Nhân giống và tạo mô sẹo cây đậu núi (plukenetia volubilis l ) in vitro

I XMOA Sám RG83ỆS CÔRG NGHỆ CAO VẰ CÔNG NGHỆ SINH HỘC 1# » TBỮỒTSG DẠI HỢC HGVYỄK TẴT THẰSH e r# rf Ị > I KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NI CÂY hơ sẹo Bậu NUI (Plukenetia volubilis L,/ IN VITRO SVTH : NGUYỄN THỊ LIÊN NGẲNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA : 2015 - 2017 GVHD : Th.s Đỗ TỈẾN VINH Th.s MAI THỊ PHĨTƠNG HỐ NI CẤY MƠ SẸO CẤY DẬU NÚI (Plnkenetia volubìlìs L.) IN VITRO Tác giả NGƯYẺN THỊ LIÊN Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bans Kỹ sư ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: Th.s ĐỎ TIẾN VINH Th.s MAI THỊ PHƯƠNG HOA TRƯỜNG ĐH NGUYỄ N TẤT THÀ NH TRUNG TÂM THƠNG TIN-THƯ VIỆN ỊữKrí LVOOXCOO Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 nàm 2017 i TĨM TẨT Đê lài: “Ni mó sẹo Đậu núi (Plukeneíiu volubilis L.) in vitro" thực từ tháng 02/2016 đến 08/2017 phịng Thí nghiệm CNSIÍTV Khoa nông nghiệp công nghệ cao công nghệ sinh học trường Đại học Nguyễn Tất Thảnh, sở rung tâm cơng nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Với mục tiêu xác định thảnh phần mơi trường thích hợp đê nuôi cấy mô sẹo Đậu núi (Plukenetia voỉubp.is L.) in vitro Đe tài có nội dung: - Xác định mơi trường khống thích hợp để tạo mô sẹo Đậu núi (Pt-netia volubilis L.) in vitro - Xác dịnh nồng độ chat điều hòa sinh trưởng dể tạo mỏ sẹo Đàu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro - Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để nhân sinh khối mó sẹo Đậu núi (JPlukenetia volubìlis L.) in vitro - Xác định nồng độ đường, nước dừa để nhân sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro - Xác định giai đoạn tăng sinh thích hợp cho q trình cấy truyền mô sẹo Đàu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro Kết đạt được: Môi trường tốt để tạo mô sẹo Đậu núi WPM với tỷ lệ tạo sẹo cao 37,08 % Môi trường MS bổ sung nồng độ IAA (4 mg/1) thích hợp để tạo mô sẹo Đậu núi, tỷ lệ tạo sẹo cao 40,83 % Môi trường MS bổ sung nồng độ 2,4 - D (0,5 mg/1) hệ số tăng sinh 5,75 lần Nồng độ nước dừa 15% thích hợp để nhân sinh khối mị sẹo Ngày cấy chuyền mô sẹo 25 ngày ii LỜI CÁM ON Trước tiên, tơi xin bày tơ lịng kính trọng biết ơn sáu sắc tới Th.s Đỗ Tiến Vinh, Th.s Mai Thị Phương Hoa tận tình hướng dẫn, tạo điêu kiện thuận lợi cho suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Trường Đạ: 'r >c Nguyễn Tất Thành mang dến kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi ; - lơi suốt q trình học tập nghiên cứu trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp 15DSH.CLT.A ìn bên cạnh u thương giúp dỡ tơi q trình nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thán bạn bè ln động viên, giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp nảy Một lần xin trân trọng cảm ơn ! Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực tỉiẹì Nguyễn Thị Liên iii MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA i TÓM TẮT ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẲT vii DANH SÁCH HÌNH viii DANH SÁCH BẢNG ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Chương 1: TÓNG QUAN Giới thiệu Đậu núi Plukenetia volubilìs L 1.1 Phân loại khoa học 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng 1.1.3 Chức 1.1.4 Giá trị kinh tế 1.2 Các nghiên cứu nước 1.2.1 Các nghiên cứu nước 1.2.2 Các nghiên cứu giới 1.3 Nuôi cấy tế bào thực vật 1.3.1 Khái niệm mô sẹo 1.3.2 Đặc tính mơ sẹo 1.3.3 ứng dụng mô sẹo 1.3.4 Sự tạo mô sẹo 1.3.5 Phương pháp nuôi cấy mô sẹo iv 1.3.5.1 Nguyên tắc nuôi cấy mô sẹo 1.3.5.2 Đặc điểm cúa trinh nuôi mô SCO 11 1.3.5.3 Nhân giống thông qua giai đoạn callus 11 1.4 Ảnh hưởng chất điểu hoà sinh trưởng 11 1.4.1 Nhóm auxin 12 1.4.2 Nhóm cytokinin 12 1.5 Các chất khác 13 1.5.1 Nước dừa 13 1.5.2 Agar 13 Chuông 2: VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 2.2 Vật liệu nghiên cứu 14 2.2.1 Mầu nuôi cấy 14 2.2.2 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm .14 2.2.3 Điều kiện nuôi cấy 14 2.2.4 Môi trường nuôi cấy 15 2.3 Nội dung phương pháp thí nghiệm 15 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thành phần khống đến khả tạo mị sẹo Đậu núi (JPlukenetia volubilìs L.) in vitro 16 23.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng ĐHST đến khả tạo mô sẹo cày Đậu núi (Plukenetia volnbilis L.) in vitro .16 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ auxin đến q trình nhàn sinh khối mơ sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 17 23.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến khả nhàn sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 18 23.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát đường cong sinh tnrởng cùa mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 19 2.4 Phương pháp thu thập sử lý số liệu 20 2.4.1 Phương pháp thu thập 20 V 2.4.2 Phương pháp xử lí số liệu 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THÁO LUẬN .21 3.1 Kết luận 21 3.1.1 hí nghiệm 1: Khào sát ảnh hưởng thành phần khống đến khả lạo mơ sẹo Đậu núi (Plnkenetia volubilis L.) in vitro 21 3.1.2 hí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng ĐHST đến khả tạo mô sẹo cúa Đậu núi (Plnkenetia volnbilis L.) in vitro 22 3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ auxin đến trình nhãn sinh khối mô sẹo Đậu núi (Phike net ia volubilis L.) in vitro 24 3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến nâng nhản sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 26 3.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát đường cong sinh trưởng mò sẹo Đặ_ núi Pỉukenetia vohibilis L.) in vitro 28 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 29 4.1 Kết luận 29 4.2 Đề nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 Tiếng việt 30 Tiếng anh 30 Tài liệu Web .31 PHỤ LỤC 32 vi DANH SÁCH CHỮ VIÉT TẢT Cs : Cộng IBA : 3-indolebutiric axid IAA : 3-indoJe acetic axid NAA : Napthaleneaxetic axid 2,4 - D : Dichlorophenoxyaxetic axid MS : Murashige Skoog, 1962 ĐI 1ST : Điều hịa sinh trưởng vii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1: Cây Đậu núi Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15 Hình 3.1: Sự tạo sẹo từ Đậu núi mơi trường khống 22 Hình 3.2: Sự tạo sẹo từ Đậu núi mơi trường có bơ sung IAA ĨBA 24 Hình 3.3: Mơ sẹo Đậu núi mơi trường MS có bổ sung 2,4 - D NAA 26 Hình 3.4: Mơ sẹo Đậu núi mơi trường MS có bổ sung đường, nươc dưa 27 Hình 3.5: Đường cong sinh trưởng Đậu núi 28 viii DANH SÁCH BÁNG Trang Bảng 2.1: Khảo sát ảnh hường thành phần khống đến náng tạo mó sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 16 Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng cùa loại ĐHST đến khả tạo mó sẹo Đậu núi (JPlukenetia volubilis L.) in vitro 17 Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2,4 - D, NAA đến trình nhãn sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volnbilis L.) in vitro 18 Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường, nước dừa nhân sinh khối mó sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 19 Bảng 2.5: Khảo sát đường cong sinh trường mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volnbilis L.) in vitro 20 Bảng 3.1: Kết khảo sát mơi trường khống thích hợp để tạo mơ sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 21 Bảng 3.2: Két xác định nồng độ chất điều hịa sinh trưởng để tạo mơ sẹo Đậu núi (JPlukenetia volubilis L.) in vitro 23 Bảng 3.3: Kết xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để nhân sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro 25 Bảng 3.4: Kết xác định nồng độ cùa đường, nước dừa nhân sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volubỉlis L.) in vitro 27 ix mg/l) có tỷ lẹ máu lạo sẹo (40,83 %) sẹo có máu trắng kích thước khối lượne mô sẹo tạo lớn nghiệm thức cịn lại Sau thực thí nghiệm việc bố sung chất điêu hoa >inh trưởng giúp cho việc tạo sẹo đạt tỷ lệ cao IAA chất tác động tốt đến việc tạo sẹo Hình 3.2: Sự tạo sẹo từ Đậu núi môi trường MS có bổ sung IAA, IBA A: Mầu ban đầu B: Sau tuần C: IBA (4 mg/1) D: IAA (4 mg/1) 3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ auxin đến trình nhân sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro Mơ sẹo thu thí nghiệm dùng làm nguyên liệu cho nuôi cấy khảo sát tăng sinh mơ sẹo thí nghiệm Trong thí nghiệm việc bổ sung nồng độ khác nhằm tìm nồng độ tối ưu để trì tăng sinh khối mỏ sẹo để làm nguyên liệu cho thí nghiệm Khối mơ sẹo có tăng lèn rõ rệt chứng tô nồng độ phù hợp để nhân sinh khối mơ sẹo Mầu mơ sẹo có khối lượng Ig nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4 - D NAA Nghiệm thức 3.1 đến 3.13 (Bàng 3.3) tương ứng với 2,4 - D (0 đến mg/1) có hệ sỗ tăng sinh khác tùy theo nồng độ Trong đó, nghiệm thức 3.2 nồng độ 2,4 - D (0,5 mg/1) cho kết quà tăng sinh cao 5,75 lần, nghiệm thức 3.1 có hệ sổ tăng sinh 2.4 - D thấp 1,85 lần Trong 24 dộ Trong dó, nghiệm (hức 3.2 nồng dộ 2,4.1) (0,5 mg/l) cho két quà tàng sinh cao nhât 5,75 lãn, nghiệm thức 3.1 có hộ số tăng sinh 2,4 - D thắp 1,85 lần Trong giai đoạn náy té bao mơ sẹo dược bồ sung chát kích thích de giúp cho trinh phân chia biệt hóa tế bào Tương ứng với NAA (0 dến mg/1) có hệ số tăng sinh khác tùy theo nồng độ Trong đó, nghiệm thức 3.13 có hệ số tăng sinh NAA (4,0 mg 1) cho kết quà táng sinh cao 4,48 lần, nghiệm thức 3.10 có hệ số táng sính NAA (1,5 mg/l) thấp với hệ số tăng sinh 1,18 lần Từ bảng kết cho thấy nỏng độ 2.4 - D (0,5 mg/1) thích hợp để nhân sinh khối mô sẹo Bảng 3.3: Kết xác định nồng độ chất điều hòa sinh trường đẻ nhản sinh khối mô sẹo Đậu núi (Plukenetia vohibilis L.) in vitro Nghiệm 2,4 - D NAA thức (mg/l) (mg/I) (lằn) 3.1 (ĐC) 0,0 - l,85b 3.2 0,5 - 5.75a 3.3 1,0 - 2,96ab 3.4 1,5 - 3,15ab 3.5 2,0 - 3,00ab 3.6 3,0 - 4,3 7ab 3.7 4,0 - 2,63b 3.8 - 0,5 3,2 lab 3.9 - 1,0 3,66ab 3.10 - 1,5 l,18b 3.11 - 2,0 3,42ab 3.12 - 3,0 3,14ab 4,0 4.48“ 3.13 Hệ sô tăng sinh 5.48 % cv (%) Các giá trị theo san giá trị trung bình mội CỘI thè khác biệt nghiệm thức có ý nghĩa p F F Value Source 2059.911467 1029.955733 17.19 359.395333 59 899222 2419.306800 Coeff Var Root MSE N Mean 5.02529 7.739459 15.78667 Anova ss Mean Square F Value 2059.911467 1029.955733 17.19 8.9033 Pr > F 0.0033 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N 0.01 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square 59.89922 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 23.428 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B B Mean 37.080 6.947 3.333 N 3 T W1 W2 W3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưỏng ĐHST đến khả tạo mô sẹo Đậu núi (ỊPlukenetìa voỉubìlìs L.) in vitro Class y The ANOVA Procedure Class Level Information Levels Values W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 Number of Observations Read Number of Observations used The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Sum of 32 36 36 Source Model DF Error Corrected Total R-Square 0.338422 DF Source T1 Squares 3430.33650 F Value 1*51 Mean Square 423.79206 27 7691.86678 234.38395 35 11122.20327 Coeff Var Root MSE H Mean 5.24084 16.87851 21.57250 Anova ss Mean Square F Value 3430.336500 428.792862 1,51 Pr > F 0.2018 Pr > F 0.2018 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.05 27 284.884 2.05183 24.488 Means with the same letter are not significantly dif-e-£ t t Grouping A B A B A B A B A B A B B B Mean 40.83 30.83 27.50 24.17 19 17 16.67 15.83 11.67 7.50 N 4 4 4 4 T W5 W9 W7 W8 W4 W1 W3 W2 W6 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ auxin đến trình nhân sinh khối mơ sẹo Đậu núi (Plukenetìa volubìUs L.) in vitro HE SO TANG SINH 2,4-D Class T The ANOVA Class Level Levels Procedure Information Values W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 Number of Observations Read Number of Observations Used 35 35 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N DF Source Model Error Corrected Total R-Square 0.263167 Source T Sum of Mean Square F Value Squares 8.2182390 1.67 49.3094343 4.9307114 28 138.1 8599200 34 187 3693543 Root MSE N Mean Coeff Var 2.220521 3.391143 5.48001 Anova ss 49.30943429 DF Mean Square 8.21823905 F Value 1.67 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N 0.05 Alpha 33 Pr > F 1663 Pr > F 1663 Error Degrees of Freedom 23 Error Mean Square 4.933711 Critical Value of t 2.34341 Least Significant Difference 2.3767 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A B A B A B A B B Mean 5.750 4.378 3.156 3.006 2.962 2.630 1.856 N 5 5 5 T W2 W6 W4 W5 W3 W7 W1 HE SO TANG SINH NAA HE SO TANG SINH The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T W1 W2 W3 W4 W5 W6 Number of Observations Read 3(? Number of Observations Used 3Ễ Dependent Variable: N Source Model Error Corrected Total DF 24 29 R-Square 0.205758 Source T Sum of Squares 29.8343767 115.1633200 144.9976967 Mean Square 5.9668753 4.7984717 F Value 1.24 Coeff Var Root MSE N Mean 6.74803 2.190541 3.186333 DF Anova ss Mean Square F Value 29.83437667 5.96687533 1.24 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Pr > F 3201 Pr > F 3201 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 4.798472 Critical Value of t 2.06390 Least Significant Difference 2.8594 Mean 4.482 662 3.428 3.212 148 1.186 t Grouping A B A B A B A BA B N 5 5 5 T W6 W2 W4 W1 W5 W3 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu co đến khả nhân sinh khối mô sẹo Đậu núi in vitro NUOC DUA Class The ANOVA Procedure Class Level Information Levels Values X 34 W1 N2 W3 W4 W5 Number of Observations Read Number of Observations Used The ANOVA Procedure 25 25 Dependent Variable: fl Source Model DF Error Corrected Total 20 24 R-Square 0.261076 Source T Squares 54.4786560 DF Sum of Mean Square 13.6196644 7.7095444 154.1908000 208.6694560 Coeff Var 5.89920 Anova ss 54.47865600 Pr > F 0.1752 Ĩ Value 1.77 Root MSE 2.776606 N Ream 3.232430 Mean Square 13.61966400 F Value 1.77 Pr > F «1752 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square 7.70954 Critical Value of t 2.08596 Least Significant Difference 3.6631 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B A B A B A B Mean 5.336 4.396 3.158 1.720 1.552 N 5 5 T W3 W4 W5 W1 W2 DUONG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T W1 W2 W3 W4 W5 Number of Observations Read 25 Number of Observations Used 25 Source Model Error Corrected Total Source T The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Sum of DF Squares Mean Square F Value 11.8178960 2.9544740 0.34 20 175.4155600 8.7707780 24 187 2334560 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.063119 5.14256 2.961550 3.017600 DF Anova ss Mean Square F Value 11.81789600 2.95447400 0.34 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 3.9071 35 Pr > F 0.8499 Pr > F 0.8499 t Grouping A A A A A Mean 3.730 3.688 3.224 2.448 1.998 H T c M K3 W2 45 '41 5 Thí nghiệm 5: Khảo sát đường cong sinh trưởng mó sẹo Đậu núi in vitro ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T W1 W2 W3 W4 W5 Number of Observations Read Number of Observations Used The ANOVA Procedure DF Source Model Error Corrected Total Anova ss DF T 25 25 Dependent Variable: N Sum of Squares Mean Square F Value 8.71913600 2.17978400 7.58 20 5.75404000 0.28770208 24 14.47317600 R-Square 0.602434 Mean Square Coeff Var Root MSE 6.43095 0.536379 F Value Pr > F 8.71913600 2.17978400 N Mean 3.993688 7.58 Pr > F 8.0007 Source 0.0007 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square 0.287702 Critical Value of t 2.08596 Least Significant Difference 0.7076 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A A B Mean 4.5100 4.3900 4.1580 4.0520 8580 36 N 5 S 5 T W5 W4 W3 W2 W1 Phụ lục 2: Thành phán môi trường nuôi cấy * Stock đa lượng MS : SKOOG I (x 10) (Pha thành 1L với nồng độ sử dụng pha IL môi trướng MS lOOml/L) Thà phần Khối lượng NH4NO3 : 16500 mg KNO3 : 19000 mg KH2PO4 : 1700 mg MgSO4.7H2O : 3700 mg CaCl2.2H2O : 4400 mg Cân dùng nước cất hoà tan chất bécher cho tan hoàn loàn DÙI ống dong 1L điều chỉnh cho dủ lít * Khống đa lượng WPM (g/1) NH4NO3: 0,4g Ca(NO3)2.4H2O : 0,556g KH2PO4: 0,17g CaCl2: 0,0725g MgSO4.7H2O : 0,37g K2SO4 : 0,99g * Khoáng đa lượng KnudsonC (Morel,G.M.,1965) NH4NO3: 500mg/l NH4(SO4)2: 500mg/l Ca(NO3)2:241,3mg/l KC1 : 250 mg/1 KH2PO4: 250 mg/1 MgSO4: 122,15mg/l 37 * Khoáng đa lượng LV NH4NO3 : 16500 mg KNO3 : 19000 mg KH2PO4 : 34000 mg MgSO4.7H2O : 18500 mg CaCl2.2H2O : 22000 mg MgO Inositon : 1000 mg 38