatid nguyên vẹn bóc tách sau mổ 11 Hình 2.3.: Các vị trí bám mồi 15 Hình 2.4 Tạo vật liệu khởi đầu 17 Hình 2.5 Tái kéo dài chuỗi ADN 18 Hình 2.6 Nguyên lý phản ứng LAMP 18 Hình 2.7 Hình ảnh tách chiết AND, ARN từ mẫu thu thập 19 H P Hình 2.8 Hình ảnh thao tác thực kỹ thuật LAMP 19 Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 Hình 4.1 Kết gióng trình tự gen 18S rARN sán dây nhỏ chó phần mềm MEGA 33 Hình 4.2 Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi F3-B3 Echinococcus spp 34 U Hình 4.3 Sản phẩm LAMP sử dụng mồi tự thiết kế đặc hiệu cho Echinococcus spp 35 Hình 4.4 Plasmid tái tổ hợp mang gen 18S rARN Echinococcus spp 36 H Hình 4.5 Sản phẩm LAMP khảo sát dải nhiệt độ 60 oC – 65oC 37 Hình 4.6 Sản phẩm LAMP khảo sát nồng độ khác 38 Hình 4.7 Sản phẩm LAMP sau thời gian phản ứng 39 Hình 4.8 Phản ứng màu mẫu chứng dương âm 39 vii MỤC LỤC PHẦN A: BÁO CÁO TÓM TẮT NGHIÊN CỨU PHẦN B: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI PHẦN C: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ Đặt vấn đề: Tổng quan đề tài: 2.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh echinococcosis 2.2 Đặc điểm tác nhân gây bệnh bệnh lý Echinococcus gây H P 2.3 Các phương pháp xét nghiệm ký sinh trùng 11 2.4 Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian LAMP 15 3.Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 20 3.1 Thiết kế nghiên cứu 20 3.2 Đối tượng nghiên cứu 21 U 3.3 Phương pháp chọn mẫu 22 3.4 Phương pháp thu thập số liệu 23 H 3.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 28 3.7 Đạo đức nghiên cứu 29 Kết nghiên cứu 30 Bàn luận: 45 Kết luận kiến nghị: 48 Tài liệu tham khảo 49 Phụ lục 53 Phụ lục HƯỚNG DẪN TÁCH CHIẾT PATHOGENE SPIN 53 Phụ lục 2.HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN BỘ KÍT LAMP CHẨN ĐỐN SÁN DÂY CHĨ ECHINOCOCCUS 54 Phụ lục TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN 58 Phụ lục MỘT SỐ ẢNH TẠI THỰC ĐỊA VÀ PHỊNG THÍ NGHIỆM 59 viii PHẦN A: BÁO CÁO TÓM TẮT NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG MỘT SỐ QUY TRÌNH CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN ECHINOCOCCUS ThS.BS Nguyễn Thị Anh Vân (Trường ĐHYTCC) PGS.TS Nguyễn Thu Hương (Trường ĐHYTCC) CN Nguyễn Phương Thoa (Trường ĐHYTCC) H P SV Nguyễn Đức Trung (Trường ĐHYTCC) ThS Ngô Văn Lăng (Trường ĐHYTCC) CN Nguyễn Linh Chi (Trường ĐHYTCC) ThS Nguyễn Minh Toàn (Trường ĐHYTCC) BS Phí Thị Hương Liên (Trường ĐHYTCC) U Lê Bảo Ngân (Trường Khoa học Tự Nhiên) Nguyễn Ngọc Hương Ly (Trường Khoa học Tự Nhiên) H * Tóm tắt Đặt vấn đề: Bệnh nang nước (hydatid deseases) hay gọi bệnh hydatidosis echinococcosis bệnh nhiễm ký sinh trùng lây truyền từ chó sang người Người nhiễm bệnh nuốt phải trứng sán thức ăn, nước uống đất bị ô nhiễm, sau tiếp xúc trực tiếp với vật chủ động vật Việc chẩn đoán bệnh truyền lây chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng xét nghiệm miễn dịch phát kháng thể lưu hành máu Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng thường không đặc hiệu thời gian ủ bệnh dài có biểu bệnh muộn để tiến hành điều trị, đặc biệt giá trị chẩn đoán xét nghiệm miễn dịch nhiều tranh cãi độ nhạy độ đặc hiệu Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian (Loop Isothermal Median Ampification – LAMP) kỹ thuật sinh học phân tử mới, có độ nhạy độ đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR, không địi hỏi trang thiết bị đắt tiền tiến hành thực địa H P Mục tiêu: (1) Mục tiêu 1: Thiết lập năm quy trình chế tạo kít LAMP bao gồm thiết kế mồi LAMP, tối ưu hóa điều kiện phản ứng LAMP, tạo chứng chuẩn dương DNA tái tổ hợp, xác định ngưỡng phát kít xác định điều kiện bảo quản tính ổn định kít (2) Mục tiêu 2: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kít LAMP phạm vi cộng động hẹp U Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực hai nhóm đối tượng để phục vụ cho hai mục tiêu Với mục tiêu thiết lập năm quy trình chế tạo kít LAMP chẩn đoán Echinococcus, đối tượng nghiên cứu mẫu ấu trùng sán dây nhỏ chó Echinococcus Với mục tiêu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kít phạm vi cộng đồng hẹp, đối tượng nghiên cứu Kít LAMP chẩn đốn Echinococcus Thực nghiệm, so sánh phịng thí nghiệm gồm hoạt động cụ thể sau:  Thiết kế mồi LAMP để chẩn đốn Echinococcus, kiểm nghiệm độ xác khả hoạt động mồi  Tạo chuẩn dương cho Kít  Xây dựng quy trình tiến hành phản ứng LAMP tối ưu hóa điều kiện phản ứng (nhiệt độ bám mồi, thời gian tiến hành phản ứng, nồng độ loại hóa chất hỗn hợp phản ứng: MgSO4, chất thị màu)  Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát phản ứng LAMP  Xác định điều kiện bảo quản tính ổn định Kít Đóng gói thành phẩm Kít Kết quả: + Quy trình thiết kế mồi cho kỹ thuật LAMP H sản phẩm khuếch đại, MgSO4 nồng mM cho sản phẩm không ổn định, hiệu suất không cao, MgSO4 nồng độ mM cho sản phẩm LAMP với hiệu suất khuếch đại cao ổn định Do vậy, chọn MgSO4 mM nồng độ tối ưu cho phản ứng LAMP Chất thị màu sử dụng để đọc kết LAMP Có nhiều nghiên cứu chứng minh kỹ thuật LAMP kỹ thuật có độ đặc hiệu cao, độ nhạy, thời gian phản ứng ngắn cho phép phát sản phẩm khuếch đại trực quan đơn giản cách quan sát độ đục, thuốc nhuộm huỳnh quang thuốc nhuộm thị pH Mỗi cách thức lại có ưu nhược điểm riêng Mặc dù độ đục kết tủa trắng (magie pyrophosphate) tạo sau phản ứng LAMP phát mắt thường, có độ chụm ngắn (khoảng 5-10 giây) sau lấy mẫu khỏi máy ủ nhiệt Do vậy, cách phát cần máy đo độ đục thời gian thực để có kết H P luận xác Gần đây, chất thị màu MG sử dụng thành công chất thị nhạy với pH để phát sản phẩm LAMP Sự thay đổi màu sắc MG (dạng cation) phụ thuộc vào pH dung dịch (pH10: không màu) Bước sóng hấp thụ cho MG 621 nm Trong xét nghiệm LAMP-MG, mẫu dương tính âm tính dễ dàng phân biệt mắt thường màu xanh nhạt không màu, tương ứng U Việc bổ sung MG vào đệm LAMP trước tiến hành phản ứng không ảnh hưởng đến hoạt động Bst DNA polymerase, đồng thời loại bỏ nguy tạp nhiễm mẫu Ưu điểm xét nghiệm LAMP-MG cải thiện khắc phục hạn chế từ phát LAMP khác đề cập Do nghiên cứu này, lựa chọn MG làm chất thị màu để đọc kết sau phản ứng LAMP Các nồng độ MG khảo sát 0,012, 0,008, 0,004 0,001% Kết cho thấy, có tương đồng 100% người quan sát kết luận nồng độ MG 0,004% nồng độ tối ưu phân biệt mẫu dương tính âm tính H Tạo chứng chuẩn dương DNA tái tổ hợp Các bước tạo chứng dương thực theo “Quy trình tạo chứng dương cho Kít LAMP chẩn đốn sán dây nhỏ chó người cơng nghệ DNA tái tổ hợp” Đoạn trình tự bảo tồn gen 18s rRNA sán dây Echinococcus spp có kích thước 596 bp chèn vào vector pUC19 nhân dịng Kết chúng tơi thu Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rARN đặc trưng cho sán dây nhỏ chó có kích thước 3282bp Lượng Plasmid thu hồi 5µg hịa tan 50µL để thu nồng độ100ng/µL Ngưỡng phát kỹ thuật LAMP 46 Trong nghiên cứu này, ngưỡng phát kỹ thuật LAMP 10-8 ng/phản ứng, tương đương với 0,294 sao/ phản ứng Ngoài ra, tiến hành thử nghiệm ngưỡng phát kỹ thuật LAMP với mồi tự thiết kế dãy nồng độ pha loãng DNA tổng số, tách chiết từ mẫu mô SLGL trưởng thành Kết cho thấy ngưỡng phát đạt 10-8 ng Ngưỡng phát tương đương, chí tốt so với nghiên cứu khác tác giả giới với ngưỡng phát từ 10-3 [12] đến 10-5 ng [10] Đồng thời, kỹ thuật LAMP cho kết tốt với khả phát ngưỡng thấp tiến hành mẫu giả định Xác định điều kiện bảo quản tính ổn định kít Bộ sinh phẩm đóng gói 50 phản ứng/kít bảo quản nhiệt độ - 20oC ± 5oC Trong kít gồm 06 lọ thành phần dạng dung dịch tờ hướng dẫn sử dụng bảo quản kít LAMP chẩn đốn sán dây chó Echinococcus H P Do thời gian hạn chế nghiên cứu nên tiến hành thử nghiệm tính ổn định Kít thời gian tháng bảo quản cho thấy kết hai lần thử nghiệm có kết độ nhạy độ đặc hiệu kít 93,55% 99,33% Kết hoàn toàn đồng với độ nhạy độ đặc hiệu thử nghiệm ban đầu Kít (93,55% 99,33%) Thử nghiệm 3: Sẽ tiếp tục sau 11 tháng bảo quản điều kiện -20oC ± 5oC, U tiến hành thực thí nghiệm phản ứng LAMP với điều kiện tối ưu 6.2 Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu KIT LAMP phạm vi quy mô cộng đồng hẹp Thử nghiệm với 30 mẫu huyết bệnh nhân xác định dương tính ELISA với Echinococcus; xác định có mẫu dương tính kỹ thuật real-time PCR LAMP Pha loãng mẫu dung dịch muối bão hòa NaCl 0,9% 10 mẫu Tiến hành thử nghiệm lặp lại lần mẫu, kết độ nhạy độ đặc hiệu so với qPCR kít LAMP chẩn đốn Echinococcus chế tạo có độ nhạy 93,55%, độ đặc hiệu 99,33% phù hợp cao (Kappa = 0,92 > 0,8) Như so sánh với kỹ thuật qPCR, Kít LAMP chúng tơi cho hiệu chẩn đốn bệnh Echinococcus H tương tự Tuy nhiên để ứng dụng lâm sàng cần thử nghiệm so sánh với cỡ mẫu lớn hơn, sau thử nghiệm tính ổn định kết thúc cho kết kỳ vọng nhóm nghiên cứu tiếp tục thu thập mẫu thử nghiệm thời gian 12 tháng cỡ mẫu cộng đồng lớn thời gian tới 47 Kết luận: - - Thiết lập năm quy trình chế tạo kít LAMP: Bộ sản phẩm khuếch đại LAMP gồm thành phần Trong đó, cặp mồi thiết kế có kích thước 228bp, chứng dương tạo kèm kít có nồng độ 100ng/µL Phản ứng LAMP chế tạo có nồng độ MG 0,004% MgSO4 mM, phản ứng khuyết đại gen mồi 63oC 60 phút, ngưỡng phát Kít 10-8 ng/µL tương ứng với 2,82x10o gen/µL Độ nhạy, độ đặc hiệu: Độ nhạy 93,55% độ đặc hiệu 99,33%, tính ổn định sinh phẩm LAMP chẩn đốn Echinococcus 12 tháng sản xuất Khuyến nghị - - - Ứng dụng lâm sàng chẩn đốn bệnh giảm chi phí cho người bệnh, tiết kiệm trang thiết bị Có thể áp dụng thực địa phòng xét nghiệm Chế tạo kít LAMP thực phịng thí nghiệm mà khơng cần trang thiết bị đặc biệt phù hợp cho việc phát tác nhân gây bệnh Có khả áp dụng thực tiễn để đánh giá sàng lọc lâm sàng ca bệnh nghi ngờ điều tra đánh giá thực trạng nhiễm Echinoccocus diện rộng Tiếp tục thử nghiệm cỡ mẫu lớn để xác định độ nhạy độ đặc hiệu, thử nghiệm tính ổn định sinh phẩm H P U H 48 Tài liệu tham khảo Abdel Aatya H.E., D.M Abdel-Hameeda, Y.H Alam-Eldina et al Molecular genotyping of Echinococcus granulosus in animal and human isolates from Egypt Acta Tropica 2012;121:125-128 Aboelhadida M., Khaled M El-D., Tokuma Y.,et al Molecular characterization of Echinococcus granulosus in Egyptian donkeys Veterinary Parasitology 2013;193:292-296 Adwan G., Kamel A., Sami B., Sameh A (), Molecular characterization of Echinococcus granulosus isolated from sheep in Palestine Experimental Parasitology 2013;134:195-199 Ali TI Ibrahim OEm, Al-sultan II Hydatid hepatic-broncho-pleural (hepatopulmonary) fistula caused by Echinococcosis granulosa: a zoonotic case report Malaysian Journal of Veterinary Research 2018;9:91-97 Anh Đào Nguyễn Thị, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Lê Thị Hiên Ứng dụng kỹ thuật LAMP để phát Listeria monocytogenes thực phẩm Tạp chí y học TP Hồ Chí Minh 2012;16(3): 27-32 Avcioglu H., Esin G., Ibrahim B., et al (2016) First Molecular Characterization of Echinococcus multilocularis in Turkey Vector-borne and zoonotic diseases 2016;20(20) Mary Ann Liebert, Inc Doi: 10.1089/vbz.2016.1983 Aziz, F.A., Zainudin, N.S., Noordin, R A pentaplex real-time polymerase chain reaction assay for detection of four species of soil-transmitted helminths Am J Trop.Med Hyg 2011;84:338e343 Balbinotti H, Santos G, Badaraco J, et al Echinococcus ortleppi (G5) and echinococcus granulosus sensu sticto (G1) loads in cattle from Southern Brazil Veterinary Parasitology 2012;188:255-260 Bennett, J., Dolin, R., Blaser, M., Mandell, G & Douglas, R (2014) Mandell, Do uglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases (8th edition) Philadelphia, PA: Elsevier/Saunders 10 Boufana B, Stidworthy M, Bell S, Chantrey J, Masters N, Unwin S, et al Echinococcus and Taenia spp from captive mammals in the United Kingdom Veterinary Parasitology 2012;190:95-103 11 Casulli A., Eberhard Z., Enrico B., et al Molecular evidence of the camel strain (G6 genotype) of Echinococcus granulosus in humans from Turkana, Kenya Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2010;104:29-32 12 Cruz M.L., Perez A., Domínguez M., et al., "Assessment of the sensitivity and specificity of serological (IFAT) and molecular (direct‐PCR) techniques for diagnosis of leishmaniasis in lagomorphs using a Bayesian approach", Veterinary Medicine and Science, 2016;2(3):211-220 13 De Nguyen V, Le Van D The first report of two cases of cystic echinococcosis in the lung by Echinococcus ortleppi infection, in Vietnam Research and Reports in Tropical Medicine 2017;8:45-51 14 Deplazes P, Rinaldi L, Rojas C, Torgerson P, Harandi M, Romig T, et al Global distribution of Alveolar and Cystic Echinococcosis Advances in Parasitology 2017;95:315-493 H P U H 49 15 Dinkel A, Njoroge E, Zimmermann A, Walz M, Zeyhle E, Elmahdi I, et al A PCR system for detection of species and genotypes of the Echinococcus granulosus-complex, with reference to the epidemiological situation in Eastern Africa International Journal for Parasitology 2004;34:645-653 16 DP MM Echinococcosis with Particular Reference to Southeast Asia 1st ed Elsevier Ltd.; 2010 17 Eiken Chemical Co Ltd The principle of LAMP method http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html truy cập ngày 26/8/2020 18 Eryıldız1C., Nermin Ş., (2012) Molecular Characterization of Human and Animal Isolates of Echinococcus granulosus in the Thrace Region, TurkeyBalkan Med J 2012; 29: 261-7 • DOI: 10.5152/balkanmedj.2012.072 19 Garcia L.S., 2016 Diagnostic medical parasitology, 6th ed ASM Press, Washington, DC 20 Harandi M F., et al Molecular and morphological characterization of Echinococcus granulosus of human and animal origin in Iran Parasitology 2002;125:367-373 21 Heymann, D Control of Communicable Diseases Manual (20th edition) Washin gton, DC: American Public Health Association, 2015:178 - 183 22 Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) hướng việc tạo Kít phát nhanh bệnh truyền nhiễm Tạp chí khoa học cơng nghệ 2011;90(02): 43-48 23 Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn Phát triển kỹ thuật LAM (Loop- mediated isothermal amplification) cho việc phát nhanh xác vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 Tạp chí sinh học 2012;34(03): 343-346 24 Hồng Văn Minh Lưu Ngọc Hoạt Phương pháp chọn mẫu tính toán cỡ mẫu nghiên cứu khoa học sức khỏe Trường Đại học Y tế công cộng tr.26-32 http://adhere.vn/uploads/plugin/file/157/1597042201-70211094-sampling-andsample-size.pdf, truy cập ngày 02/8/2020 25 Hong Ngoc NT, Huong Binh NT, Hong NV, Thang ND, Huong NT, et al Inhouse validation of a lamp Kít for diagnosis of Plasmodium, Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax in Vietnam Glob J Infect Dis Clin Res 2020;6(1): 048-053 DOI: https://doi.org/10.17352/2455-5363.000035 26 Hu D., X Song, N Wang, et al Molecular identification of Echinococcus granulosus on the Tibetan Plateau using mitochondrial DNA markers Genet Mol Res 2015;14 (4): 13915-13923 27 Jalleh R, Nuruddin R, Krishnan M Hydatidosis: diagnostic and therapeutic aspects Singapore Medical Journal 1989;30:210-212 28 Jawad R.A., Ihsan M S., Yasser J J et al Molecular Detection of Echinococcus granulosis from Visceral Organs of Cattle Abattoirs-Kerbala Province Journal of pure and applied microbiology, 2018;12(2):701-704 29 Katharina Kopp (2017) Development of real-time polymerase chain reaction assays allowing molecular detection of Echinococcus felidis, Echinococcus granulosus sensu stricto, and Echinococcus canadensis in carnivore feces samples, animal and human hydatid cyst material from Uganda and Kenya bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/211920 H P U H 50 30 Latif A A., Akhtar T., Azhar M., et al Morphological and molecular characterisation of Echinococcus granulosus in livestock and humans in Punjab, Pakistan Veterinary Parasitology 2010;170:44–49 31 Lavikainen, Lehtinen M J., et al (2003) Molecular genetic characterization of the Fennoscandian cervid strain, a new genotypic group (G10) of Echinococcus granulosus Parasitology 2003;127:207-215 32 Ma C., F Wang, X Wang, et al (2017), A novel method to control carryover contamination in isothermal nucleic acid amplification Chem Commun., DOI: 10.1039/C7CC06469A 33 Mackenzie D, Statistical aspects of screening tests, including knowledge of and ability to calculate, sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, and the use of ROC curves 2017 truy cập trang web https://www.healthknowledge.org.uk 34 McManus D P Current status of the genetics and molecular taxonomy of Echinococcus species Parasitology, 2013:1 -7 35 Mcmanus DP, Zhang W, Li J, et al Echinococcosis Lancet 2003;362:1295-1304 36 Meurs L, Polderman A.M, Vinkeles Melchers N.V., et al Diagnosing polyparasitism in a high-prevalence setting in Beira, Mozambique: detection of intestinal parasites in fecal samples by microscopy and real-time PCR PLoS Negl Trop Dis 2017;11:e0005310 Doi.org/10.1371/journal.pntd 0005310 37 Moghaddas E., H Borji1, A Naghibi et al Molecular genotyping of Echinococcus granulosus from dromedaries (Camelus dromedarius) in eastern Iran Journal of Helminthology 2015;89:100–104 38 Moradi M, Meamar AR, Akhlaghi L, Roozbehani M, Razmjou E Detection and genetic characterization of Echinococcus granulosus mitochondrial DNA in serum and formalin-fixed paraffin embedded cyst tissue samples of cystic echinococcosis patients PLoSONE 2019;14(10): e0224501 https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0224501 39 Morakote N, Thamprasert K, Lojanapiwat B, et al Cystic echinococcosis in Thailand with a species note on detection by serology in one family The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 2007;38:796799 40 Myriam O & Selim M., Amine K., et al First molecular evidence of the simultaneous human infection with two species of Echinococcus granulosus sensu lato: Echinococcus granulosus sensu stricto and Echinococcus canadensis Parasitol Res 2016;115:1065–1069 Doi 10.1007/s00436-015-4836-x 41 Naeger D.M;, Kohi M.P;, Webb E.M; et al Correctly using sensitivity, specificity, and predictive values in clinical practice: how to avoid three common pitfalls, American Journal of Roentgenology, 2013; 200(6):W566-W570 42 Nakao M, Lavikainen A, Yanagida T, et al Phylogenetic systematics of the genus Echinococcus (Cestoda: Taeniidae) International Journal for Parasitology 2013;43:1017-1020 43 Nakao M., Tetsuya Y., Munehiro O., et al State-of-the-art Echinococcus and Taenia: Phylogenetic taxonomy of human-pathogenic tapeworms and its application to molecular diagnosis Infection, Genetics and Evolution 2010;10:444–452 H P U H 51 44 Nejad M R., N Taghipour, Z Nochiet et al Molecular identification of animal isolates of Echinococcus granulosus from Iran using four mitochondrial genes Journal of Helminthology 2012;86:485–492 45 Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Nguyễn Thị Hương Bình, Nguyễn Thu Hương, Nguyễn Thị Thu Huyền, Trần Văn Hải, Trần Thanh Dương Phát triển kỹ thuật LAMP phát sán gan lớn Fasciola spp Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt nam 2020;62(7):23-28 46 Nguyễn Thị Hương Bình (2015) “Báo cáo tổng kết nhiệm vụ khoa học thường quy: Ứng dụng phát triển kỹ thuật LAMP để định loại P falciparum P.vivax phịng thí nghiệm, năm 2015” 47 Nicolao M C., Andrea C Cuminoa Biochemical and molecular characterization of the calcineurin in Echinococcus granulosus larval stages Acta Tropica 2015;146:141–151 48 Nishikawa R.M; Pesce L.L (2013), "Estimating sensitivity and specificity for technology assessment based on observer studies", Academic radiology, 20(7), p 825-830 49 Nugent W R., The role of prevalence rates, sensitivity, and specificity in assessment accuracy: Rolling the dice in social work process, Journal of social service research 2005;31(2), p 51-75 50 Oscorbin I.P., Belousova E.A., Zakabunin A.I.et al, Comparison of fluorescent intercalating dyes for quantitative loop- mediated isothermal amplification (qLAMP) Biotechniques 2016;61:20-25 https://doi.org/10.2144/000114432 H P U H 52 Phụ lục Phụ lục HƯỚNG DẪN TÁCH CHIẾT PATHOGENE SPIN B1 Cho 300µl dd lysis buffer ống chưa mẫu B2 Chuyển 150µl mẫu tách chiết ống 1.5ml, vortex 10-15 giây B3 Ủ nhiệt độ phịng 10 phút B4 Cho 300µl binding buffer VÀO ống trộn cách lật ống 3-5 lần, spindown 3-5 giây B5 Chuyển 750µl dung dịch ống tách vào cột lọc, ly tâm phút 13000 rpm, loại bỏ dịch thừa ống thu bên dưới, úp khô lắp lại cột lọc B6 Cho 500µl washing buffer A vào cột lọc ly tâm 13000 rpm phút, loại bỏ dung dịch ống thu úp kho lắp lại cột lọc B7 Cho 500µl washing buffer B vào cột lọc ly tâm 13000 rpm phút loại bỏ dung dịch ống thu úp khô lắp lại cột lọc B8 Ly tâm 13000 rpm phút làm khô màng lọc, loại bỏ ống thu, thay ống ly tâm 1.5ml B9 Cho 30µl elution buffer vào cột lọc, ủ nhiệt độ thường phút B11 Ly tâm 13000 rpm phút để thu dung dịch tách chiết H P U H 53 Phụ lục HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN BỘ KÍT LAMP CHẨN ĐỐN SÁN DÂY CHĨ Echinococcus Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước dùng Giới thiệu Bộ Kít dùng để phát Echinococcus kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian (LAMP - Loop Isothermal Median Amplification) Bộ Kít bao gồm thành phần phản ứng LAMP, sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế vùng gen 18S rRNA Echinococcus để phát lồi cách xác với độ nhạy cao DNA sử dụng cho Kít DNA tách chiết từ mẫu mô, mẫu phân, mẫu nước tiểu H P Thành phần quy cách đóng gói Thành phần kít mơ tả bảng Bảng Thành phần kít Số Thành phần TT 01 02 03 04 05 06 (Dung dịch) WT-01 ECH-MM-02 ECH-PM-03 Bst-Taq-04 MG-05 ECH-PC-06 H U Thể tích Số lượng (50 phản ứng) 800 µl 650 µl 130 µl 52 µl 50 µl 102 µl (ống) 01 01 01 01 01 01 Bộ kít LAMP đóng gói 50 phản ứng/1 hộp Hướng dẫn sử dụng 3.1 Chuẩn bị phản ứng LAMP - Làm tan đá ống hóa chất, trộn ly tâm nhanh Giữ tồn ống hóa chất khay đá bào khay lạnh - Lấy số ống mẫu PCR tương ứng với số mẫu cần phân tích cộng thêm mẫu chứng âm, 1mẫu chứng dương ghi ký hiệu mẫu để phân biệt 54 - Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng LAMP theo thứ tự bảng (+)(+)(+)(-) Bảng Thành phần phản ứng LAMP TT Thành phần phản ứng 01 02 03 04 05 WT - 01 ECH-MM - 02 ECH-PM - 03 Bst-Taq - 04 MG - 05 Tổng Thể tích cho phản ứng (µl) 3,9 12,5 2,5 0,1 20 - Thêm 5µL DNA tách chiết từ mẫu, chứng dương (ECH-PC-06), chứng âm H P (WT- 01) vào ống chứa hỗn hợp phản ứng ghi ký hiệu tương ứng 3.2 Điều kiện phản ứng LAMP Phản ứng LAMP thực theo điều kiện nhiệt trình bày bảng Bảng Điều kiện phản ứng Pha Mô tả Số Nhiệt độ Thời gian chu kỳ Hoạt hóa Bst-Taq polymerase khuếch đại 63oC 60 phút DNA Bất hoạt, dừng phản ứng 80oC phút U 3.3 H Phiên giải kết Tiến hành đọc kết sau 10 phút để ống phản ứng ổn định nhiệt độ phòng - Kết ghi nhận khi: + Dung dịch ống chứng dương chuyển từ mầu xanh đậm sang màu xanh sáng + Dung dịch ống chứng âm chuyển từ mầu xanh đậm sang không màu - Đọc kết quả: 55 + Mẫu dương tính: Dung dịch ống thử nghiệm chuyển từ mầu xanh đậm sang màu xanh sáng + Mẫu âm tính: Dung dịch ống thử nghiệm chuyển từ mầu xanh đậm sang khơng màu 3.4 Các tình phát sinh cách xử lý Tình Dung dịch ống chứng dương khơng có màu xanh sáng Ngun nhân Chương trình nhiệt cài đặt sai Điều kiện bảo quản không H P Cách xử lý Kiểm tra, cài đặt lại chương trình nhiệt - Kiểm tra lại điều kiện bảo quản, lưu giữ hạn sử dụng kít - Lặp lại thí nghiệm Có chất ức chế Tinh lại DNA để loại bỏ chất ức chế phản ứng PCR thực lại phản ứng LAMP Dung dịch Tạp nhiễm Thực lại thí nghiệm kiểm tra ống chứng âm mẫu hóa bước để xác định nguồn gốc tạp nhiễm có màu xanh chất sáng U Độ nhạy, độ đặc hiệu H Bộ kít đánh giá 180 mẫu cho kết sau: - Độ nhạy: 93,55% - Độ đặc hiệu: 99,33% - Ngưỡng phát hiện: 2,82x10osố sao/µl Một số lưu ý - Các trình thu thập, vận chuyển, bảo quản mẫu tách chiết DNA phải tuân theo quy trình chuẩn để đảm bảo độ tin cậy kết 56 - Tách chiết lưu giữ mẫu dương tính (mẫu, chứng dương, sản phẩm nhân bản) riêng rẽ với thành phần khác, nên nạp mẫu vào hỗn hợp phản ứng khu riêng biệt - Để tan đá ống hóa chất nhiệt độ phịng trước tiến hành thử nghiệm Các ống hóa chất sau tan đá cần trộn ly tâm nhanh Điều kiện bảo quản - Bộ kít bảo quản, -25oC đến -15oC, tránh ánh sáng - Không làm tan đá đông đá lần - Nếu kít sử dụng liên tục giữ lạnh chất dạng dung dịch nhiệt độ từ 2oC đến 8oC tối đa tháng Hạn dùng H P - 12 tháng kể từ ngày sản xuất dung dịch chưa sử dụng - 06 tháng sau mở nắp dung dịch Tài liệu tham khảo EiKen Chemical Co., Ltd A Guide to LAMP primer designing (Primer Explorer V4) Salant H., Ibrahim A., and Joseph H., The Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method (LAMP) for Echinococcus granulosis coprodetection Am J Trop Med Hyg., 2012;87(5):883-887 U H 57 Phụ lục TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN T Các nội dung, công việc Kết phải đạt T Nội dung 1: Thiết lập năm quy trình chế tạo kít LAMP Thu thập mẫu bảo quản mẫu Có mẫu trứng, mẫu mô ấu trùng, sán trưởng thành cho huyết bệnh nhân, huyết người khoẻ mạnh, huyết người dân cộng đồng giai đoạn Xử lý tách chiết DNA từ Chọn phương pháp tách chiết DNA cho hiệu tách chiết mẫu thu thập cao Thiết kế mồi cho phản ứng Có trình tự mồi lý thuyết đặt tổng hợp mồi cho LAMP thử nghiệm Thử nghiệm khả nhân Có kết PCR nhân đoạn trình tự đích, kết hệ mồi thiết kế, xác giải trình tự đoạn sản phẩm PCR, kết so sánh sản phẩm nhân định tính đặc hiệu hệ mồi cuả trình tự đích với mẫu DNA ký sinh trùng khác Tối ưu hóa điều kiện Có điều kiện nồng độ yếu tố cần phản ứng LAMP khảo sát: nồng độ Mg, thời gian nhiệt độ lai, nồng độ Taq polymerase Khảo sát độ nhạy phản ứng Có ngưỡng phát kỹ thuật LAMP LAMP Tạo dịng trình tự đích làm Trình tự gene đặc trưng tác nhân gây bệnh tạo dòng chứng dương E coli, bảo quản dạng plasmid tinh huyền phù tế bào Nội dung 2: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kít LAMP phạm vi cộng động hẹp Tạo Kít chẩn đốn, xây dựng - Bộ Kít với 50 phản ứng/Kít Kít chứa đủ thành phần dùng hướng dẫn sử dụng, khảo cho tách chiết, LAMP, chứng âm, chứng dương sát tính ổn định, tính lặp lại, - Bảng hướng dẫn sử dụng tương ứng tính tiện dụng, so sánh với - Kết độ ổn định Kít 12 tháng Kít khác thị trường - Kết tính tiện dụng Kít - Kết so sánh Kít đề tài số Kít thương mại hóa độ lặp lại, hiệu phát hiện, tính tiện dụng, giá Thử nghiệm sinh phẩm Có kết độ nhạy độ đặc hiệu sinh phẩm, so sánh mẫu thực địa, tính độ nhạy, với kết xét nghiệm phân, PCR độ đặc hiệu sinh phẩm H P H U Thời gian 1/20216/2021 1/2021 6/2021 1/2021 4/2021 1/2021 5/2021 1/2021 7/2021 1/2021 5/2021 1-3/2021 2/2021 10/2021 4-9/2021 58 Phụ lục MỘT SỐ ẢNH TẠI THỰC ĐỊA VÀ PHỊNG THÍ NGHIỆM H P U H 59 H P Ảnh Học sinh Nguyễn Ngọc Hương Ly 11A1 chuyên Sinh trường PTTH dự thi KHKT U H 60