Phân lập, xác định cấu trúc và nano hóa một số hợp chất, có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường từ loài mía dò (costus speciosus smith) ở các huyện miền núi thanh hóa

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trính nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, chƣa đƣợc cơng bố có nguồn gốc rõ ràng đƣợc trìch dẫn đầy đủ theo quy định Thanh Hóa, ngày 23 tháng năm 2021 Tác giả Trịnh Hồng Hạnh i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lịng kình trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Xuân Lƣơng ,TS Nguyễn Thành Dƣơng ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tôi, tạo điều kiện giúp đỡ cho lời khuyên qúy báu để tơi hồn thành đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô thuộc Bộ mơn Hóa họcTrƣờng Đại học Hồng Đức, Phịng Hóa Sinh Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian làm nghiệm hồn thành đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn đề tài cấp Tỉnh :Nghiên cứu sản xuất sản phẩm tác dụng hỗ trợ điều hòa glucose huyết bệnh nhân đái tháo đƣờng type từ lồi mìa dị (Costus L.) địa bàn huyện miền núi tỉnh Thanh Hóa, hỗ trợ tơi kinh phì q trính làm luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đính bạn bè tơi - ngƣời ln động viên, khìch lệ tơi sống học tập để tơi hồn thành tốt đề tài nghiên cứu này./ Thanh Hóa, ngày 23 tháng năm 2021 Tác giả Trịnh Hồng Hạnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÍ HIỆU vi DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ vii DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ viii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu Nhiệm vụ, nội dung nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Dự kiến kết Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Nghiên cứu chi Costus L 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Các nghiên cứu hoạt tình sinh học 1.3.1 Hoạt tình chống oxi hóa 1.3.2 Hoạt tình chống ung thƣ 10 1.3.3 Hoạt tình kháng viêm 12 1.3.4 Hoạt tình bảo vệ gan 14 1.3.5 Hoạt tình chống stress 15 1.3.6 Hoạt tình kháng khuẩn 16 1.3.7 Hoạt tình chống tiểu đƣờng hạ lipid máu 16 1.3.8 Nghiên cứu độc tình 19 1.4 Cây mìa dò 20 1.4.1 Đ c điểm thực vật 20 iii 1.4.2 Thành phần hóa học 20 1.4.3 Công dụng 22 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 23 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Thu mẫu 23 2.3 Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp hóa học 23 2.3.1 Phƣơng pháp ngâm chiết với dung mơi thìch hợp 23 2.3.2 Phƣơng pháp sắc ký cột 26 2.3.3 Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 27 2.3.4 Phƣơng pháp nano hóa 27 2.4 Hóa chất thiết bị 28 2.4.1 Hoá chất 28 2.4.2 Thiết bị 28 2.5 Nghiên cứu hợp chất từ mìa dị 29 2.5.1 Thiết bị 29 2.5.2.Nguyên liệu thực vật 29 2.5.3 Phân lập hợp chất 30 2.6 Các kiện phổ hợp chất phân lập đƣợc 30 Chƣơng KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Biện luận xác định cấu trúc hợp chất LH.1 34 3.2 Biện luận xác định cấu trúc Hợp chất LH.2 38 3.3 Biện luận xác định cấu trúc Hợp chất LH.3 43 3.4 Biện luận xác định cấu trúc Hợp chất LH.4 49 3.5 Biện luận xác định cấu trúc Hợp chất LH.5 52 3.6 Tím hiểu hoạt tình Diosgenin 55 3.6.1 Hoạt tình Diosgenin 55 3.6.2 Ví cần nano hóa Diosgenin 57 3.7 Q trính nano hóa hoạt chất Diosgenin 58 iv 3.7.1 Tạo hạt liposome 58 3.7.2 Nghiên cứu tình chất hạt liposome Diosgenin 59 KẾT LUẬN 63 BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN CƠNG TRÌNH 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÍ HIỆU Viết tắt, kí hiệu Chú giải δ Độ dịch chuyển hoá học J Hằng số tƣơng tác spin-spin s Singlet d doublet dd Doublet of doublet ddd Doublet of doublet of doublet IR Phổ hấp thụ hồng ngoại UV Phổ tử ngoại UV254 Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 254 nm UV366 Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 366 nm ESI-MS Phổ khối lƣợng va chạm electron NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Phổ cộng hƣởng từ proton HNMR DEPT45 Phổ tìn hiệu hạn nhân lần (xác định C có 1H) DEPT90 Phổ tìn hiệu hạn nhân lần (xác đinh CH nhóm metin) DEPT135 Phổ tìn hiệu hạn nhân lần (xác định CH, CH2, CH3) DEPT-NMR Phổ tìn hiệu hạn nhân 13 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C CNMR HMBC Phổ tƣơng quan H-C qua 2,3 liên kết (tƣơng tác xa) HSQC Phổ tƣơng quan H-C qua liên kết (tƣơng tác gần) COSY Phổ tƣơng quan giữ proton-proton NOESY Phổ dựa vào tƣơng tác H-H qua không gian SKLM Sắc ký lớp mỏng GC Sắc ký khì GC/MS Sắc ký khì- phổ khối CC Sắc ký cột thƣờng vi DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ Bảng 3.1.: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất LH.1 34 Bảng 3.2: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất LH.2 39 Bảng 3.3: Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất LH.3 44 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ hợp chất LH.4 51 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ hợp chất LH.5 54 Bảng 3.6 Các đ c tình vật lý Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) / Cholesterol (Chol) liposome Diosgenin liposome nạp vào (n = 3) 61 vii DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Sơ đồ 2.1: Chiết hợp chất phần m t đất mìa dị 32 Hính 1.1 Hính ảnh mìa dị 20 Sơ đồ 2.1: Chiết hợp chất phần m t đất mìa dị 33 Hình 3.1.2: Phổ 1H-NMR hợp chất LH.1 36 Hình 3.1.3: Phổ 1H-NMR hợp chất LH.1 (phổ dãn) 36 Hình 3.14: Phổ 1H-NMR hợp chất LH.1 (phổ dãn) 37 Hình 3.1.5: Phổ 13C-NMR hợp chất LH.1 37 Hình 3.1.6: Phổ DEPT hợp chất LH.1 (phổ dãn) 38 Hình 3.2.1: Phổ khối lƣợng va chạm (EI-MS) hợp chất LH.2 40 Hình 3.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất LH.2 41 Hình 3.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất LH.2 41 Hình 3.2.4: Phổ 13C-NMR hợp chất LH.2(phổ dãn) 42 Hình 3.2.5: Phổ DEPT hợp chất LH.2 (phổ dãn) 42 Hình 3.3.1: Phổ IR hợp chất LH.3 45 Hình 3.3.2: Phổ khối lƣợng va chạm electron hợp chất LH.3 46 Hình 3.3.3: Phổ 1H-NMR hợp chất LH.3 46 Hình 3.3.4: Phổ 13C-NMR hợp chất LH.3 47 Hình 3.3.5: Phổ 13C-NMR hợp chất LH.3 47 Hình 3.3.6: Phổ 13C-NMR hợp chất LH.3 (phổ dãn) 48 Hình 3.3.7: Phổ DEPT hợp chất LH.3 48 Hình 8: Phổ DEPT hợp chất LH.3 (phổ dãn) 49 Hình 3.4.1 Phổ C13-NMR LH.4 49 Hình 3.4.2 Phổ khối lƣợng LH.4 50 Hình 3.5.1 Phổ khối lƣợng ESI-MS chất LH.5 52 Hình 3.5.2 Phổ C13-NMR LH5 53 Hình 3.5.3 Phổ HSQC HMBC LH5 53 Hính 1: Cấu tạo hạt liposome có chứa zerumbone từ DOPC PEG-Chol 58 Hình 2: Sự giải phóng diosgenin khỏi hạt liposome đóng gói PBS pH 7.4 5.5 phƣơng pháp thẩm tách nghiệm in vitro 61 viii MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đất nƣớc Việt Nam có dạng hính chữ S gồm phần đất liền trải dài theo vĩ độ Bắc từ 8030’ đến 23022’, có 4/5 diện tìch đồi núi, khì hậu nhiệt đới gió mùa Những yếu tố địa lý khì hậu nhƣ điều kiện thuận lợi để sinh vật phát triển đa dạng số lƣợng, phong phú chủng loại Theo ƣớc tình, Việt Nam có khoảng 11.000 lồi thực vật bậc cao có mạch, 800 lồi rêu, 600 loài nấm 2000 loài tảo Trong đó, có nhiều lồi đƣợc dùng làm thuốc Đ c biệt, năm 2016 Viện Dƣợc liệu công bố 5117 loài thuốc Danh mục Cây thuốc Việt Nam Những đ c thù môi trƣờng nhƣ tạo cho nƣớc ta hệ thực vật phong phú đa dạng Theo số liệu thống kê gần hệ thực vật Việt Nam có 10.000 lồi [1], [2] có khoảng 3.200 lồi đƣợc sử dụng y học dân tộc 600 loài cho tinh dầu [2] Đây nguồn tài nguyên thiên nhiên quý báu đất nƣớc Tác dụng chữa bệnh cỏ chình hoạt chất có chứa định Nguồn tài nguyên thực vật dùng làm thuốc có tác dụng chữa bệnh tốt nói đến khả sinh, tổng hợp, chuyển hố tìch luỹ hoạt chất tự nhiên có hoạt tình sinh học lồi thực vật Ở Việt Nam tỷ lệ số nguời mắc bệnh TĐ, ung thƣ mức báo động, Tuy vậy, loại thuốc chữa trị bệnh đƣợc sử dụng thị trƣờng chƣa có tác dụng chọn lọc đ c biệt chúng có nhiều tác dụng phụ khơng mong muốn, số dẫn đến hệ lụy bệnh tim mạch nguy hiểm với ngƣời sử dụng M c dù có số cơng trính nghiên cứu phát triển dịng sản phẩm thuốc thực phẩm chức từ thuốc có nguồn gốc thiên nhiên để điều trị bệnh Việt Nam Tuy nhiên, sản phẩm chƣa đƣợc nghiên cứu triệt để m t y dƣợc học, tác dụng chúng chƣa thực đạt đƣợc nhƣ mong muốn Ngoài ra, dƣợc liệu sử dụng để điều trị bệnh chủ yếu dựa sở y học dân tộc mà chƣa đƣợc nghiên cứu chi tiết đầy đủ m t khoa học đại, chƣa đánh giá đƣợc tác dụng thực nhƣ chế tác dụng thành phần làm nên tác dụng chúng Trên giới, nhiều loài thuộc chi Costus L đƣợc sử dụng hiệu việc hạ lƣợng đƣờng glucose máu Tại Ấn Độ, số loài nhƣ Costus igneus, Costus pictus Costus speciosus đƣợc nghiên cứu có hiệu tốt hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng Tại Việt Nam nói chung Thanh Hóa nói riêng, số lồi thuộc chi Costus L nhƣ mìa giị (phần rễ vị thuốc cát lồi) mọc hoang phổ biến đƣợc sử dụng nhƣ thuốc quý Trong dân gian, từ lâu sử dụng Cát lồi để chống viêm, chữa sốt, đái buốt, thấp khớp, đau lƣng, đau dây thần kinh Ngoài ra, cành non mìa dị cịn sử dụng để chữa viêm tai giữa, mát gan, giảm đau nhức Tại Nam Bộ, dùng bánh xèo khơng thể khơng có loại rau chình mìa dị Các nghiên cứu khảo sát sơ thành phần hóa học mìa dị (Costus speciosus) Việt Nam có chứa hoạt chất chình tƣơng tự nhƣ loài Costus speciosus Ấn Độ Tuy nhiên, việc khai thác loài dừng sử dụng thân rễ nhƣ vị thuốc dân gian Các nghiên cứu để đánh thức tiềm phát triển loài thuộc chi Costus speciosus thành sản phẩm mang tình đại, góp phần hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng cịn hạn chế Ví tơi chọn đề tài: Phân lập, xác định cấu trúc nano hóa số hợp chất, có khả hỗ trợ điều trị ệnh tiểu đƣ ng t lồi Mía d Costus speciosus Smith hu ện miền núi Thanh Hóa Mục tiêu nghiên cứu Tách xác định cấu trúc nano hóa số hợp chất có khả hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng từ lồi mìa dị Thanh Hóa caspase – 3, dẫn tới chết theo lập trính tế bào MCF – [23] Có thể chế đằng sau hoạt tình chống ung thƣ thành phần C speciosus khả điều tiết tăng chết theo lập trính điều tiết giảm phân tử chống lại chết theo lập trính Hai yếu tố dẫn tới giảm tăng sinh tế bào ung thƣ [24] Hoạt tình chống tiểu đƣờng C speciosus liên quan tới thành phần Costunolide, Diosgenin có khả kìch thìch tể bào β tiết insulin nhờ ức chế biểu NOS, dẫn tới tái tạo tế bào β [51] Nhóm tác giả chuẩn bị dịch chiết thô hexane, ethyl acetate, methanol nƣớc từ C speciosus, sau cho chuột bị gây tiểu đƣờng STZ khác uống dịch chiết cách đ t ống đƣờng miệng, với liều lƣợng loại dịch chiết lần lƣợt 250, 400, 400 600 mg/kg (khối lƣợng thể) vòng tháng Họ xác định đƣợc giảm đáng kể hàm lƣợng glucose huyết tƣơng cao chuột bị tiểu đƣờng đƣợc cho uống dịch chiết so với đối chúng Thêm đó, dịch chiết thơ hexan khơi phục protein mô bị thay đổi ADA tuyến tụy bị thay đổi, đồng thời điều hòa hàm lƣợng insulin Cpeptide huyết tƣơng [52] Ngoài ra, mức độ biểu insulin, thụ thể insulin A, glucokinase (GK), pyruvate kinase (PK), succinate dehydrogenase (SDH) protein vận chuyển glucose đƣợc tăng cho chuột bị tiểu đƣờng (STZ) uống dịch chiết C speciosus liều lƣợng 400 600 mg/kg khối lƣợng thể vòng tuần, so với nhóm chuột đƣợc cho Gibenclamide [53] C specious tăng hàm lƣợng insulin huyết thanh, đồng thời tăng đáng kể hoạt động Glucokinase gan (EC 2.7.1.2), aldolase (EC 4.1.2.13), Pyruvatekinase (EC 2.7.1.40), Succinate dehydrogenase (EC 1.3.5.1), glycogen synthase (EC 2.4.1.11) Một nghiên cứu khác gần đƣợc tiến hành nhằm nghiên cứu khả bảo vệ bệnh nhân bị tiểu đƣờng khỏi biến chứng gây glycations Dịch chiết methanol tử C speciosus thu hái 56 Moratuwa, Sri Lanka đƣợc sử dụng để nghiên cứu hoạt tình ức chế enzyme tuyến tụy thuộc lợn α-amylase α-glucosidase tinh chế từ Saccharomyces cerevisiae) Các tác giả xác nhận đƣợc hoạt tình ức chế in vitro dịch chiết C speciosus hoạt động α-amylase (EC 3.2.1.1) α-glucosidase (EC 3.2.1.20) Sự ức chế α-amylase αglucosidase trí hỗn q trính tiêu hóa carbohydrate giảm lƣợng glucose đƣợc hấp thụ, giảm lƣợng glucose máu sau bữa ăn giảm lƣợng glycation huyết tƣơng [54] Cần có thêm nghiên cứu hoạt tình C speciosus nhƣ thành phần biểu gene mã hóa vận chuyển monosaccharide ruột, enzyme sinh glucose từ thể, nhƣ khả tái tạo tế bào β để có nhín tồn diện hoạt tình điều hịa lƣợng đƣờng máu C speciosus 3.6.2 Vì c n nano hóa Diosgenin Việc sử dụng Diosgenin g p hạn chế chất , hoạt tình sinh học khả thâm nhập vào máu bị hạn chế, dùng Diosgenin dạng nguyên thủy điều trị cho hiệu thấp Các phƣơng pháp vận chuyển thuốc truyền thống hóa trị liệu nhƣ tiêm tĩnh mạnh tránh khỏi vấn đề Để khắc phục vấn đề tình tan diosgenin, sử dụng liposome - cấu trúc dạng túi gồm ho c nhiều lớp màng kép phospholipid bao xung quanh khoang chứa nƣớc Việc sử dụng liposome có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ tình tƣơng thìch sinh học sinh khả dụng tốt Hơn nữa, thành phần màng liposome cịn đƣợc thay đổi để kiểm sốt q trính vận chuyển giải phóng thuốc 57 Hình 1: Cấu tạo hạt liposome có chứa zerumbone từ DOPC PEG-Chol 3.7 Q trình nano hóa hoạt chất Diosgenin 3.7 ạo hạt liposome Phương pháp nghiên cứu Poly(ethylene glycol)-cholesterol (PEG-Chol) đƣợc tổng hợp phịng nghiệm từ PEG (Mw = 2000) Cholesterol (Sigma, MA, Hoa Kỳ) thông qua sản phẩm trung gian succinyl cholesterol Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) đƣợc mua sẵn từ Avanti Polar Lipids (Hoa Kỳ) Chloroform đƣợc mua Chemsol, Việt Nam; methanol đƣợc mua từ Merck, Đức; màng thẩm tách đƣợc mua từ Sigma Aldrich Các máy móc thiết bị đƣợc sử dụng bao gồm máy cô quay (Buchi, Thụy Sĩ), đùn ép (Avanti Polar Lipids, USA), máy đo kìch thƣớc (Horiba, Nhật Bản) máy lắc vortex máy khuấy từ (Velp Scientifica, Italy) Hỗn hợp lipid DOPC/PEG-Chol đƣợc chuẩn bị theo tỉ lệ 2,5:1; 5:1; 10:1 20:1, tất tỉ lệ 250 uL DOPC 0,025 M CHCl đƣợc sử dụng, lƣợng Cholesterol cần dùng đƣợc tình từ tỉ lệ mol Hỗn hợp đƣợc chuẩn bị ống eppendorf vortex Tất lipid chƣa dùng đƣợc bảo quản 0C tủ lạnh Liposome thô đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp hydrat hoá màng mỏng Hỗn hợp DOPC/PEG-Chol đƣợc chuyển từ ống eppendorf sang bính cầu CHCl3 đƣợc loại bỏ từ từ sử dụng cô quay (Buchi, Thụy Sĩ), nhiệt độ 58 30 0C, áp suất bính 600 mBar, tốc độ quay Sản phẩm thu đƣợc lớp màng lipid mỏng đáy bính Tiếp tục bổ sung 1ml nƣớc cất siêu âm (40 C, phút) để bóc lớp màng lipid khỏi đáy bính Kết thu đƣợc huyền phù đục, có chứa liposome nhiều kìch thƣớc dạng khác Để giảm độ đa phân tán đƣa liposome kìch thƣớc chung, đùn ép (Avanti Polar Lipids, USA) đƣợc sử dụng với màng Polycarbonate 100 nm Mỗi mẫu liposome thô đƣợc ép qua màng 50 lần Một lần đƣợc tình tồn thể tìch huyền phù qua màng Sau đùn ép xong, mẫu đƣợc chuyển sang ống eppendorf lƣu bóng râm nhiệt độ phịng (25 0C) Giá trị z-trung bính, kìch thƣớc trung bính số phân tán (PDI) mẫu liposome đƣợc xác định nhiệt độ phòng (25oC) cách sử dụng thiế bị phân tìch kìch thƣớc hạt nano SZ-100 zeta potential (Horiba, Japan) với laser He/Ne (λ = 633 nm) góc tán xạ 90 oC Các phép đo đƣợc l p lại lần kết thu đƣợc kết trung bính lần đo Kết thảo luận Các hạt liposome đƣợc tạo thành phƣơng pháp hydrat hoá màng mỏng kết hợp với ép đùn qua màng polycarbonate 0.1 µm Các đ c tình hố lý cấu trúc hạt liposome thƣờng (blank liposome) hạt liposome chứa Diosgenin đƣợc phân tìch Kìch thƣớc trung bính hạt liposome thƣờng 110.17 ± 8.39 (nm) kìch thƣớc trung bính hạt liposome chứa Diosgenin 114.03 ± 9.73 (nm) (Hính 2) Chỉ số phân tán hạt liposome thƣờng 0.153 ± 0.056 (nm) hạt liposome chứa Diosgenin 0.192 ± 0.019 (nm) Khơng có khác biệt đáng kể kìch thƣớc trung bính PDI hạt liposome thƣờng liposome chƣa Diosgenin 3.7 Nghiên cứu tính chất hạt liposome Diosgenin + Xác định hiệu suất hàm lượng thuốc đóng gói hạt liposome 59 Để xác định hiệu suất đóng gói (EE%) hàm lƣợng thuốc đóng gói (DL%), mẫu đƣợc chuyển sang bính đáy trịn 100 mL làm bay sử dụng cô quay (nhiệt độ bể 45 0C, áp suất bính mBar, tố độ quay 3) hết nƣớc cịn lại lớp màng mỏng bính Màng lipids/ Diosgenin đƣợc hoà tan 3.5mL MeOH/CHCl3 [3:1, (v/v)] phá vỡ cấu trúc sóng siêu âm bể phút để phá huỷ hạt liposome dung dịch huyền phù giải phóng Diosgenin Sau đó, 100 uL dung dịch đƣợc thêm vào hỗn hợp 2900 uL MeOH/CHCl3 [3:1, (v/v)] ống eppendorf vortex cho 30s Hỗn hợp đƣợc chuyển sang cuvet thuỷ tinh, độ hấp thụ mẫu đƣợc xác định bƣớc sóng 243 nm máy quang phổ Hitachi U-2900 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) + Khả giải phóng thuốc liposome chứa Diosgenin Phƣơng pháp thẩm tách đƣợc sử dụng để khảo sát giải phóng zerumbone từ hạt liposome đóng gói Diosgenin Các hạt liposome chứa Diosgenin đƣợc đ t vào túi thẩm tấch có khối lƣợng phân tử giới hạn 14000 DA, sau đƣợc ủ với PBS điều kiện pH khác 7.4 5.5 với 0.5% Tween 80 37 0C, lắc với tốc độ 100 vòng/phút Tại khoảng thời gian xác định, ml mẫu đƣợc lấy thay thể tìch đệm Các mẫu đƣợc phân tìch máy quang phổ UV-Vis để tình lƣợng tìch luỹ Diosgenin đƣợc giải phóng Tất số liệu giá trị trung bính lần l p lại đƣợc thể dƣới dạng trung bính ± độ lệch chuẩn (SD) + Hiệu suất hàm lượng thuốc đóng gói liposome Kết bảng cho thấy hiệu suất đóng gói thuốc (EE%) hàm lƣợng thuốc đóng gói (DL) liposome lần lƣợt 58.2 ± 4.2 % 3.19 ± 0.32%, kìch thƣớc trung bính hạt 100nm với PDI < 0.02, cho thấy hiệu suất đóng gói thuốc cao phân bố hẹp Những kết cho thấy đƣợc tiềm liposome việc cải thiện hiệu điều trị Diosgenin 60 Bảng 3.6 Các đặc tính vật lý Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) / Cholesterol (Chol) liposome Diosgenin liposome nạp vào (n = 3) EE (%) DL (%) Blank liposome - - Diosgenin – loaded liposome 58.2 ± 4.2 3.19 ± 0.32 + Khả giải phóng thuốc liposome chứa Diosgenin Môi trƣờng bên khối u số ngăn tế bào đƣợc chứng minh độ pH tƣơng đối thấp, đƣợc xem yếu tố đánh giá giải phóng thuốc hạt liposome mang z Diosgenin hạt liposome thƣờng Trong nghiên cứu này, pH 7.4 5.5 đƣợc chọn nghiệm đƣợc tiến hành nhiệt độ 370C 96 Nhƣ hính 3, tốc độ giải phóng thuốc hạt liposome mang Diosgenin thay đổi theo mức pH khác Hình 2: Sự giải phóng diosgenin khỏi hạt liposome đóng gói PBS pH 7.4 5.5 phương pháp thẩm tách thí nghiệm in vitro Trong 24 đầu tiên, Diosgenin đƣợc giải phóng từ hạt liposome đóng gói 45% dƣới 55% tƣơng ứng với điều kiện pH môi trƣờng 7.3 5.4 Tuy nhiên, trính giải phóng diosgenin hai điều kiện pH sau bị châm lại trí tốc độ ổn định ìt 96 Nhín chung, m c 61 dù giải phóng Diosgenin PBS nhanh chút pH thấp hơn, khác biệt đƣợc coi khơng có ý nghiã (p > 0.05) Những liệu cho thấy bao bọc Diosgenin hạt liposome cho phép giải phóng hợp chất với tốc độ không đổi suốt khoảng thời gian dài 62 KẾT LUẬN Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học Mìa dò (Costus speciosus Smith) huyện miền núi Bá Thƣớc thu đƣợc kết nghiên cứu sau: - Đã xây dựng đƣợc qui trình chiết phân tách để điều chế đƣợc cao chiết n-hexan, etyl axetat, butanol phần chiết nƣớc chứa hợp chất từ phần m t đất Mìa dị - Đã phân tìch sắc ký lớp mỏng (TLC) dịch chiết etyl axetat để xác định điều kiện sắc ký định tình xác định hệ dung mơi thích hợp cho phân tách sắc ký phần cao - Bằng phƣơng pháp sắc ký cột với dung môi giải hấp khác nhau, nồng độ khác phân lập phân đoạn cao etylaxetat đƣợc hợp chất stigmasterol;  - sitosterol;  - sitosterol 3-O--D-glucopyranosit; diosgenin; diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β- D-glycopyranosid - Cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập đƣợc xác định cách kết hợp phƣơng pháp phổ đại: ESI-MS, 1H-NMR, 13 C-NMR DEPT HMBC, HSQC xác định đƣợc cấu trúc 05 hợp chất : sitosterol; Đã Nano hóa hoạt chất Diosgenin thành cơng hoạt chất có haotj tình sinh học cao có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thƣ điều hòa đƣờng huyết 63 BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN CƠNG TRÌNH Trịnh Hồng Hạnh, PGS.TS Ngô Xuân Lƣơng, TS Ngu ễn Thành Dƣơng Các hợp chất sterol steroid đƣợc phân lập xác định cấu trúc t Costus speciosus smith Thanh Hóa Việt Nam ạp chí Hóa h c Ứng d ng – ISSN 1859-4069 Số 64 (56)/2021 ;39-45 p lồi mía d TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phạm Hoàng Hộ (1992) Cây cỏ Việt Nam Montreal Đỗ Tất Lợi (1999) Cây thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985) Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc Nhà xuất Y học Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1985) Các phương pháp sắc ký Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Tiếng Anh Kraemer FB, Shen WJ Hormone-sensitive lipase: Control of intracellular tri-(di-) acylglycerol and cholesteryl ester hydrolysis J Lipid Res 2002;43:1585-94 Back to cited text no [PUBMED] Kuo H Y., Yeh M H (1997), Chemical constituents of heartwood of Bauhinia purpurea, J Chin Chem Soc., 44, pp 379-383 Whistler, W.A.2000.Tropical ornamentals: a guide Timber press, Portland, Oregon.542pp MerinaBenny (2004), Insulin plant in gardens.Natural product radiance, vol 3, pp.349-350 Gupta R.K, 2010 Medicinal and Aromatic Plants, CBS Publishers and Distributors, 234,499 10 Sarin,Y.K., Singh, A., Bedi, K.L.,Kapur, S.K., Kapahi, B.Kand Atal, C.K.1982: Costus speciosus rhizomes as a commercial source of diosgenin In: Cultivation and utilisation of Medicinal Plants,C.K.Atal and B.M.Kapur (eds.), RRL-CSIR, Jammu Tawi,PP.106-118 11 Gupta A.K, Tondon N, Sharma M,2008 Quality Standards of Indian Medicinal Plants,Medicinal Plants Unit, Published by Indian Council of Medical Research, Vol VII, 48 12 Bown Deni,2008 Encyclopaedia of Herbs, The Royal Horticulture 65 Society, Page no181 13 Chopra R.N, Nayar S L, Chopra I C,2006.Glossary of Indian Medicinal Plants, National 14 Sivarajan, V.V and Balachandran,I.1994.Ayurvedic drugs and their plant sources, Oxford and IBH Publishing Co.pvt Ltd, New Delhi 15 Khanna, P., G L Sharma, A K Rathore and S K Manot (1977) Effect of cholesterol on in vitro suspension tissue cultures of Costusspeciosus(Keon.) Sm Dioscorea floribunda, Solanumaviculareand Solanumxanthocarpum Ind J Exptl Biol 15:1025-1027 16 Rathore, A K and P Khanna ,1978 Production of diosgenin from Costusspeciosus(Koen.) Sm and SolanumnigramL suspension cultures Curr Sci 47:870-871 17 Rastogi, R P and B N Mehrotra ,1991 Compendium of Indian medicinal plants p.81-84, vol.2 (1970-1979) Lucknow, India: Central Drug Research Institute (CDRI) 18 Bhuyan B., Zaman K 2008 Evaluation of hepatoprotactive activity of rhizomes ofCostusspeciosus(J Konig.) Smith Pharmacologyonline; (3): 119-126 19 Warrier, P.K.,Nambiar,V.P.K and RamanKutty,C.1933-1995.Indian medicinal plants.Vol.1- 5,Orient Longman Ltd., Madras 20 Eliza J, Daisy P, Ignacimuthu S,2008 Journal of Health Sciences, 54(6), 675-681 21 Chopra,R.N, Nayer,S.L and Chopra,I.C 1956, Glossary of Indian medicinal plants CSIR publication and information Directorate New Delhi 22 Bhattacharya S.K., Parik A.K, Debnath P.K., Pandey V.B., Neogy N.C 1972 Anticholinesterase activity activity of Costusspeciosusalkaloids Indian J Pharmacol; 4: 178-178 66 23 Binny K, Sunil Kumar G, Dennis Thomas.2010.Journal of Basic and Clinical Pharmacy, 1(3), 177- 181 24 Hussain,A.,Virmani,O.P.,Popli,S.p.,Misra,L.N.,Gupta,M.M.,Srivastava,G N.Abraham,Z.and Singh,A.K.1992.Dictionary of Indian medicinal plants.CIMAP,Lucknow,India,546p 25 Singh, U P and Srivastava B.P 1992 Antifungal activity of steroid saponins and sapogenins from Avenasativa and Costusspeciosus Naturalia Rio Claro 17: 71-77 26 Jain, S.K 1991 Dictionary of Indian Folk Medicine and Ethno botany Deep Publications, New Delhi 27 Bhattacharya,S.K A K Parikh, P K Debnath, V B Pandey N, C.Neogy 1973.Journal of Research in Indian Medicine,8(1), 10-19 28.(a) Cheng, X L.; Ma, S C.; Yu, J D.; Yang, S Y.; Xiao, X Y.; Hu, J Y.; Lu, Y.; Shwa, P C.; But, P P H.; Lin, R C Chem Pharm Bull 2008, 56, 982–984 (b) Kirste, B.; Harrer, W.; Kurreck, H.; Schubert, K.; Bauer, H.; Gierke, W J Am Chem Soc 1981, 103, 6280–6286 29.(a) Croteau, R.; Ketchum, R E.; Long, R M.; Kaspera, R.; Wildung, M R Phytochem Rev 2006, 5, 75–97 (b) Ramachandran, C.; Kennedy, B P Curr Top Med Chem 2003, 3, 749−757 30 Caballero B The Global Epidemic of Obesity: An Overview Epidemiologic Reviews, 2007, 29(1), 1–5 31.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/ 32.Ahmad, F.; Azevedo, J J.; Cortright, R.; Dohm, G.; Goldstein, B.; J Clin Invest 1997, 100, 449–458 33 Nia Mitchell, Vicki Catenacci, Holly R Wyatt and James O Hill Obestity: Overview of an epidemic Psychiatr Clin North Am 2011, 34(4), 717–732 34 Le NTD, Pham LD, Vo TQ Type diabetes in Vietnam: a cross- 67 sectional, prevalence-based cost-of-illness study Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy 2017, 10, 363–374 35 Gershell, L Type diabetes markets Nat Rev Drug Discov 2005, 4, 367–368 36 Brennan AM, Mantzoros CS (2006) "Drug Insight: the role of leptin in human physiology and pathophysiology – emerging clinical applications" Nat Clin Pract Endocrinol Metab (6): 318–27 37 Moller DE New drug targets for type diabetes and the metabolic syndrome Nature 2001, 414, 821–827 38 Pan H, Guo J, Su Z (May 2014) "Advances in understanding the interrelations between leptin resistance and obesity" Physiology & Behavior 130: 157–69 39 Johnson TO, Ermolieff J, Jirousek MR Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors for diabetes Nat Rev Drug Disc 2002, 1, 696‒709 40 Asante-Appiah, E.; Kennedy, B P Am J Physiol Endocrinol Metab 2003, 284, E663–670 41 Elchebly, M.; Payette, P.; Michaliszyn, E.; Cromlish, W.; Collins, S.; Loy, A L Science 1999, 283, 1544–1548 42 Asolkar,L.V.,Kakkar,K K and Chakre,O.J.1992.Second supplement to Glossary of Indian medicinal plants with active principles Part I(AK).(1965-81).Publications and information Directorate(CSIR).New Delhi.414p 43 S Hasan, M Qari, DNA –RAPD Fingerprinting and Cytogenetic Screening of Genotoxic and Antigenotoxic Effects of Aqueous Extracts of Costus speciosus (Koen.),” JKAU: Sci, 22(1), pp 133-152, 2010 44 (a) Xu, K P.; Zou, H.; Tan, Q.; Li, F S.; Liu, J F.; Xiang, H L.; Zou, Z X.; Long, H P.; Li, Y J.; Tan, G S J Asian Nat Prod Res 2011, 45 Padma P, Chansauria JP, Khosa RL, Ray AK Effect of Annooa muricata 68 and Polyalthia cerasoides on brain neurotransimitters and enzyme monoamine oxidase following cold immobilization stress J Natl Remedies 2001;1:144-6 Back to cited text no 64 46 Kuo H Y., Yeh M H (1997), Chemical constituents of heartwood of Bauhinia purpurea, J Chin Chem Soc., 44, 379–383 47 Lai PK, Roy J Antimicrobial and chemopreventive properties of herbs and spices Curr Med Chem 2004;11:1451-60 Back to cited text no 67 [PUBMED] 48 Malabadi RB Antibacterial activity in the rhizome extracts of Costus speciosus (Koen.) J Phytol Res 2005;18:83-5 Back to cited text no 49 Mosihuzzaman M, Nahar N, Ali L, Rokeya B, Khan AK, Nur-E-Alam M, et al Hypoglycemic effects of three plants from Eastern Himalayan belt Diabetes Res 1994;26:127-38 Back to cited text no 52 [PUBMED] 50 Bavarva JH, Narasimhacharya AV Antihyperglycemic and hypolipidemic effects of Costus speciosus in alloxan induced diabetic rats Phytother Res 2008;22:620-6 Back to cited text no 53 [PUBMED] 51 Eliza J, Daisy P, Ignacimuthu S, Duraipandiyan V Normo-glycemic and hypolipidemic effect of costunolide isolated from Costus speciosus (Koen ex Retz.) Sm in streptozotocin-induced diabetic rats Chem Biol Interact 2009;179:329-34 Back to cited text no 54 52 Eliza J, Rajalakshmi M, Ignacimuthu SJ, Daisy P Normalizing effects of Costus speciosus rhizome crude extracts and its fractions on diabetic complications in STZ-induced diabetic 2011;20:1111-8 rats Med Chem Available http://www.link.springer.com/10.1007/s00044-010- Res from: 9448-5 [Last accessed on 2016 Nov 26] Back to cited text no 55 53 Ali HA, Almaghrabi OA, Afifi ME Molecular mechanisms of antihyperglycemic effects of Costus 69 speciosus extract in streptozotocininduced diabetic rats Saudi Med J 2014;35:1501-6 Back to cited text no 56 [PUBMED] 54 Perera HK, Premadasa WK, Poongunran J A-glucosidase and glycation inhibitory effects of Costus speciosus leaves BMC Complement Altern Med 2016;16:2 Back to cited text no 57 55 Kraemer FB, Shen WJ Hormone-sensitive lipase: Control of intracellular tri-(di-) acylglycerol and cholesteryl ester hydrolysis J Lipid Res 2002;43:1585-94 Back to cited text no [PUBMED] 56 Eliza J, Daisy P, Ignacimuthu S, Duraipandiyan V Antidiabetic and antilipidemic effect of eremanthin from Costus speciosus (Koen.) Sm in STZ-induced diabetic rats Chem Biol Interact 2009;182:67-72 Back to cited text no 60 57 Sari IP, Nurrochmad A Sub-acute toxicity study of ethanolic extract of pacing (Costus speciosus) in male mice Int J Pharm Pharm Sci 2016;8:97 Available from: 58 Dictionary of Natural product on CD-Rom, Chapman and Hall-CRC (2009) 59 Kuo H Y., Yeh M H (1997), Chemical constituents of heartwood of Bauhinia purpurea, J Chin Chem Soc., 44, pp 379-383 60 Huang Yun, Cui Lijan, Zhan Wen hong, Dou Yuhong, Wang Yongli, Wang Qiang and Zhao Ding (2007), Separation and identifiacation of steroidal compounds with cytotoxic activity against human gastric cancer cell lines in vitro from the zhizome of Paris polyphylla var chinensis”, Chemistry of natural compounds, 43 (6), pp 672-677 70