Tách Và Xác Định Cấu Trúc Một Số Hợp Chất Từ Lá Và Cảnh Nhỏ Cây Xoan (Melia Azedarach Linnn) Ở Vườn Quốc Gia Bến En Tỉnh Thanh Hóa

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn khơng trùng lặp với khóa luận, luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu cơng bố Người cam đoan Nguyễn Thị Hương Lý i LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Xuân Lương, TS Nguyễn Thị Ngọc Vinh người trực tiếp hướng dẫn tôi, tạo điều kiện giúp đỡ để tơi hồn thành đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô thuộc Bộ mơn Hóa họcTrường Đại học Hồng Đức, Phịng Hóa Sinh Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian làm thí nghiệm hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè tơi - người ln động viên, khích lệ tơi sống học tập để tơi hồn thành tốt đề tài nghiên cứu này./ Thanh Hóa, ngày 25 tháng năm 2021 Tác giả Nguyễn Thị Hương Lý ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU i Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng, phạm vi nghiên cứu Nhiệm vụ, nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Chương TỔNG QUAN Chi Xoan 1.1 Đặc điểm thực vật Chi Xoan 1.2 Thành phần hóa học Chi Xoan 1.3 Sử dụng hoạt tính sinh học thực vật họ Xoan 19 1.4 Cây Xoan 19 1.4.1 Đặc điểm thực vật Xoan 19 1.4.2 Thành phần hóa học Xoan 21 1.4.3 Sử dụng hoạt tính sinh học Xoan 25 Chương THỰC NGHIỆM 26 2.1 Nguyên liệu, phương pháp thiết bị 26 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu 26 2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất 26 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất 26 2.2 Phân lập hợp chất 28 2.3 Sắc ký cột nhồi cao Etylaxetat 32 2.4 Một số kiện phổ tử ngoại, phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân chất phân lập 35 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Biện giải để xác định cấu trúc hợp chất HL1 36 3.2 Biện giải để xác định cấu trúc hợp chất HL2 40 iii 3.3 Biện giải để xác định cấu trúc hợp chất HL3 44 3.4 Biện giải để xác định cấu trúc hợp chất HL4 ……………………….50 KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 iv DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cảnh Bến En Hình Cây xoan (Melia azedarach Linn) Vườn Quốc Gia Bến En 20 Sơ đồ 2.1: Ngâm chiết cành nhỏ chiết với dung mơi Xoan 29 Hình 2.1 Sắc ký mỏng 31 Sơ đồ 2.2: Phân lập hợp chất từ cao n-hexan Xoan 32 Sơ đồ 2.3: Phân lập hợp chất từ dịch chiết etyl axetat cành nhỏ Xoan 33 Hình 2.2 Cột nhồi khơ silicagel chạy sắc ký cao Etylaxetat từ xoan 34 Hình 2.3 Các phân đoạn chạy sắc ký cột ( Cao etylaxetat) 34 Hình 3.1: Phổ khối lượng va chạm (EI-MS) hợp chất HL1 36 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR hợp chất HL1 38 Hình 3.3: Phổ 13C-NMR hợp chất HL1 39 Hình 3.4: Phổ 13C-NMR hợp chất HL1 (phổ giãn) 39 Hình 3.5: Phổ DEPT hợp chất HL1 (phổ giãn) 40 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR hợp chất HL2 42 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR hợp chất HL2 (phổ giãn) 42 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR hợp chất HL2 (phổ giãn) 43 Hình 3.9: Phổ 13C-NMR hợp chất HL2 43 Hình 3.10: Phổ DEPT hợp chất HL2 (phổ giãn) 44 Hình 3.11: Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS) hợp chất HL3 45 Hình 3.12: Phổ 1H-NMR hợp chất HL3 46 Hình 3.13: Phổ 13C-NMR hợp chất HL3 48 Hình 3.14: Phổ 13C-NMR hợp chất HL (phổ giãn) 48 Hình 3.15: Phổ 13C-NMR hợp chất HL3 (phổ giãn) 49 Hình 3.16: Phổ DEPT hợp chất HL3 49 Hình 3.17: Phổ DEPT hợp chất HL3 (phổ giãn) 50 Hình 3.18: Phổ 1H - NMR hợp chất HL4 51 Hình 3.19: Phổ 1H-NMR hợp chất HL4 (phổ giãn) 52 v Hình 3.20: Phổ 1H-NMR hợp chất HL4 (phổ giãn) 52 Hình 3.21: Phổ 13C-NMR hợp chất HL4 54 Hình 3.22: Phổ 13C-NMR hợp chất HL4 (phổ giãn) 54 Hình 3.23: Phổ DEPT hợp chất HL4 54 Hình 3.24: Phổ COSY hợp chất HL4 55 Hình 3.25: Phổ HSQC hợp chất HL4 56 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất HL1 37 Bảng 3.2.: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất HL2 40 Bảng 3.3: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất HL3 47 Bảng 3.4: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất HL4 53 vii MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nước ta có khí hậu nhiệt đới, gió mùa ẩm, cận xích đạo, độ ẩm cao, Những đặc thù môi trường tạo cho nước ta hệ thực vật phong phú đa dạng Theo số liệu thống kê gần hệ thực vật Việt Nam có 10.000 lồi [1], có khoảng 3.200 lồi sử dụng y học dân tộc 600 loài cho tinh dầu [2] Đây nguồn tài nguyên thiên nhiên quý báu đất nước Hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có ưu điểm thân thiện lại an tồn, nên q trình thực nghiệm tách chiết, xác định cấu trúc thử hoạt tính chất từ cỏ thiên nhiên, sinh vật biển với mong muốn tiềm hợp chất phục vụ cho đời sống người nhiểu lĩnh vực như: y học, dược liệu, công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm, v.v Tỉnh Thanh Hố có vườn Quốc gia Bến En, thuộc địa phận nằm địa bàn huyện Như Thanh Như Xuân, cách trung tâm huyện km phía tây Tổng diện tích tự nhiên 14.634ha, gồm 16 tiểu khu sinh thái vùng hồ sông Mực chứa 40 triệu m3 nước, vào mùa lũ nơi sâu hồ tới 40m hồ lớn xứ Thanh Vườn có đất tốt độ ẩm phù hợpnên sinh thái vườn đa dạng, phong phú, với 1.389 loài thực vật, điều kiện địa hình, đất đai, hệ thực vật tạo thành số kiểu sau: rừng kín, thường xanh, nhiệt đới ẩm, đất đá vôi thấp bị tác động người với diện tích 338 Hình 1.1 Cảnh Bến En Phân bố thành hai khu vực: Khu sông Chàng thuộc dãy Bù Đăng, Đá Trai khu trung tâm thượng nguồn sông Mực rừng chủ yếu Lim xanh, Gội, Mỡ, Sồi… cịn có nhiều lồi khác săng lẻ, lát hoa, trai lý, bù hương, vàng tâm, chò chỉ… Trong nhiều lồi thực vật đó, họ Xoan (Meliaceae) họ lớn có khoảng 50 chi, 1400 lồi phân bố khắp miền nhiệt đới, Việt Nam có 20 chi 650 loài [3] Cây Xoan (Melia azedarach Linn.) lồi thuộc họ Xoan (Meliaceae) Các hoạt chất có giá trị sinh học Xoan hợp chất có vỏ, thân, kinh nghiệm dân gian người Ấn Độ từ xưa dùng xoan làm thuốc hạ đường huyết, làm mặt nạ mỹ phẩm, người Malaysia dùng cao vỏ xoan chữa bỏng da, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chữa sốt rét [4] Người Mỹ thời tách hợp chất từ vỏ, để diệt côn trủng hại ngủ cốc, chống oxi hóa tế bào, chữa tiểu đường, chống HIV/AIDS, chống ung thư tác nhân gây đột biến gen, bảo vệ tim mạch, tăng cường khả miễn dịch thể Hiện nhà khoa học tích cực khai thác, chiết tách, tổng hợp sử dụng có hiệu hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Vì chúng tơi chọn đề tài “Tách xác định cấu trúc số hợp chất từ cành nhỏ Xoan (Melia azedarach Linn) vườn Quốc gia Bến En tỉnh Thanh Hóa” nội dung luận văn Mục tiêu nghiên cứu: Tách xác định cấu trúc hợp chất từ cành nhỏ xoan (Melia azedarach Linn.) vườn Quốc gia Bến En, tỉnh Thanh Hóa Đối tượng, phạm vi nghiên cứu Lá cành nhỏ xoan (Melia azedarach Linn.) vườn Quốc gia Bến En, tỉnh Thanh Hóa Nhiệm vụ, nội dung nghiên cứu Trong luận văn này, có nhiệm vụ : - Lấy mẫu cành nhỏ xoan - Ngâm với dung môi methanol chiết với dung môi khác - Phân lập hợp chất phương pháp sắc ký cột (CC) sắc ký lớp mỏng (TLC) - Xác định cấu trúc hợp chất phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H – NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC) Phương pháp nghiên cứu -Phương pháp lấy mẫu - Phương pháp cất nước - Phương pháp GC/MS - Phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập chất - Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất Hình 3.13: Phổ 13C-NMR hợp chất HL3 Hình 3.14: Phổ 13C-NMR hợp chất HL (phổ giãn) 48 Hình 3.15: Phổ 13C-NMR hợp chất HL3 (phổ giãn) Hình 3.16: Phổ DEPT hợp chất HL3 49 Hình 3.17: Phổ DEPT hợp chất HL3 (phổ giãn) Các số liệu phổ thu so với số liệu phổ tài liệu [30] khẳng định hợp chất HL3 -sitosterol-3-O--D-glucopyranosit Hợp chất tồn phổ biến thực vật [24,25] HO H H HO O OH HO H O H H (HL3) -sitosterol 3-O--D-glucopyranosit 3.4 Biện giải để xác định cấu trúc hợp chất HL4 Cấu trúc hợp chất HL4 xác định phương pháp phổ : phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR, 13C – NMR phổ DEPT Phổ 1H – NMR cho thấy tín hiệu đặc trưng 3,34 (3H, s, OCH3) gán cho tín hiệu proton nhóm metoxy, tín hiệu 5,27 (1H, d, 50 J=3 Hz, H – 7) tín hiệu proton liên kết đơi thuộc olephin, ngồi tín hiệu 4,78 (1H, d, J=3,5 Hz, H–21 ) proton vịng furan có ngun tử cacbon có liên kết với nhóm metoxy, tín hiệu 4,23 (1H, br dt, J=5,0, 9,0 Hz, H – 23) proton vòng furan, tin hiệu 3,24 (2H, m, H – 3, 24) gán cho H –3 H–24 gắn với nguyên tử cacbon có chứa nhóm hydroxyl Bên cạnh đó, cịn xuất tín hiệu proton nhóm metyl 0,78 (3H, s, H – 19), 0,86 (3H, s, H-18, 29), 0,97 (3H, s, J=4,5 Hz, H – 28, 30), 1,27 (3H, s, H – 26), 1,32 (3H, s, H – 27) Hình 3.18: Phổ 1H - NMR hợp chất HL4 51 Hình 3.19: Phổ 1H-NMR hợp chất HL4 (phổ giãn) Hình 3.20: Phổ 1H-NMR hợp chất HL4 (phổ giãn) Phổ 13C – NMR cho thấy có tín hiệu 31 ngun tử cacbon gồm: nhóm metyl, nhóm metylen, nhóm metin, nhóm metoxy nguyên từ cacbon bậc bốn Tín hiệu 79,24 ppm (C-3) tương tác với tín hiệu 3,24 ppm (H-3) cho thấy nhóm hydroxyl định hướng , Cịn tín hiệu 109,1 ppm (C-21) tương tác với tín hiệu 4,78 ppm (H-21) cho thấy nhóm metoxy định hướng  Ngàoi ra, thấy tin hiệu nguyên tử cacbon thuộc 52 olephin 118,2 ppm (C-7) 145,4 ppm (C-8) Các tín hiệu (ppm) nhóm metyl xuất 22,6, 13,1, 26,4, 26,5, 27,6, 14,7 27,1 tín hiệu nguyên tử cacbon C-18, 19, 26, 27, 28, 29, 30 Tín hiệu cacbon nhóm metoxy 55,6 ppm Bảng 3.4: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất HL4 C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 C (ppm) 37,2 27,7 79,2 39,0 50,7 24,0 118,2 145,4 48,8 35,1 17,7 31,7 43,7 51,0 34,4 27,4 50,3 22,6 13,1 47,8 109,1 33,8 76,8 75,6 73,1 26,4 26,5 27,6 14,7 27,1 55,6 DEPT CH2 CH2 CH C CH CH2 CH C CH C CH2 CH2 C C CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH CH CH2 CH CH C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OCH3 53 *C (ppm)1 37,2 27,7 79,2 38,9 50,7 23,9 118,2 145,4 48,8 35,0 17,6 31,7 43,7 50,9 34,4 27,4 50,3 22,6 13,1 47,8 109,0 33,8 76,7 75,4 73,1 26,4 26,4 27,6 14,7 27,1 55,6 Hình 3.21: Phổ 13C-NMR hợp chất HL4 Hình 3.22: Phổ 13C-NMR hợp chất HL4 (phổ giãn) Hình 3.23: Phổ DEPT hợp chất HL4 54 Hình 3.24: Phổ COSY hợp chất HL4 55 Hình 3.25: Phổ HSQC hợp chất HL4 Từ số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY thu so sanh với tài liệu [26, 27], cấu trúc Hợp chất HL4 hoàn tàn phù hợp với câu trúc Meliasenin S Hợp chất Hu phân lập 56 xác định vào năm 2011 từ loài Melia toosendan triterpenoid lần đầu tách từ Xoan vườn Quốc gia Bến En Thanh Hóa HO H 3C 21 O 18 CH 12 11 19 CH 22 17 16 15 CH 30 H 3C 29 CH 28 Hợp chất (HL4) : Meliasenin S 57 CH 24 23 20 13 14 10 HO O 26 25 OH CH 27 KẾT LUẬN Luận văn “Tách xác định cấu trúc số hợp chất từ cành nhỏ Xoan (Melia azedarach Linn) vườn Quốc gia Bến En tỉnh Thanh Hóa” thực nhiệm vụ nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ vỏ, cành nhỏ Xoan đạt kết sau: Đã xây dựng quy trình chiết phân tách để điều chế cao n- hexan, etyt axetat, butanol phần chiết nước chứa hợp chất phân cực từ lá, vỏ cành nhỏ Xoan Từ dịch chiết Metanol vỏ cành nhỏ, Cây Xoan thu hái vườn Quốc gia Bến En Thanh Hóa sau chiết với nhexan, etylaxetat, cloroform n-butanol thu dịch chiết tương ứng Dùng sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột thu 04 hợp chất tinh khiết Phối hợp phương pháp phổ đại xác định cấu trúc 04 hợp chất cụ thể : Meliasenin S ; -sitosterol 3-O--D-glucopyranosit; stigmasterol -sitosterol 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TIẾNG VIỆT [1] Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, tr.161 – 168 [2] Phạm Hồng Hộ (2006), Cây có vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Trẻ, TP HCM, tr.338 – 349 [3] Nguyễn Bá, Nguyễn Đình Hưng (2001), Đặc điểm cấu tạo số đại diện họ Xoan - Meliaceae Việt Nam Tạp chí Sinh học 23 (3a), tr 311 [4] Lê Kim Phụng (2009), Những công dụng từ xoan Tạp chí điểm tin y học TP HCM [5] Trần Kim Quy cộng (2009), Tác dụng duyệt côn trùng hại ngủ cốc – bảo vệ mơi trường từ cao Xoan Viện nghiên cứu hóa – sinh ứng dụng TP HCM [6] Đỗ Tất Lợi (1963), Dược liệu vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học Phạm Hoàng Hộ (1992) Cây cỏ Việt Nam Montreal [7] Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1985) Các phương pháp sắc ký Nhà xuất Khoa học kỹ thuật [8] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc, Nhà xuất Giáo dục [9] Đỗ Tất Lợi, Đặng Văn Trường (1970), Xây dựng dạng thuốc từ xoan, Luận văn dược Đại học dược, Hà Nội B TIẾNG ANH [10] Benosman, Stephen H.; Nelson, John B., (1991) [revised 1994] Disturbance and status of Carolina bays in South Carolina Columbia, SC: South Carolina Wildlife and Marine Resources Department, Division of Wildlife and Freshwater Fisheries, Nongame and Heritage Trust Section p.38-79 of 88 p [71053] 59 [11] Nguyen Van Duong (1993), Medicinal Plants of Vietnam, Cambodia and Laos Santa Monica, CA: Mekong Printing, tr 254 [12] Zomlefer, Wendy B., (1994) Guide to flowering plant families Chapel Hill, NC: The University of Carolina Press 430p [72836] [13 ] Bussan, Alvin J.; Dyer, William E., (1999) Herbicides and rangeland In: Sheley, Roger L.; Petroff, Janet K., eds Biology and management of noxious rangeland weeds Corvallis, OR: Oregon State University Press: 116-132 [35716] [14] Varner, J Morgan, III; Kush, John S.; Meldahl, Ralph S., (2000) Ecological restoration of an old-growth longleaf pine stand utilizing prescribed fire In: Moser, W Keith; Moser, Cynthia F., eds Fire and forest ecology: innovative silviculture and vegetation management: Proceedings of the 21st Tall Timbers fire ecology conference: an international symposium; 1998 April 14-16; Tallahassee, FL No 21 Tallahassee, FL: Tall Timbers Research, Inc: 216-219 [37671] [15] NatureServe., (2009) Comprehensive report : Melia azedarach Chinaberry, In: NatureServe Explorer: An online encyclopedia of life Version 7.1 Arlington, VA: NatureServe (Producer) [76819] [16] Vines, Robert A., (1960) Trees, shrubs, and woody vines of the Southwest Austin, TX: University of Texas Press 1104 p [7707] [17 ] Mabberley, D J., (1984) A monograph of Melia in Asia and the Pacific: The history of white cedar and persian lilac Gardens' Bulletin Singapore 37: 49-64 [75909] [18 ] Bussan, Alvin J.; Dyer, William E., (1999) Herbicides and rangeland In: Sheley, Roger L.; Petroff, Janet K., eds Biology and management of noxious rangeland weeds Corvallis, OR: Oregon State University Press: 116-132 [35716] [19] Ali, S I.; Qaiser, M.; [and others]., (2009) Flora of Pakistan, [Online] Islamabad: Pakistan Agricultural Research Council; 60 Karachi, Pakistan: University of Karachi; St Louis, MO: Missouri Botanical Garden In: eFloras St Louis, MO: Missouri Botanical Garden; Cambridge, MA: Harvard University Herbaria [20] Kartesz, John T 1999 A synonymized checklist and atlas with biological attributes for the vascular flora of the United States, Canada, and Greenland 1st ed In: Kartesz, John T.; Meacham, Christopher A Synthesis of the North American flora (Windows Version 1.0), [CD-ROM] Chapel Hill, NC: North Carolina Botanical Garden (Producer) In cooperation with: The Nature Conservancy; U.S Department of Agriculture, Natural Resources Conservation Service; U.S Department of the Interior, Fish and Wildlife Service [36715] [21] Bisht, R P.; Toky, O P., (1993) Growth pattern and architectural analysis of nine important multipurpose trees in an arid region of India Canadian Journal of Forest Research 23(4): 722-730 [75547] [22] U.S Department of Agriculture, Natural Resources Conservation Service., (2009) PLANTS Database, [Online] Available: http://plants.usda.gov/ [34262] [23] 19.Dictionary of Natural product on CD-Rom, Chapman and Hall-CRC (2005) [24] Kuo H Y., Yeh M H (1997), Chemical constituents of heartwood of Bauhinia purpurea, J Chin Chem Soc., 44, pp 379-383 [25] Lin Y., Kuo Y., Shiao M., Chen C., and Ou J., (2000), Flavonoid glycosides from Terminalia catappa L., J Chin Chem Soc., 47(1) pp [26] 1Hu J F., Fan H., Wang L J., Wu S B., Zhao Y., (2011) Limonoids from the fruits of Melia toosendan Phytochemistry Letters 4, p.292297 61 [27] Batcher, Michael S.,(2004) Element stewardship abstract: Melia azedarach - Chinaberry, umbrella tree, [Online] In: Mangement library: Control methods - plants In: Global Invasive Species Team (GIST) Arlington 62