Tách ARN: Sử dụng các kỹ thuật mới cho việc tách chiết RNA

Tách ARN (RNA isolation) quy trình phức tạp, người có phương pháp, thủ thuật riêng để tách ARN nguyên vẹn từ mẫu họ Mặc dù mức độ đó, thành công trình tách ARN khó dự đoán, nhiên có vài vấn đề thường xuyên xảy giải hợp lý Trong trình tách ARN từ mẫu mô tế bào, có bốn vấn đề sau: Vấn đề 1: ARN nhiễm ADN tổng số (genomic DNA) Nhận biết: Trong trường hợp này, ảnh điện di xuất vệt smear khối lượng phân tử cao mẫu đối chứng– RT (bao gồm toàn thành phần cần cho phản ứng RT-PCR, ngoại trừ enzyme reverse transcriptase) lên băng sau tiến hành PCR Nguyên nhân: Bất quy trình phân tách ARN xuất vết ADN Điều xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi TRIzol (phenol) màng lọc xoay silica Nguyên nhân đứt gãy không hoàn toàn ADN tổng số trình nghiền đồng thể (homogenization) Trong phương pháp sử dụng phenol, pH phenol yếu tố then chốt (cần pH acid) kỹ thao tác với pipet pha nước định mức độ nhiễm ADN Giải pháp: ADN tổng số cần làm đồng hoàn toàn nhờ sử dụng phương pháp phá vỡ cấu trúc ADN máy đập hạt vận tốc cao (high velocity bead beater) polytron rotor stator Mẫu làm nóng suốt trình nghiền đồng thể làm lạnh mẫu guanidine khiến muối kết tủa Do đó, cần cân thời gian nghiền đồng thể với thời gian làm lạnh mẫu tới nhiệt độ phòng Sử dụng DNase cách tốt để loại bỏ ADN tổng số (Hình minh họa) Bộ kit RTS DNase™ chứa enzyme DNase có hoạt độ cao, bền nhiệt độ phòng loại bỏ ADN hiệu Sau bước loại ADN, resin dùng để loại bỏ enzyme DNase mà không cần dùng nhiệt độ hay EDTA Kit khuyến khích sử dụng cho mẫu giàu ADN tổng số (ví dụ mô lách), mẫu tinh trước bước xử lý với DNase Các phương pháp “on-column” (trong cột) sử dụng với mẫu nhiễm ADN tổng số Ảnh điện di: Sử dụng DNase loại bỏ ADN tổng số khỏi mẫu ARN (Nguồn ảnh: https://mobio.com/dnasetm-max-kit-1076.html) Vấn đề 2: ARN phân hủy/ ARN không nguyên vẹn Nhận biết: Các băng rARN xuất vệt smear gel băng 18S đậm nhiều so với băng 28S Ảnh điện di: ARN bị phân hủy ARN nguyên vẹn (M Marker, ARN bị phân hủy ARN nguyên vẹn lên băng 18S 28S) (Nguồn ảnh: https://www.thermofisher.com) Nguyên nhân: Sự phân hủy ARN diễn vài thời điểm suốt quy trình nên khó để xác định xác tượng xảy giai đoạn thu mẫu (collection), bảo quản (storage), tách chiết (extraction) hay phân tách (isolation) Giải pháp: Nếu vấn đề xuất trình bảo quản, đảm bảo mẫu sau thu giữ nitơ lỏng -80 oC; mẫu mô động vật, sử dụng RNALater giữ -20oC Nếu vấn đề xuất trình tách chiết, thêm beta-mercaptoethanol (BME) vào đệm ly giải (lysis buffer) Sử dụng 10 ul BME 14.3 M/ 1ml đệm BME bất hoạt RNases giúp giữ ổn định mẫu suốt trình tách chiết Nếu mẫu lấy từ tủ đông không nằm dung dịch bảo quản, không rã đông Nhanh chóng làm đồng mẫu BME Chú ý ly giải mẫu hoàn toàn Sự phân hủy RNase xảy sau phân tách cần đảm bảo nước sử dụng cho trình rửa giải (elution) tái hòa tan (resuspension) không nhiễm RNase Vấn đề 3: Chất ức chế ARN Nhận biết: Tỷ số 260/230 thấp (dưới 1.0) tỷ số 260/280 thấp Nguyên nhân: Tỷ số 260/230 thấp cho thấy hỗn hợp chứa muối guanidine chất ức chế hữu acid humic, polysaccharides Các muối guanidine bất hoạt RNase ức chế protein enzyme RT Tỷ lệ 260/280 thấp chứng tỏ ARN nhiễm protein Giải pháp: Trường hợp tỷ số 260/230 thấp, cách tốt rửa mẫu thêm nhiều lần Nếu TRIzol kết tủa, rửa với ethanol để khử muối Trường hợp sử dụng cột silica, rửa thêm vài lần ethanol 70-80% để loại bỏ muối Với mẫu tinh chưa hoàn toàn, dùng ethanol Đối với chất ức chế khác acid humic polysaccharides, cần tinh lại mẫu cột khác rửa trước rửa giải Một vài hợp chất không loại bỏ khỏi ARN (hoặc ADN) phương pháp thông thường chúng tương tự acid nucleic Như vậy, nên cân nhắc sử dụng kỹ thuật loại bỏ chất ức chế cho mẫu tự nhiên Tỷ số 260/280 thấp chủ yếu sử dụng lượng mẫu đầu vào lớn khiến protein không loại bỏ hoàn toàn Hãy làm mẫu phương pháp bạn sử dụng phenol:chloroform thêm muối gắn, ethanol để gắn với màng lọc silica khác Protein dễ dàng loại bỏ Lần thí nghiệm sau, cần ý sử dụng lượng mẫu Vấn đề 4: Lượng ARN thu thấp Lượng ARN thu có khác biệt rõ ràng kiểu tế bào, loại mô khác Đối với ARN máu, hiệu suất thu khác biệt tùy người Nguyên nhân: Nếu lượng ARN thu thấp dự đoán ARN nguyên vẹn phân hủy ARN nguyên nhân tượng Khi đó, trình nghiền đồng thể chưa hoàn toàn Để phân tách ARN, bước ly giải đóng vai trò quan trọng Các mẫu mô lưu giữ RNALater thường khó làm đồng Sai sót tính toán khối lượng mô số lượng tế bào lý khiến lượng ARN thu thấp Trong trường hợp này, số lượng tế bào thực tế tính toán Giải pháp: Trường hợp ARN nguyên vẹn: ý vào phương pháp nghiền đồng thể, đảm bảo ADN tổng số bị phân cắt toàn ARN giải phóng hoàn toàn từ tế bào mảnh mô sót lại mang ARN Sử dụng công cụ tính toán thật xác để định lượng chuẩn mảnh mô hay đếm số lượng tế bào Nếu ARN bị phân hủy dẫn đến lượng thu thấp, vấn đề nảy sinh giai đoạn bảo quản nghiền đồng thể mạnh hay gia nhiệt lâu (nên tiến hành theo chu kỳ: gia nhiệt 30-45s -dừng 30s) Chú ý cắt mẫu mô nhanh chóng đưa chúng vào đệm ly giải guanidine lạnh (hoặc TRIzol) để ngăn chặn hoạt động RNase Với màng lọc xoay silica, cần đảm bảo trình rửa giải cột đủ để giải phóng ARN khỏi màng Sử dụng thể tích nước lớn trình rửa giải cho lượng ARN nhiều Kết luận Sự phân tách ARN từ nguồn khác tuân theo quy trình tương tự Trong đó, trình nghiền đồng thể bước quan trọng Quá trình thực tốt giúp tế bào nhanh chóng bị phá vỡ, RNases bị bất hoạt đệm ly giải ADN tổng số phân hủy tới kích thước dễ dàng rửa trôi Rna extraction RNA EXTRACTIONRNA extraction is the purification of RNA from biological samples Là Tinh arn từ mẫu sinh học DNA > mRNA > protein Lots of information in mRNA: When is gene expressed? What is timing of gene expression? What is the level of gene expression? (but what does an mRNA measurement really say about expression of the protein?) Nhiều thông tin mrna : biểu gen đâu? Khi biểu gen’? mức dộ biểu gen? Nhưng đo lường rna nói biểu prootein? RNA in a typical eukaryotic cell:10-5 micrograms RNA80-85% is ribosomal RNA1520% is small RNA (tRNA, small nuclear RNAs)About 1-5% is mRNA variable in size -but usually containing 3’ polyadenylation Rna mẫu nhân chuẩn điển hình The problem(s) with RNA:RNA is chemically unstable spontaneous cleavage ofphosphodiester backbone via intramoleculartransesterificationRNA is susceptible to nearly ubiquitous RNA-degradingenzymes (RNases) RNases are released upon cell lysis RNases are present on the skin RNases are very difficult to inactivate disulfide bridges conferring stability no requirement for divalent cations foractivity Common sources of RNase and how to avoid theContaminated solutions/buffers USE GOOD STERILE TECHNIQUE TREAT SOLUTIONS WITH DEPC (when possible) MAKE SMALL BATCHES OF SOLUTIONSContaminated equipment USE “RNA-ONLY” PIPETS, GLASSWARE, GEL RIGS BAKE GLASSWARE, 300 °C, hours USE “RNasefree” PIPET TIPS TREAT EQUIPMENT WITH DEPC 10 INHIBITORS OF RNASE′ DEPC: diethylpyrocarbonate Alkylating agent, modifying proteins and nucleic acids Fill glassware with 0.1% DEPC, let stand overnight at room temp or NaOH or H2O2 Solutions may be treated with DEPC (0.1%), then autoclave (DEPC breaks down to CO2 and ethanol) Vanadyl ribonucleoside complexes Competitive inhibitors of RNAses, but need to be removed from the final preparation of RNA′ Protein inhibitors of RNAse horseshoe-shaped, leucine rich protein, found in cytoplasm of most mammalian tissues must be replenished following phenol extraction steps 11 Making and using mRNA (1) 12 Making and using mRNA (2) 13 BASIC STEPS IN ISOLATINGRNA FROM CLINICAL SPECIMENS Separate WBCs from RBCs, if necessary Lyse WBCs or other nucleated cells in presence of protein denaturants, RNase inhibitors Denature/digest proteins Separate proteins, DNA, and contaminants from RNA Precipitate RNA if necessary Resuspend RNA in final buffer 14 10 SELECTIVE CAPTURE OF MRNA′ Oligo dT is linked to cellulose matrix RNA is washed through matrix at high salt concentration Non-polyadenylated RNAs are washed through polyA RNA is removed under low-salt conditions (not all of the non-polyadenylated RNA gets removed′ Poly(U) sepharose chromatography′ Poly(U)coated paper filters′ Streptavidin beads:′ A biotinylated oligo dT is added to guanidinium- treated cells, and it anneals to the polyA tail of mRNAs′ Biotin/streptavidin interactions permit isolation of the mRNA/oligo dT complexes 15 11 RNA ISOLATION METHODSCESIUM CHLORIDE GRADIENT′ Used mainly to get clean RNA for Northern blots′ Homogenize cells in guanidinium isothiocyanate and bmercaptoethanol solution.′ Add to CsCl gradient and centrifuge for 12–20 hours; RNA will be at the bottom of tube.′ Re-dissolve in TE/SDS buffer.′ Precipitate RNA with salt and ethanol, then rehydrate.′ Advantage: high quality′ Disadvantages: extremely timeconsuming, hazardous materials disposal issues 16 12 RNA ISOLATION METHODSGUANIDINIUM-BASED ORGANIC ISOLATIONGUANIDINIUM THIOCYANATE-PHENOL-CHLOROFORM EXTRACTION IS THEMOST COMMON METHOD (TRIZOL METHOD) liquid-liquid′ Phenol/guanidinium (chaotropic ) solution disrupts cells, extraction solubilizes cell components, but maintains integrity of technique RNA.′ Add chloroform, mix, and centrifuge.′ Proteins/DNA remain at interface.′ RNA is removed with aqueous top layer.′ RNA is precipitated with alcohol and rehydrated.′ Advantage: faster than CsCl method better purity no RNA is lost′ Disadvantages: fume hood required, hazardous (Phenol and chloroform) waste disposal issues, chaotropic 17 13 RNA ISOLATION METHODS NONORGANIC SALT PRECIPITATION′ Cellmembranes are lysed and proteins are denatured by detergent (such as SDS) in the presence of EDTA or other RNase inhibitors.′ Proteins/DNA are precipitated with a high concentration salt solution.′ RNA is precipitated with alcohol and rehydrated.′ Advantages: 18 Fast and easy, nontoxic 19 Produces high quality RNA 20 14 RNA ISOLATION METHODSAFFINITY PURIFICATION OF RNAθ Lyse cells, and spin to remove large particulates/cell debrisθ Apply lysate (containing nucleic acids and cellular contaminants) to column with glass membraneθ Wash with alcohol to remove contaminants; nucleic acids stick to glass membrane while contaminants wash through Treat with DNase enzyme to remove contaminating DNA.θ Apply water to the column; purified RNA washes off the glass and is collectedθ Disadvantage θ cannot adsorb RNA transcripts shorter than 200 bp (siRNA and miRNA) 21 15 NUCLEIC ACID ANALYSIS′ DNA or RNA is characterized using several different methods for assessing quantity, quality, and molecular size 22 UV spectrophotometry 23 Agarose gel electrophoresis 24 Fluorometry 25 Colorimetric blotting 26 16 QUANTITY định lượng FROM UV SPECTROPHOTOMETRY Quang phổ′ DNA and RNA absorb hấp thụ maximally at 260 nm.′ Proteins absorb at 280 nm.′ Background scatter gaiir phân tán absorbs at 320 nm 27 17 QUANTITY FROM UV SPECTROPHOTOMETRY′ [DNA] =(A260 – A320) X dilution pha loãng factor X 50 µg/mL′ [RNA] =(A260 – A320) X dilution factor X 40 µg/mL′ Concentration cô đặc = µg of DNA or RNA per mL of hydrating solution hòa tan 28 18 QUANTITY FROM UV SPECTROPHOTOMETRY CALCULATING YIELD hiệu suất Multiply nhân the concentration of the DNA or RNA sample by the volume of hydrating solution added.Example for DNA: 150 µg/mL X 0.1 mL = 15 µg Concentration from Volume thể tích of DNA yield UV Spec (µg DNA hydration per ml of hydrating solution solution) 29 19 QUALITY FROM UVSPECTROPHOTOMETRY A260/A280 = measure of purity (A260 – A320)/(A280 – A320) 1.7 – 2.0 = good DNA or RNA