khảo sát sự kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột thường gặp trong bệnh viện sinh esbl

HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Yến Chi KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC VI KHUẨN GRAM ÂM ĐƯỜNG RUỘT THƯỜNG GẶP TRONG BỆNH VIỆN SINH ESBL LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Yến Chi

KHẢO SÁT

SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC VI KHUẨN GRAM ÂM ĐƯỜNG RUỘT THƯỜNG GẶP TRONG BỆNH VIỆN

SINH ESBL

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Yến Chi

KHẢO SÁT

SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC VI KHUẨN GRAM ÂM ĐƯỜNG RUỘT THƯỜNG GẶP TRONG BỆNH VIỆN

SINH ESBL

Chuyên ngành: Vi Sinh học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS – TS CAO MINH NGA

`

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Minh Nga trong suốt quá trình làm luận văn này

Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cám ơn Ban chủ nhiệm Bộ môn, các cán

bộ phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tích cực cho tôi trong việc thực nghiệm đề tài

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

Bảng 3 5 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh của E coli sinh ESBL với một số tác giả

3

Bảng 3 6 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella spp sinh ESBL với một số

3

Bảng 3.7 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm đường ruột thường

3

Bảng 3 8 Tỉ lệ kháng kháng sinh của từng loài vi khuẩn Gram âm đường ruột

3

Bảng 3.9 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh của E coli không sinh ESBL với các tác

3

Bảng 3.10 Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli sinh ESBL và không sinh

Bảng 3 11 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Klebsiella spp với các tác

3

Bảng 3.12 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Klebsiella spp sinh ESBL

Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ kháng kháng sinh nhóm β - lactam của các vi khuẩn Gram âm

3

Biểu đồ 3.4 Tỉ lệ kháng kháng sinh khác của các vi khuẩn Gram âm đường ruột

Biểu đồ 3.9 Tỉ lệ kháng kháng sinh nhóm β – lactam của các vi khuẩn Gram âm

3

Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ kháng kháng sinh nhóm β – lactam của vi khuẩn Gram âm

Biểu đồ 3.11 Tỉ lệ kháng kháng sinh khác của vi khuẩn Gram âm đường ruột

3

Biểu đồ 3.12 Tỉ lệ kháng kháng sinh khác của vi khuẩn Gram âm đường ruột

Biểu đồ 3.15 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh nhóm β – lactam của vi khuẩn E coli

3

Biểu đồ 3.16 So sánh tỉ lệ kháng các kháng sinh khác của vi khuẩn E coli sinh

3

Biểu đồ 3.17 Tỉ kệ kháng kháng sinh nhóm β – lactam của vi khuẩn Klebsiella spp

3

3

Biểu đồ 3.19 So sánh tỉ lệ kháng các kháng sinh nhóm β – lactam của vi khuẩn

Klebsiella spp Sinh ESBL và không sinh ESBLU 70

3

Biểu đồ 3.20 So sánh tỉ lệ kháng các kháng sinh khác của vi khuẩn Klebsiella spp

MỞ ĐẦU

“ Kháng sinh – kho vũ khí thần kì chống lại nhiễm khuẩn” Ở những năm

đầu thế kỉ trước (thế kỉ 19 – 20) thì tuổi thọ bình quân của con người rất thấp Ngay

cả ở những nước tiên tiến nhất thì tuổi thọ trung bình của con người cũng chỉ 40 Có những trận dịch hầu như xóa sổ cả một vùng dân cư Các vết thương dù nhẹ cũng bị nhiễm trùng máu vô phương cứu chữa Cho đến những năm 1920, Alexander

Penicilium potatum, một chất kháng sinh đầu tiên mở ra kỷ nguyên sử dụng chất kháng sinh trong y học Sau đó Howard Walter Florey và Ernst Boris Chain là những nhà khoa học đầu tiên thành công trong việc tinh chế penicillin trong phòng

penicillin và tác động chữa bệnh của nó đối với các bệnh nhiễm khuẩn" Từ đó trở

công xưởng đã giúp con người có một vũ khí thần kì chống lại các bệnh nhiễm

Alexander Fleming (1881 – 1955)

“Chúng ta đang chết dần chết mòn vì kháng sinh!” Thật vậy, lượng

ngày càng tăng của vi khuẩn Đặc biệt, tại các nước đang phát triển, các chủng vi khuẩn kháng thuốc xuất hiện ngày càng nhiều Sự phát triển khả năng kháng thuốc

ở vi khuẩn là một quá trình tự nhiên sớm muộn gì cũng xảy ra Tuy nhiên, chính con người đã làm cho tốc độ của quá trình đó diễn ra nhanh hơn chính do sự lạm dụng thuốc một cách bừa bãi của mình Tại Việt Nam, tình hình này dường như nghiêm trọng hơn Bị hắt hơi, sổ mũi, ho, người bệnh đều có thể dễ dàng mua thuốc ở các tiệm thuốc kể cả các thuốc kháng sinh mà không cần đơn thuốc của bác

sĩ Tình trạng người dân tự “kê” đơn thuốc cho mình và người thân khá phổ biến ở Việt Nam Ngay cả bác sĩ cũng kê đơn sai, nắm bắt tâm lý mong muốn khỏi bệnh nhanh của người bệnh, các bác sĩ, nhất là ở những phòng khám tư, đã kê các kháng sinh liều cao, đắt tiền Bệnh sẽ khỏi nhanh nhưng nếu sử dụng một cách bừa bãi thì

sẽ làm gia tăng tốc độ kháng thuốc Điều đó cũng thật dễ hiểu vì sao tổ chức Y tế Thế giới đã xếp Việt Nam vào những nước có tỉ lệ kháng thuốc kháng sinh cao nhất thế giới

Trong các vi khuẩn kháng thuốc hiện nay, đáng lưu ý nhất là các vi khuẩn họ

đường ruột Phổ biến nhất là Klebsiella pneumoniae và E coli với sự gia tăng đề

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự đề kháng kháng sinh nhóm Cephalosporins là

do vi khuẩn sinh ra enzim β – lactamase Đặc biệt, việc sinh enzim β – lactamase phổ rộng (Extended – Spectrum - β – lactamase : ESBL) là một cơ chế quan trọng trong việc giúp vi khuẩn chống lại các Penicilin, Cephalosporin thế hệ 3, 4 và

kháng sinh phổ rộng đủ mạnh, bao phủ phần lớn các tác nhân gây bệnh Sau khi có kết quả kháng sinh đồ sẽ điều chỉnh lại cho phù hợp, đảm bảo tính hiệu quả, ít tốn kém và giảm sự phơi nhiễm của các kháng sinh

Hiện nay, tại bệnh viện 175 vẫn chưa có một nghiên cứu nào thật đầy đủ về

sự kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, từ đó đưa ra phác đồ điều trị kháng sinh thích hợp, giúp kiểm soát và làm giảm tỉ lệ kháng thuốc của các vi khuẩn này Đặc biệc là các vi khuẩn sinh ESBL

Vì thế , đề tài “Khảo sát sự kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm

đường ruột thường gặp trong bệnh viện sinh ESBL “ được nghiên cứu với mục

tiêu:

bệnh viện 175

C hương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn

1.1.1 Vi khuẩn

Vi khuẩn (Bacteria) theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là cái gậy Được hiểu theo nghĩa rộng bao gồm các vi sinh vật thuộc ngành Bacteria Theo nghĩa hẹp thì không

Vi khuẩn là nhóm các sinh vật đơn bào, kích thước nhỏ, cấu tạo tế bào nhân

sơ (Procaryote), có hình cầu (cầu khuẩn), hình que (trực khuẩn), hình xoắn (xoắn

1.1.2 Trực khuẩn Gram âm

khuẩn đường ruột) có hình que, dài khoảng 1-5µm, thường có flagella, không sinh

bào tử, oxidase âm tính Hầu hết các loài trong Enterobacteriaceae có peritrichous

Trong số các loài trực khuẩn Gram âm gây bệnh ở người thì phổ biến nhất là

Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacteria spp., Proteus spp

thường Trong môi trường lỏng có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường, có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở đáy ống; cũng có thể tạo váng trên bề mặt Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc:

+ Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng

+ Dạng R: Mặt khô, xù xì, thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng

+ Dạng M: Khuẩn lạc nhày Kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S, các khuẩn lạc thường có xu hướng hòa vào nhau Hình thức phát triển này thường gặp ở những

vi khuẩn có khả năng tạo thành vỏ

xác định nhất là glucose và lactose Nếu vi khuẩn không lên men đường glucose thì không thuộc họ vi khuẩn đường ruột

là: oxidase, urease, tryptophanease (sinh indole) Trong đó nếu oxidase dương tính thì không thuộc họ vi khuẩn đường ruột

chất dẫn có lưu huỳnh

tối thiểu, trong đó, khả năng sử dụng citrate là nguồn cung cấp carbon duy nhất có trong môi trường Simmon thường được thử nghiệm nhất

Bảng 1.1 Tính chất sinh hóa của một số loại vi khuẩn đường ruột

kháng nguyên của thành tế bào Thành phần gồm: lipopolysaccarie (LPS), lipoprotein và peptidoglycan LPS là kháng nguyên vách chủ yếu của vi khuẩn

IgM R [45]

chủ yếu của kháng nguyên H là IgG Yếu tố quyết định trong kháng nguyên H là

kháng nguyên thân Bản chất hóa học là protein hoặc polisaccharide Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được dưới kính hiển vi quang học thông thường (như

ở Klebsiella) hoặc một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện

* UKháng nguyênU: Có các loại kháng nguyên: kháng nguyên O, kháng nguyên

K, kháng nguyên H

chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 80%) và sống nhiều nhất trong ruột già, nó đứng hàng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, nhiễm

khuẩn huyết E coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não,

nhiễm khuẩn vết thương

thường và một số chủng sinh enzim β-lactamase phổ rộng (ESBL)

1.1.2.2 Klebsiella

Thuộc họ Enterobacteriaceae, Chi Klebsiella Gồm các loài : Klebsiella

pneumoniae, Klebsiella gramanulomatis, Klebsiella ozaenae, Klebsilla rhinoscleromatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ornitholytica, Klebsiella planticola, Klebsiella terrigena

Trong số các loài của chi Klebsiella thì Klebsiella pneumoniae có tầm quan

trọng nhất và được chọn làm đại diện điển hình của chi này

đầu tiên vào thế kỉ 19 bởi nhà vi sinh vật học người Đức - Edwin Klebs Chúng có hình que, kích thước trung bình 0,3 – 1 x 0,6 – 6 µ, không có lông nên thường không di động, có vỏ dày, kích thước có thể gấp 2 – 3 lần tế bào vi khuẩn Vỏ của

Klebsiella có bản chất là polysaccharide được cấu tạo bởi nhiều loại monosaccharide như: L – fructose, L – rhamnose, D – mannose, D – glucose, D –

âm, Citrat dương, chuyển hóa nitrat thành nitrit, PAD âm

* UKháng nguyên URU [18] U: Các loài thuộc giống Klebsiella chỉ cớ 2 loại kháng nguyên đó là kháng nguyên O và kháng nguyên K

cơ hội ở cộng đồng hoặc trong bệnh viện – là một trong những nguyên nhân gây

nhiễm trùng bệnh viện thường gặp Trong đó, Klebsiella pneumoniae và Klebsiella

oxytoca là hai giống thường gặp nhất trong các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện

thường gặp ở trẻ sơ sinh; tỷ lệ tử vong rất cao nếu không được điều trị sớm Ngoài

ra nó còn có khả năng gây nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm nhiễm khuẩn đường tiết niệu, áp xe gan, Thời gian nằm viện kéo dài,

sử dụng kháng sinh phổ rộng và điều trị tại các khoa săn sóc đặc biệt là các yếu tố

Klebsiella kháng cao với ngoại cảnh và kháng sinh Hiện nay Klebsiella spp Là

một trong những nguyên nhân quan trọng trong nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải trong cộng đồng vì tính đa kháng thuốc do tiết enzim ESBL

1.1.2.3 Enterobacter

các loài : Enterobacter cloacae, E aerogenes, E agglomerans, E gergoviae, E

sakazakii, E cowanii, E hormaechei, E taylorae, E asburiae, E intermedius, E amnigenus, E dissolvens, E kobei, E pyrinus, E nimipressuralis

xung quanh thân và có khả năng di động Có thể có vỏ nhưng kích thức mỏng hơn

o

P

C

môi trường E cloacae và E aerogenes có thể là thành viên trong hệ vi khuẩn bình thường ở ruột người và động vật Một số loài Enterobacter có thể gây nhiễm trùng

bệnh viện, trong đó thường gặp nhất là E cloacae, tiếp theo sau là E aerogenes, E

sakazakii, E hormaechei thường gây nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh

1.1.2.4 Proteus

loài Proteus vulgaris, P mirabillis, P morganii, P rettgeri

di động

lactose Có khả năng khử amin đối với phenylalamine và tryptophan (PAD dương),

kháng nguyên H

phân lập được từ phân của nhiều loài động vật và từ phân của người bình thường Chúng là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, chủ yếu là gây nhiễm trùng bệnh viện Trong các nhiễm khuẩn do chúng gây ra, nhiễm trùng đường tiết niệu chiếm tỷ lệ cao nhất Ngoài ra chúng có thể gây viêm tai giữa, nhiễm khuẩn huyết, viêm mủ vết thương

1.2 Các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

Các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam là một trong những nhóm kháng sinh quan trọng nhất cả về mặt lịch sử lẫn y học Nhóm kháng sinh này bao gồm các chất chứa vòng β-lactam (vòng amid 4 cạnh) và có cấu trúc nhân cơ bản như trong bảng 1.2 R [11] [14]

Bảng 1.2 Các nhân cơ bản của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

Tên nhân Cấu trúc hóa

học chung Kháng sinh đại diện

và bán tổng hợp

Ampicillin Amoxcillin Penicillin V

Nhân Clavam

Các penicillin kháng

Các penicillin kháng β-lactamase

Sulbactam, tazobactam

cephamycin

Cefadroxil Cefaclor Cephalexin Cefixim Ceftibulen Nhân

1.2.1 Phân loại các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

gồm Penicillin, Cephalosporin, Carbapenem, Monobactam

1.2.1.1 Penicillin

Các penicillin có cấu tạo gồm 2 vòng β-lactam nối với vòng thiazolidin chỉ

khác nhau ở gốc R của mạch ngang

* Các penicillin kháng β-lactamase: Điển hình là Acid clavulanic - một

kháng sinh phổ rộng có hoạt tính kháng β-lactamase, tác dụng lên nhiều loại vi khuẩn cả Gram dương và Gram âm, đặc biệt có tác dụng ức chế mạnh β-lactamase truyền qua plasmid gây kháng penicillin và cephalosporin Do đó, acid calvulanic thường được sử dụng kết hợp với các loại kháng sinh khác để tăng hiệu quả trong việc chống lại các vi khuẩn sinh β-lactamase mạnh Đặc biệt là chống lại các vi khuẩn kháng penicillin và cephalosporin

Sulbactam và tazobactam tương tự cũng là những chất kháng sinh được dùng kết hợp với các kháng sinh khác trong việc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc

R [4][18][14]

1.2.1.2 Cephalosporin

Các Cephalosporin là nhóm thuốc quan trọng nhất trong các thuốc kháng sinh hiện nay Nhóm này đứng thứ 7 trong số 10 loại thuốc được sử dụng nhiều nhất

Cấu trúc của các cephalosporin và cephamycin có cấu trúc gồm vòng lactam liên kết với dị vòng dihyrothiazin (nhân cephem) Các cephamycin khác với

1.2.1.3 Carbapenem

Carbapenem là loại kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam có hoạt động kháng khuẩn rộng đặc biệt chống lại hầu hết các β-lactamase Carbapenem được

phát triển từ Thienamycin được phát hiện ở Streptomyces cattleya vào năm 1976

Do đó, carbapenem được coi là kháng sinh cuối cùng trong các loại thuốc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc

Carbepenem có cấu trúc gần giống penicilline nhưng thay thế carbon cho

1.2.1.4 Monobactam

Monobactam cũng là chất kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam mà không

dihydrothiazine của cephalosporin Monobactam chỉ có tác dụng với các loại vi

khuẩn Gram âm Được dùng rộng rãi hiện nay với tên aztreonam (Azactam)

1.2.2 C ơ chế tác dụng

bào của vi khuẩn Khác với tế bào nhân thực, tế bào vi khuẩn có áp suất thẩm thấu bên trong tế bào cao hơn nên chúng có thành bao bọc bên ngoài tế bào Thành tế

polysaccharide thẳng dọc và những đoạn ngang penta – peptide Polysaccharide gồm nhiều phân tử đường chứa gốc amin: N- acetyl – glucosamine và N – acetyl –

đó ức chế sự phát triển của vi khuẩn Đầu tiên β-lactam bám vào các thụ thể PBPs (Penicillin biding proteins ) Có khoảng 3 đến 6 PBPs, một trong số đó là các enzim

trình transpeptidation bị ức chế và ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một

một cách chính xác thì tế bào vi khuẩn đang sinh trưởng sẽ có một thành tế bào yếu

ớt, kém đề kháng với áp suất thẩm thấu Màng tế bào bị phồng ra ở các phần bị yếu

quan tới việc hoạt hóa các enzim tự tiêu (autolytic enzims) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương những tế bào bị biến đổi thành protoblast hay spheroblast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên rất

Không có beta lactam

Có beta lactam

Hình 1.1 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm β - lactam

Tuy nhiên, các loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam chỉ ngăn cản vi khuẩn tăng số lượng nguyên liệu thành tế bào song không có tác dụng lên phần peptidoglycan có sẵn, nên chúng chỉ tác động lên các tế bào đang sinh trưởng hoặc sinh sản; các tế bào nghỉ không bị ảnh hưởng Dĩ nhiên chúng không ảnh hưởng lên

tế bào động vật và thực vật vì các loại tế bào này không mang thành tế bào chứa

Đôi khi, sự đề kháng với kháng sinh này lại gây ra đề kháng cho kháng sinh khác, gọi là đề kháng chéo Vi khuẩn được gọi là đa đề kháng (multiresistant) sau khi có tích lũy đề kháng tự nhiên và mắc phải, chúng chỉ nhạy cảm với rất ít kháng

sinh và đề kháng với rất nhiều kháng sinh hoặc nhiều nhóm kháng sinh [46] [92] Ví dụ : Mối liên hệ như vậy thường gặp ở những kháng sinh có thành phần hóa học gần giống nhau (Như Polymyxin B- Colistin, Erythromycin – Oleandomycin, ) những cũng có thể thấy giữa những thuốc không có liên hệ hóa học (Erthromycin –

Có nhiều yếu tố tham gia vào sự đề kháng của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh Có thể kể đến là các nguyên nhân như: Lạm dụng kháng sinh, gia tăng mức độ nặng của nhiễm trùng bệnh viện, thiếu tính nhất quán trong điều trị, thời gian dùng kháng sinh quá ngắn hoặc liều lượng thấp hơn liều điều trị, chẩn đoán nhiễm trùng

1.3.2 Bản Chất di truyền và phương thức truyền tải gen

1.3.2.1 Kháng tự nhiên

Các gene đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn Đề kháng tự nhiên là đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài, và được biết ngay từ lúc đầu khi nghiên cứu xác định hoạt tính của kháng sinh và xác định phổ tác dụng của thuốc

1.3.2.2 Kháng mắc phải

mới Việc xuất hiện các đột biến có tần suất thay đổi theo vi khuẩn và theo kháng

vi khuẩn và phối hợp với một sự đề kháng nội tại dẫn đến đa đề kháng VD: Sự đề

kháng của Staphylococci với methycillin là do vi khuẩn nhận một ADN có gen mec

thế cho các PBP tự nhiên và có chức năng như một transpeptidase đề kháng với các β-lactam bao gồm cả các cephalothin, carbapenem và nomobactam

- Do transposon [2][11]: Các plasmid đề kháng có thể tiến triển in vitro do tiếp

thu hay mất đi lần lượt những đặc tính đề kháng, hệ quả của tính chất chuyển giao được của phần lớn các gen Các transposon là hệ quả của ADN có thể đổi chỗ các replicon lẫn nhau (chuyển vị nội phân tử) hay tại một nơi của cùng một replicon (chuyển vị ngoại phân tử), mặc dù không có sự tương đồng giữa các ADN mà

chúng tác dụng Tuy nhiên, đôi khi có những vùng gián tiếp riêng

1.3.3 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

tương tự, biến nó thành dạng không hoạt động Người ta đã xác định được trên 200 loại lactamase khác nhau Các gen quy định chúng thường nằm trên plasmid R

[2][4][11] [50]

Hình 1.2 : Hoạt động phân giải penicillin của penicillinase [50]

nhập của thuốc vào tế bào Cơ chế này thường có liên quan đến những sự thay đổi trong cấu trúc hoặc điện tích của các protein màng tế bào chất tạo nên các kênh hay các lỗ Các protein này nằm trong màng ngoài của vi khuẩn Gram âm gọi là các porin.Các protein porin bị thay đổi bắt nguồn từ những thay đổi trong các gen nhiễm sắc thể Ví dụ: tính đề kháng chống lại tetracillin và penicillin

không thể gắn vào hoặc liên kết một cách hiệu quả tới đích của nó Dạng đề kháng này thường gặp trong trường hợp chống lại các chất kháng trao đổi chất (như

Hình 1.3 : Cơ chế làm thay đổi thụ thể đối với thuốc [50]

hoặc chúng có thể từ bỏ toàn bộ các bước trao đổi chất mẫn cảm Chẳng hạn, một tế bào có thể trở thành đề kháng với một loại thuốc nhờ sinh ra nhiều phân tử enizim hơn đối với con đường trao đổi chất bị tác động Một cách khác, các tế bào trở nên

đề kháng với các sunfonamit bằng cách từ bỏ sự tổng hợp axid folic, thay vào đó

Hình 1.4 : Cơ chế thay thế con đường trao đổi chất [50]

Hình 1.5 : Cơ chế bơm thuốc ra khỏi tế bào [50]

Các cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh có thể tóm tắt ở bảng 1.6

Bảng 1.3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn [2][4][11][50]

Cơ chế đề kháng Kháng sinh ví

dụ

Cơ sở di

Pseudomonas aeruginosa

Norfloxacin

Nhiễm sắc thể

Staphylococcus aureus

Enteric bacteria Enteric bacteria Enteric bacteria

Staphylococcus aureus

Thay đổi hóa học

Erythromycin

Plasmid Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể

Enteric bacteria

Staphylococcus aureus Bacillus subtilis

Staphylococcus spp

1 4 Tổng quan về ESBL

1.4.1 Sơ lược về β-lactamase

β-lactamase là loại enzim do vi khuẩn tiết ra có thể thủy phân các liên kết amid của β-lactam gây mở vòng β-lactam và làm mất tác dụng diệt khuẩn của

kháng sinh họ β-lactam [4] β-lactamase được sinh tổng hợp có thể do gen nằm trên nhiễm sắc thể hay plamid quy định Trong một số chủng vi khuẩn có thể tồn tại cả 2

cơ chế này

β-lactamase của vi khuẩn Gram dương (đại diện là tụ cầu) là đại diện cho phần lớn các men nhóm A có được do cảm ứng được hình thành ở màng tế bào cũng như được tiết ra ngoại bào

β-lactamase của vi khuẩn Gram âm phức tạp hơn Hầu hết các vi khuẩn đường ruột có chưa các enzim chủ yếu trên nhiễm sắc thể, được tạo ra ở mức độ thấp và tùy theo loài Sự cảm ứng của các enzim nhóm C trên nhiễm sắc thể này là cephalosporinase kháng lại các cephalosporin thế hệ 3 và các cephapenem Sự xuất hiện của các β-lactamase nhóm A do cảm ứng có vai trò giống như penicillinase hoặc cephalosoprinase Các enzim do pladmid quy định như TEM 1 – SHV 1 dễ dàng lan truyền giữa các loài với nhau Sự gia tăng tổng hợp các enzim do nhiễm sắc thể và plasmid quy định làm gia tăng khả năng kháng lại các kháng sinh imipenem hoặc cephalosporin thế hệ 3 Ngoài ra, các β-lactamase phổ rộng làm bất hoạt nhiều cephalosporin thế hệ 3 mặc dù carbapenem kháng tương đối với với các

Việc phân loại β-lactamase có rất nhiều ý kiến của nhiều tác giả khác nhau

như sau:

Bảng 1.4 Xếp loại β-lactamase theo chức năng [4]

Nhóm Loại enzim Ức chế bởi

Clavulanate

lớp phân

Burkholderia (Pseudomonas) cepacia

thể của Klebsiella spp., Proteus vulgaris, Citrobacter koserii và Bacteriodes spp

Một số enzim penicillinase và các ESBL được mã hóa từ các gen nằm trên plasmid,

được sản xuất bởi vi khuẩn làm cho chúng kháng với cephalosporin như cefuroxim,

trong đó các typ chủ yếu là TEM, SHV, CTX- M và VEB Các gen đa kháng thuốc này được truyền chủ yếu qua plasmid, transposons và intergrons Các gen này có thể truyền ngay giữa các họ vi khuẩn Gram âm dẫn đến sự lan truyền nhanh chóng

Tazolactam Những AmpC - β-lactamase qua trung gian plasmid được phát hiện ở

Klebsiella spp., Samonella spp., C freundii, E aerogenes, P mirabilis, E coli

thuộc các họ CMY, FOX và DHA Tuy nhiên, các vi khuẩn nay vẫn còn nhạy cảm

β-lactam ở các mức độ khác nhau Do đó, chúng kháng tất cả các loại kháng sinh và

ADTA và các chất như 1,10 – o – phenanthroline Chúng không bị ức chế bởi các chất ức chế β-lactamase có trên thị trường Đặc biệt, hiện nay mới xuất hiện typ

thì sau đó, tháng 8 năm 2010 các nhà khoa học người Anh đã phát hiện thêm nhiều

trên nhiều plasmid khác nhau và có thể nhảy dễ dàng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn

E coli [36] Sau đó, TEM – 1 xuất hiện trên toàn thế giới và hiện nay đã tìm thấy ở

nhiều chủng kháng nhau thuộc họ Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa,

Haemophilus influenzae, và Neisseria gonorrhoeae [79] Khoảng 20 năm sau, nhiều kháng sinh β-lactama được phát triển với mục đích chống lại hoạt động thủy phân của β-lactamase Tuy nhiên, một thế hệ kháng sinh mới được sử dụng trong điều trị thì một β-lactamase mới lại xuất hiện, gây ra sự kháng thuốc Kháng sinh β-lactama phổ rộng (như cephalosporin) cũng không ngoại lệ Enzim đầu tiên có khả năng này

tăng phổ tác động, nhất là chống lại các cephalosporins, nhất là các cephalosporins thế hệ 3 nên enzim này được gọi là β-lactamase phổ rộng ( extended – spectrum β-

1.4.2.2 Nguồn gốc của ESBLs

ESBLs có nguồn gốc từ đột biến của β-lactamase do cephalosporins thế hệ 3 cảm ứng tạo thành Những đột biến này do sự thay đổi ở một nhóm khoảng từ 1 đến

7 acid amin nằm gần trung tâm hoạt động của enzim Những thay đổi trên đã tạo ra trung tâm hoạt động của enzim linh hoạt hơn, tiến hóa hơn Vì thế tăng ái lực và tăng hoạt động thủy phân đối với cephalosporins thế hệ 3 ( như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone, ) và monobactams (aztreonam)

1.4.2.3 Phân loại

hơn 90 loại enzim loại TEM và 25 enzim loại SHV TEM và SHV thường được tìm

thấy ở E coli và K pneumoniae, tuy nhiên, chúng cũng có thể được tìm thấy ở

Proteus spp., Providencia spp., và các chủng vi khuẩn khác thuộc họ

Enterobacteriaceae [79]

Ở Kluyvera spp hầu hết hay tất cr các

phân lớp đều xuất phát từ nhiễm sắc thể, rồi được chuyển động nhờ các chuyển động chèn

Trên 40, trong 5 phân lớp

OXA – 11, 14,

15, 16, 17 (D)

Đột biến OXA – 10 (=PSE – 2), được biết từ lâu là penicillinase có nguồn ngốc không rõ

> 5

này cũng gây ra sự đề kháng đối với ampicillin và penicillin của chủng H

influenzae và N gonorrhorae TEM – 1 có khả năng thủy phân penicillin và các cephalosporins thế hệ 1 như cephalothin và cephaloridine TEM – 2 là dẫn xuất đầu tiên của TEM – 1, có sự thay thế 1 acid amin so với β-lactamase nguyên thủy TEM

thường tìm thấy nhất ở chủng E coli và K pneumoniae, nhưng chúng cũng được

tìm thấy ở những chủng vi khuẩn Gram âm khác, và tần số này ngày càng gia tăng ESBL loại TEM đã được báo cáo xuất hiện ở các vi khuẩn đường ruột như

Enterobacter aerogenes, [58] Morganella morganii, [80] [95] Proteus mirabillis , [28] [77]Proteus rettgeri, Salmonella spp [66] Hơn nữa, chúng còn được tìm thấy ở những vi khuẩn Gram âm không thuộc họ đường ruột Cụ thể là TEM – 2 được tìm thấy ở

ochracea [88]

như TEM – 1, SHV – 1 chỉ có vài dẫn xuất Phần lớn các SHV khác nhau mang kiểu hình ESBL được đặc trưng bởi sự thay đổi acid amin tại vị trí 238, thay serine bằng glycine Một số biến thể liên quan tới SHV-5 cũng có một thay thế lysine bởi glutamate ở vị trí 240 Điều thú vị là cả hai Gly238Ser và acid amin Glu240Lys cũng có thể tìm thấy trong các loại TEM - ESBLs Các dư lượng serine ở vị trí 238

phần lớn các SHV có kiểu hình của ESBL Tuy nhiên, duy nhất SHV – 10, được báo cáo là có kiểu hình đề kháng - ức chế Enzim này có nguồn gốc từ SHV – 5 và

chủng K pneumoniae Tuy nhiên, enzim này cũng được tìm thấy ở Citrobacter

diversus, E coli, P aeruginosa [30] [38] [71] [87]

* CTX – M:

Đây là loại enzim qua trung gian plasmid và có khả năng phân giải mạnh

cũng được mô tả ở những chủng khác của họ Enterobacteriaceae Một nghiên cứu

Bảng 1.6 Các type ESBLs CTX-M β-Lactamase Quốc gia đầu tiên

tìm thấy Loài vi khuẩn

Sự mở rộng hoạt tính của CTX – M ESBL đề kháng với cephalosporin phổ rộng không liên quan đến việc thay đổi một vài acid amin như TEM hay SHV Mà

là do phần còn lại của serine ở vị trí 237, hiện diện ở tất cả các CTX – M Năm

2006 phát hiện CTX – M – 15 phổ biến ở chủng E coli ở Anh và lan rộng khắp thế

oxacillin Đây là enzim khác với TEM và SHV về cấu trúc phân tử (thuộc lớp D) và

khi hầu hết các ESBL được tìm thấy ở E coli, K pneumoniae và các vi khuẩn khác

thuộc họ Enterobacteriaceae, thì OXA được tìm thấy chủ yếu ở P aeruginosa

[34 ] Các loại OXA được thể hiện ở bảng dưới :

Bảng 1.7 Các type ESBL- OXA β-Lactamase Nguồn gốc Quốc gia xuất

hiện đầu tiên Loài vi khuẩn

hoặc SHV và những enzim khác chia thành một lớp ESBL mới thì có vài loại ESBL không có mối liên hệ với bất kì loại nào trong số các enzim được tìm thấy

Loài vi khuẩn

BES-1

Yersinia enterocolitica

CTX, CAZ,

GES-1 Penicillinase

Phân lập từ dòng tham chiếu

Chryseobacterium meningosepticum

[89]

fonticola CTX Nhật Bản E cloacae [60]

P

a

P

CTX: cefotaxime; CAZ: ceftazidime; ATM: aztreonam

1.4.2.4 Phương pháp phát hiện ESBL

* Xét nghiệm sàng lọc: Chọn lựa cephalosporin(s) chỉ điểm Mục đích là

khảo sát sự đề kháng hay giảm nhạy cảm trong những xét nghiệm sàng lọc với

nếu càng sử dụng nhiều cephalosporin thì càng có nhiều cơ hội phát hiện những kiểu kháng thuốc ít gặp Các kháng sinh được khuyên dùng để thử nghiệm các

chủng thuộc họ Enterobacteriaceae là cefpdoxime, ceftazidime, aztreonam,

cefotaxim và ceftriaxone Nếu đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn hoặc bằng điểm gãy (BP: Breakpoint) của một trong những kháng sinh ở trên thì có thể chỉ điểm chủng vi khuẩn sinh ESBL Khi đó, sẽ làm tiếp bước 2

* Xét nghiệm xác định: Xét nghiệm xác định ESBLs dựa vào tìm kiếm sự

cộng hưởng giữa oxymino – cephalosporin và clavulanate Nhờ đó phân biệt các chủng ESBLs (cộng hưởng dương) khỏi các chủng kháng thuốc vì nhiều lý do khác (cộng hưởng âm); vì clavulanate có tác dụng ức chế ESBLs Nhiều phương pháp phát hiện ESBLs được đề nghị dựa trên nguyên tắc đĩa khuyếch tác của Kirby – Bauer Hiện nay, các phương pháp cộng hưởng đang được sử dụng rộng rãi là: Phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp E – test

mức độ đề kháng của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh

khuẩn được cấy trên đĩa thạch Mueller – Hinton Đặt đĩa cephalosporin (30µg) với đĩa amoxicillin – clavulanate (20µg) cách nhau 20 – 25mm trên mặt thạch Trước đây, khoảng cách yêu cầu là 30mm, nhưng hiện nay, khoảng cách được giảm xuống

để tăng độ nhảy cảm của phương pháp Có cộng hưởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện Nhưng khuyết điểm là có thể bỏ sót một số chủng vi khuẩn có ESBL

Hình 1.6 Phương pháp đĩa đôi phát hiện ESBLs

- Phương pháp đĩa kết hợp [39] [4]: Phương pháp này được Jacoby và Hans mô

tả lần đầu tiên vào năm 1999 Bằng cách sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế hệ 3 và cephalosporins thế hệ 3 tương ứng phối hợp với

cephalosporins có phối hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm Các loại đĩa kháng sinh được sử dụng là cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg); ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg); cefpodoxime (10 µg)/ cefpodoxime (10/10 µg)

Hình 1.7 Phương pháp đĩa kết hợp phát hiện ESBLs

Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu mới phương pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên cả hau hệ thống là : cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid

pháp này dễ thực hiện và ít tốn kém nhưng yêu cầu phòng thí nghiệm phải có đĩa

trường hợp cho kết quả dương tính giả do một số vi khuẩn sinh AmpC cũng xuất hiện sự gia tăng đường kính vòng vô khuẩn khi có clavulanic acid

đầu là dãy chứa nồng độ của cephalosporin và đầu đối diện là dãy nồng độ của cephalosporin / clavulanic acid Khi đầu chứa clavulanic acid cho MIC giảm ≥ 8 lần

so với đầu còn lại thì suy ra được rằng vi khuẩn có sinh ESBL Phương pháp này cho kết quả chính xác nhưng giá thành khá cao