Phân lập xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất từ cây đẳng hoa ba lá (isodon ternifolius (d don) kudo) ở việt nam

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn khơng trùng lặp với khóa luận, luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu cơng bố Tác giả Lê Văn Thân ii LỜI CẢM ƠN CỦA TÁC GIẢ Để hoàn thành luận văn này, trước tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành kính trọng sâu sắc tới TS Phạm Minh Quân, Viện Hoá học Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tác giả suốt q trình hồn thành luận văn Tác giả xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, khoa KHTN-Trưòng đại học Hồng Đức tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt trình học tập trường Qua tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành thầy giáo mơn hóa học - Khoa KHTN - Trưòng đại học Hồng Đức đọc, đánh giá cho ý kiến quý báu để luận văn phong phú hoàn thiện Tác giả xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn đồng nghiệp, Ban giám hiệu trưịng THPT Triệu Sơn 2, người động viên tạo điều kiện tốt để tác giả hoàn thành khóa học Tuy có nhiều cố gắng thời gian khả nghiên cứu hạn chế nên luận văn cịn thiếu sót khó tránh khỏi Tác giả mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn đồng nghiệp để luận văn hoàn thiện Luận văn thực hoàn thành trường đại học Hồng Đức, tỉnh Thanh Hoá hướng dẫn TS Phạm Minh Quân Thanh Hóa, tháng 09 năm 2019 Học viên Lê Văn Thân iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ……………………………………………………………… 1 Lý chọn đề tài luận văn …………………………………………… Mục đích nghiên cứu luận văn …………………………………… Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………… Phương pháp nghiên cứu …………………………………………… Những đóng góp luận văn ……………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn ………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN ………………………………………… 1.1 Tổng quan chi Isodon ……………………………………………… 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân loại ………………………………… 1.1.2 Thành phần hóa học …………………………………………… 1.1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Isodon ……………………… 1.1.4 Ứng dụng ………………………………………………………… 11 1.2 Tổng quan Đẳng Hoa Ba Lá - Isodon ternifolius (D.Don) Kudo …………………………………………………………………… 11 1.2.1 Đặc điểm thực vật ……………………………………………… 11 1.2.2 Phân bố …………………………………………………………… 12 1.2.3 Ứng dụng y dược ………………………………………… 12 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu …………………………………………… 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu ………………………………………… 14 2.2.1 Phương pháp xử lý chiết mẫu ………………………………… 15 2.2.2 Khảo sát định tính cặn chiết ………………………………… 15 2.2.2.1 Phát hợp chất sterol ………………………………… 15 2.2.2.2 Phát alkaloid ………………………………………… 15 iv 2.2.2.3 Phát flavonoid ……………………………………… 16 v 2.2.2.4 Phát coumarin ………………………………………… 16 2.2.2.5 Định tính glucoside trợ tim ………………………………… 16 2.2.2.6 Định tính saponin ………………………………………… 17 2.2.2.7 Định tính tanin …………………………………………… 17 2.2.3 Phương pháp phân lập hợp chất từ mẫu ………………… 17 2.2.3.1 Phương pháp sắc ký …………………………………………… 17 2.2.3.2 Phương pháp kết tinh lại ……………………………………… 24 2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập …… 24 2.2.5 Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào …………………………… 25 2.2.5.1 Các dòng tế bào ……………………………………………… 25 2.2.5.2 Môi trường nuôi tế bào ……………………………………… 25 2.2.5.3 Phương pháp thử hoạt tính …………………………………… 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………… 29 3.1 Kết định tính nhóm chất Đẳng Hoa Ba Lá …… 29 3.2 Kết thu nhận dịch chiết từ Đẳng Hoa Ba Lá ………… 30 3.3 Phân lập tinh chế chất từ cặn chiết Đẳng Hoa Ba Lá 31 3.3.1 Quy trình phân lập hợp chất từ cặn chiết mẫu nghiên cứu ……………………………………………………………… 31 3.3.2 Các chất phân lập từ cặn n-hexan Đẳng Hoa Ba Lá …… 33 3.3.2.1 Hợp chất β-sitoterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) …………… 33 3.3.2.2 Hợp chất Oleanolic axit (2) …………………………………… 38 3.3.3 Các chất phân lập từ cặn etyl acetat Đăng Hoa Ba Lá … 45 3.3.3.1 Hợp chất Ursolic axit (3) ……………………………………… 45 3.3.3.2 Hợp chất Ursaldehyde (4) …………………………………… 50 3.4 Kết thử hoạt tính dịng tế bào ung thư …………………… 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………… 55 vi TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………… 57 vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatography (Sắc kí cột ) FC: Flash Chromatography (Sắc kí cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy ( Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy ( Phổ khối lượng) EI-MS: Electron Impact- Mass Spectroscopy ( Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron Spray Impact- Mass Spectroscopy ( Phổ khối lượng phun mù electron) UV: Ultraviolet spectrum ( Phổ tử ngoại) Proton Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt H-NMR: nhân proton) 13 C-NMR: Cacbon Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer HSQC: Heternuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heternuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: Singlet br s: Singlet tù t: Triplet d: Dublet dd: Dublet duplet dt: Dublet triplet m: Muttiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Hela: Human cervical cancer cells (Tế bào ung thư cổ tử cung người) viii HepG2: người) Human Hepatocellular carcinoma (Ung thư biểu mơ tế bào gan ix DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1 Mơ tả giai đoạn dịch chiết flavonoid kích hoạt q trình apoptosis dịng tế bào HepG2 phụ thuộc nồng độ Hình 1.2 Cây Đẳng hoa Ba ……………………………………… 11 Hình 1.3 Hoa Đẳng hoa Ba ………………………………… 11 Hình 1.4 Lá Đẳng hoa Ba …………………………………… 12 Hình 2.5 Hình ảnh mẫu Isodon ternifolius tươi 14 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học β-sterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) 34 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR ……………………………………… 35 Hình 3.8: Phổ 13C-NMR ……………………………………… 36 Hình 3.9: Phổ DEPT ………………………………………… 37 Hình 3.10 Cấu trúc oleanolic axit …………………………… 39 Hình 3.11: Phổ 1H-NMR ……………………………………… 40 Hình 3.12: Phổ 13C-NMR ……………………………………… 41 Hình 3.13: Phổ DEPT ………………………………………… 42 Hình 3.14: Phổ HSQC ………………………………………… 43 Hình 3.15: Phổ HMBC ……………………………………… 44 Hình 3.16 Cấu trúc Ursolic axit …………………………… 47 Hình 3.17: Phổ 1H-NMR ……………………………………… 48 Hình 3.18: Phổ 13C-NMR ……………………………………… 49 Hình 3.19 Cấu trúc Ursaldehyde (4) …………………………… 50 Hình 3.20 Phổ 1H-NMR ……………………………………… 51 Hình 3.21 Phổ 13C-NMR ……………………………………… 52 x Hình 3.22 Phổ DEPT ………………………………………… 53 46 vòng E bậc hai triterpene loại β bậc ba Bằng phép so sánh này, kết luận cấu hình chất tương đồng với dạng α nhiều Bảng Phổ liệu 13C-NMR hợp chất phân lập đƣợc so sánh với chất chuẩn công bố TT Chất chuẩn Ursolic axit (δ, ppm) (δ, ppm) TT Chất Ursolic axit chuẩn (δ, ppm) (δ, ppm) 38.2 39.2 16 23.8 25.0 27.0 28.2 17 48.4 48.1 78.5 78.2 18 53.9 53.6 36.5 39.6 19 38.5 39.5 56.2 55.9 20 38.4 39.4 18.0 18.8 21 30.2 31.1 32.7 33.7 22 36.3 37.4 38.4 40.1 23 28.3 28.8 46.8 48.1 24 15.3 16.5 10 38.3 37.5 25 16.1 15.7 11 22.9 23.7 26 17.0 17.5 12 126.0 125.7 27 23.3 24.0 13 139.6 139.3 28 180.3 179.7 14 41.6 42.2 29 16.9 17.5 15 27.5 28.8 30 21.1 21.4 Việc xác định cấu trúc tiếp tục làm rõ thơng qua phổ 1H-NMR hợp chất Tín hiệu doublet 2.66 ppm với J = 11.5 Hz proton vị trí C-18 C-19 dạng trans Tín hiệu xuất hợp chất cấu hình triterpene dạng α hai nhóm gắn với C-19 hydro methyl Sự tương tác 47 proton C-18 proton C-19 dẫn tới hình thành tín hiệu doublet Mặt khác, hợp chất triterpene dạng β (xảy hai proton gắn với C-19), tương tác proton C-18 C-19 dẫn tới tin hiệu quartet Tín hiệu triplet δH 5.51 ppm (J = 2.8 Hz, H-12 cho proton olefinic C-12, ghép cặp với proton C-11 Dựa liệu thu được, hợp chất xác định Ursolic axit A Cấu trúc Ursolic axit với liệu B Cấu trúc Ursolic axit với liệu phổ H-NMR phổ 13C-NMR Hình 3.16 Cấu trúc Ursolic axit (3) 48 Hình 3.17: Phổ 1H-NMR 49 Hình 3.18: Phổ 13C-NMR 50 3.3.3.2 Hợp chất Ursaldehyde (4) Rửa giải cột hệ dung môi pha đảo aceton:nước (2:1 thu chất bột vơ định hình, kết tinh lại dung môi clorofom thu chất rắn tinh thể hình kim, màu trắng, khối lượng 22,5 mg, nhiệt độ nóng chảy 262-263 0C, Rf = 0,50 (hệ dung mơi aceton:nước (4:1)) Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3),  (ppm): 3.21 (1H, dd, J = 11.0, 5.0 Hz, H-3), 5.31 (1H, t, J = 4.0 Hz, H-12), 0.99 (3H, s, H-23), 0.77 (3H, s, H-24), 0.78 (3H, s, H-25), 0.92 (3H, s, H-26), 1.09 (3H, s, H-27), 9.32 (1H, d, J = 1.0 Hz, H28), 0.87 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-29), 0.96 (3H, d, J = 2.0 Hz, H-30) Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3),  (ppm): 38.76 (C-1), 28.18 (C-2), 79.07 (C-3), 38.79 (C-4), 55.29 (C-5), 18.3 (C-6), 33.2 (C-7), 38.9 (C-8), 47.6 (C-9), 37.0 (C-10), 23.4 (C-11), 126.3 (C-12), 137.8 (C-13), 42.2 (C-14), 27.3 (C-15), 26.9 (C-16), 50.2 (C-17), 52.7 (C-18), 39.9 (C-19), 39.0 (C-20), 30.2 (C-21), 31.9 (C-22), 29.7 (C-23), 15.6 (C-24), 15.5 (C-25), 17.2 (C-26), 23.3 (C-27), 207.8 (C-28), 16.7 (C-29), 21.1 (C-30) Trên phổ 1H-NMR cho biết tín hiệu đặc trưng nhóm olefinic methine (δH 5.31) oxy methine (δH 3.21) Ở vùng trường cao cịn quan sát tín hiệu nhóm methyl, tín hiệu dạng singlet (δH 1.09, 0.99, 0.92, 0.78, 0.77) tín hiệu doublet (δH 0.96, 0.87) Trên phổ 13C-NMR, cho biết phân tử hợp chất có tổng 30 nguyên tử carbon bao gồm nhóm carbon bậc bốn, có nhóm aldehyde δC 207.4) nhóm olefinic bậc (δC 137.8 ; nhóm methine có nhóm olefinic methine (δC 126.3) nhóm oxy methine (δC 79,1); nhóm methylene nhóm methyl Kết phân tích sơ liệu phổ cho biết hợp chất teriterpenoid pentacyclic khung ursane loại với aldehyd, liên kết đôi, nhóm hydroxy 51 Phân tích liệu phổ NMR thực nghiệm 1, kết hợp với so sánh với liệu phổ tài liệu tham khảo, hợp chất xác định 3β-hydroxyurs12-en-28-al (ursolic aldehyde) Hình 3.19 Cấu trúc Ursaldehyde (4) Hình 3.20 Phổ 1H-NMR 52 Hình 3.21: Phổ 13C-NMR 53 Hình 3.22: Phổ DEPT 3.4 Kết thử hoạt tính dịng tế bào ung thƣ Các cặn chiết tổng cặn chiết phân đoạn đem thử hoạt tính, kết trình bày bảng Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính cặn chiết dòng tế bào ung thƣ Giá trị CS (%) TT Dòng tế bào Ký hiệu mẫu Hep-G2 Hela DMSO 100 100 Chứng (+) 1,34  0,8 2,66  0,9 M01 58,24  1,5 36,22  0,8 M02 48,64  1,1 40,75  1,3 M03 52,54  2,1 42,35  0,9 M04 89,24  1,3 91,44  1,7 54 Chú thích: M01 (Cặn chiết tổng); M02 (Cặn chiết phân đoạn n-hexan); M03 (Cặn chiết phân đoạn etyl acetat); M03 (Cặn chiết phân đoạn nước) Kết sàng lọc sơ hoạt tính gây độc tế bào hai dòng tế bào ung thư Hep-G2 Hela cho thấy cặn chiết M01, M02 M03 có tác dụng tốt hai dịng, dịch chiết M02 thể hoạt tính mạnh có tiềm hai dòng tế bào HepG2 Hela 48,64  1,1% 40,75  1,3% Dịch chiết M01 M03 có hoạt tính mức xem xét nghiên cứu sâu Các dịch chiết chủ yếu thể hoạt tính mạnh dịng tế bào Hela so với HepG2 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính mẫu chất dòng tế bào ung thƣ Giá trị IC50 (μM) TT Dòng tế bào Ký hiệu mẫu Hep-G2 Hela DMSO 100 100 Chứng (+) 1,34  0,8 2,66  0,9 Chất (1) 64.6 ± 0.5 53.8 ± 1.1 Chất (2) 25.5 ± 1.6 14.2 ± 0.9 Chất (3) 37.1 ± 1.2 17.0 ± 0.8 Chất (4) > 100 > 100 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất tách chiết cho thấy số hợp chất tách từ cặn chiết n-hexan etyl acetat, hợp chất Oleanolic axit (2) Ursolic axit (3) thể hoạt tính gây độc tốt hai dịng tế bào HepG2 Hela Trong Oleanolic thể độc tính cao với IC50 25.5 ± 1.6 μM HepG2 14.2 ± 0.9 μM Hela 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Qua q trình nghiên cứu hóa thực vật Đẳng Hoa Ba Lá (Isodon ternifolius), rút kết luận sau: Đã thu thập mẫu nghiên cứu Đẳng Hoa Ba Lá xác định tên khoa học Isodon ternifolius Kết phân tích định tính lồi Isodon ternifolius cho biết có lớp chất sterol, flavonoid, saponin tannin Từ dịch chiết n-hexan Đẳng Hoa Ba Lá, phương pháp sắc ký, kết hợp với phương pháp tinh chế kết tinh lại dung mơi thích hợp, hai hợp chất β-sitoterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) Oleanolic axit (2) phân lập Cấu trúc hóa học chúng xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều Từ dịch chiết etyl acetat Đẳng Hoa Ba Lá, phương pháp sắc ký, kết hợp với phương pháp tinh chế kết tinh lại dung mơi thích hợp, hai hợp chất Ursolic axit (3) Ursaldehyde (4 phân lập Cấu trúc hóa học chúng xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều Kết thử hoạt tính sinh học hai dịng tế bào Hela HepG2 cho thấy hai hợp chất Oleanolic axit (2) Ursolic axit (3) thể hoạt tính gây độc hai dịng tế bào ung thư HepG2 Hela II KIẾN NGHỊ Tiếp tục tinh chế phân đoạn lại được, phân lập xác định cấu trúc hóa học Thử nghiệm độc tính tế bào hai dòng HepG2 Hela với hợp chất phân lập 56 Cuối cùng, xin trân trọng tiếp thu thảo luận hướng nghiên cứu liên quan tới luận văn 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Thanh Hồng; 2007; Các phương pháp phổ hóa học hữu cơ; Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, s.l Nguyễn Kim Phi Phụng; 2007; Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ; NXB ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh , s.l Nguyễn Đình Triệu; 1999; Các phương pháp vật lý ứng dụng hóa học; ĐH Quốc Gia, TP Hà Nội; s.l Tiếng Anh Ahmad Sazali Hamzah, Nordin Hj.Lajis; 1998; Chemical consituents of hedyotis herbacea; ASEAN Review of Biodiversity and Environmental Conservation (ARBEC), s.l Anh P T H., Duc N B.; 2002; The situation with cancer control in Vietnam; Japanese Journal of Clinical Oncology, Vol 32, Supplement 1, P.92 – 97 Amna T., Puri S C., Verma V., Sharma J P., Khajuria R K., Musarrat J., Spiteller M., Qazi G N.; 2005; Bioreactor studies on the endophytic fungus Entrophospora infrequens for the production of an anticancer alkaloid camptothecin; Canadian Journal of Microbiology, Vol 52, P.189 – 196 Cragg G M., Newman D J.; 2009; Nature: A vital source of leads for anticancer drug development; Phytochemistry Reviews, Vol 8, Issue 2, P.313 – 331 Dai L., Li C et al.; 2015; Three new cytotoxic ent-kaurane diterpenoids from Isodon excisoides; Molecules, vol 20, pp.17544 – 17556 Dao T T., Le T V., Nguyen P H., Thuong P T., Minh P T., Woo E R., Lee K Y., Oh W K.; 2010; SIRT inhibitory diterpenoids from the 58 Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis; Planta Medica, Vol 76, Issue 10, P.1011 – 1014 10 Ding C., Wang L., Chen H., Wild C., Ye N., Ding Y., Wang T., White M A., Shen Q., Zhou J.; 2014; Ent-kaurane-based region- and stereoselective inverse electron demand hetero-Diels-Alder reactions: synthesis of dihydropyran-fused diterpenoids; Organic and Biomolecular Chemistry, Vol 12, Issue 42, P.8442 – 8452 11 E Fujita and M Node, in Progress in the chemistry of Organic Natural Products, ed W Herz, H Grisebach, G W Kirby and Ch Tamm, Springer-Verlag, Vienna, 1984, vol 46, pp 77–157 12 Feng C., Tang H et al.; 2016; Evaluation of the effects of the watersoluble total flavonoids from Isodon lophanthoides var gerardianus (Benth.) H Hara on apoptosis in HepG2 cell: Investigation of the most relevant mechanisms; Journal of Ethnopharmacology, vol 188, pp.70 – 79 13 Flora Reipublicae Popularis Sinicae Tomus, 1977, Science Press, Beijing, p 428 14 Flora Yunnanica Tomus, 1977, Science Press, Beijing, p 758 15 Giang P M., Son P T., Matsunami K., Otsuka H.; 2006; Antistaphylococcal activity of ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis; Journal of Natural Medicines, Vol 60, P.93 – 95 16 Giang P M., Jin H Z., Son P T., Lee J H., Hong Y S., Lee J J.; 2003; Ent-kaurane diterpenoids from Croton tonkinensis inhibit LPS-induced NF-kappaB activation and NO production; Journal of Natural Products, Vol 66, P.1217 – 1220 17 In The Pharmacopoecia of People’s Republic of China, 1977, People’s Health Press, Beijing, p 186 59 18 Lin Z., Guo Y., Gao Y., Wang S., Wang X., Xie Z., Niu H., Chang W., Liu L., Yuan H., Lou H.; 2015; Ent-Kaurane diterpenoids from Chinese liverworts and their antitumor activities through Michael addition as detected in situ by a fluorescence probe; Journal of Medicinal Chemistry, Vol 58, Issue 9, P.3944 – 3956 19 Liao Y J., Bai H Y., Li Z H., Zou J., Chen J W., Zheng F., Zhang J X., Mai S J., Zeng M S., Sun H D., Pu J X., Xie D.; 2014; Longikaurin A, a natural ent-kaurane, induces G2/M phase arrest via downregulation of Skp2 and apoptosis induction through ROS/JNK/c-Jun pathway in hepatocellular carcinoma cells; Cell Death and Disease, Vol 5, e1137, doi:10.1038/cddis2014.66 20 Minh P T., Ngoc P H., Quang D N., Hashimoto T., Takaoka S., Asakawa Y.; 2003; A novel ent-kaurane diterpenoid from the Croton tonkinensis GAGNEP; Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), Vol 56, P.590 – 591 21 Perez L B., Still P C., Naman C B., Ren Y., Pan L., Chai H-B., Blanco E J C., Ninh T N., Thanh B V., Swanson S M., Soejarto D D., Kinghorn A D.; 2014; Investigation of Vietnamese plants for potential anticancer agents Phytochemistry Reviews, Vol 13, No 4, P.727 – 739 22 Quan P., Gairin J et al.; 2016; Cytotoxic, apoptotic, and sensitization properties of ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep on human liver cancer HepG2 and Hep3b cell lines; Fundamental & Clinical Pharmacology, vol 30, pp.137 – 146 23 Raja, R Ramasubramania; 2012; Medicinally Potential Plants of Labiatae (Lamiaceae) Family: An Overview; Research Journal of Medicinal Plants, Vol 6, pp.203-213 60 24 Sun H., Huang S., Han Q.; 2006; Diterpenoids from Isodon species and their biological activities; Natural Product Reports, vol 23, pp.673-698 25 Wan J., Liu M., Jiang H.Y., Yang J., Du X., Li X.N., Wang W.G., Li Y., Pu J.X., Sun H D.; 2016; Bioactive ent-kaurane diterpenoids from Isodon serra; Phytochemistry; Vol 130, P.244-251 26 WHO; WHO Regional Office for Africa [Online] 2017 [Cited: 28 May 2018.] http://www.afro.who.int/health-topics/cancer 27 Wu H., Wang W et al; 2015; Six new cytotoxic and anti-inflammatory 11,20-epoxy-ent-kaurane diterpenoids from Isodon wikstroemioides; Chinese Journal of Natural Medicines, vol 13, pp.383 – 389 28 Y Takeda and H Otsuka, Stud Nat Prod Chem., 1995, 15, 111 29 Yang L., Li L et al.; 2011; Anti-hepatitis B virus and cytotoxic diterpenoids from Isodon lophanthoides var gerardianus; Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol 59, pp.1102-1105 30 Yang J., Wang W.G., Wu H.Y., Du X., Li X.N., Li Y., Pu J.P., Sun H.D.; 2016; Bioactive Enmein-Type ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon phyllostachys; Journal of Natural Products, Vol 79, Issue 1, P.132-140