Tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin phân lập từ ruột cá (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN PHÂN LẬP TỪ RUỘT CÁ Hà Nội, 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN PHÂN LẬP TỪ RUỘT CÁ Sinh viên thực : DƯƠNG VĂN HỒN Lớp : K62CNSHA Ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : PGS TS NGUYỄN XUÂN CẢNH TS PHẠM HỒNG HIỂN Hà Nội, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khố luận cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam TS Phạm Hồng Hiển Các số liệu kết nêu khoá luận trung thực chưa cơng bố nghiên cứu khác Các tài liệu trích dẫn khoá luận nêu danh mục tài liệu tham khảo Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu khoá luận Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2021 Sinh viên Dương Văn Hồn i LỜI CẢM ƠN Tơi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện, thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành khố luận Với tình cảm chân thành lịng biết ơn sâu sắc tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh TS Phạm Hồng Hiển quan tâm, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi q trình nghiên cứu hồn thành khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Giang, ThS Trần Thị Đào, ThS Trần Thị Hồng Hạnh, ThS Nguyễn Thanh Huyền chị Nguyễn Thị Thu giúp đỡ tơi q trình thực nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2021 Sinh viên Dương Văn Hoàn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN… ii MỤC LỤC…… iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT…… ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Đối tượng nghiên cứu 1.2.3 Nội dung nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược bacteriocin 2.2 Lịch sử nghiên cứu bacteriocin 2.3 Phân loại bacteriocin 2.3.1 Bacteriocin lớp I 2.3.1.1 Lớp Ia 2.3.1.2 Lớp Ib 2.3.2 Bacteriocin lớp II 2.3.2.1 Lớp IIa 2.3.2.2 Lớp IIb 2.3.2.3 Lớp IIc 2.3.3 Bacteriocin lớp III 2.3.4 Bacteriocin lớp IV 2.4 Cơ chế hoạt động 2.5 Đặc điểm bacteriocin nhóm vi khuẩn 2.6 Các đặc tính bacteriocin 10 2.6.1 Tính chất hóa học 10 2.6.2 Tính chất vật lý 10 iii 2.7 Bacteriocin từ vi khuẩn lactic 12 2.8 Ứng dụng bacteriocin 13 2.8.1 Bảo quản sinh học thực phẩm 13 2.8.2 Làm probiotic 14 2.8.3 Các sản phẩm chăm sóc sức khoẻ 15 2.8.4 Bacteriocin thương mại 16 2.9 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic 16 2.9.1 Các nghiên cứu giới 17 2.9.2 Các nghiên cứu nước 18 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.3 Thiết bị hoá chất 21 3.1.4 Môi trường sử dụng nghiên cứu 22 3.2 Phương pháp nghiên cứu 22 3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 22 3.2.2 Phân lập vi khuẩn lactic 22 3.2.3 Khảo sát khả kháng khuẩn 23 3.2.4 Kiểm tra khả sinh bacteriocin 24 3.2.4.1 Xử lý nhiệt 24 3.2.4.2 Xử lý enzyme phân giải protein 24 3.2.5 Định danh chủng vi khuẩn 25 3.2.5.1 Tách chiết DNA vi khuẩn 25 3.2.5.2 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 25 3.2.5.3 Định danh phân tích phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 26 3.2.6 Đặc điểm sinh học 27 3.2.6.1 Khả di động 27 3.2.6.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy lên khả sản xuất bacteriocin chủng vi khuẩn lactic 27 3.2.6.3 Khả sinh acid 27 PHẦN IV KẾT QUẢ 28 iv 4.1 Phân lập vi khuẩn lactic 28 4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn 29 4.3 Kiểm tra khả sinh bacteriocin 31 4.3.1 Xử lí nhiệt 31 4.3.2 Xử lí enzyme phân giải protein 33 4.4 Định danh chủng vi khuẩn 35 4.4.1 Tách chiết DNA 35 4.4.2 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 35 4.4.3 Định danh phân tích phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 37 4.5 Đặc điểm sinh học 39 4.5.1 Khả di động 39 4.5.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy lên khả sản xuất bacteriocin chủng vi khuẩn lactic 40 4.5.3 Khả sinh acid 41 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận… ……….43 5.2 Kiến nghị… 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC…… 53 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µl : Microliter Cs : Cộng DNA : FAO : Deoxyribonucleic acid Food and Agriculture Organization of the United Nations kDa : Kilodalton LAB : Lactic acide bacteria LB : Luria Bertani MRS : De Man, Rogosa and Sharpe RNA : Ribonucleic acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Sự khác biệt bacteriocin kháng sinh Bảng 2.2 Độ bền nhiệt, pH enzym thủy phân số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn lactic 11 Bảng 2.3 Các bacteriocin phổ biến tổng hợp vi khuẩn lactic 12 Bảng 4.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn 28 Bảng 4.2 Khả sinh acid chủng HN1 NA1.3 41 Phụ lục 1: Đặc điểm sinh hoá chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 53 Phụ lục 2: Khả kháng khuẩn sau xử lí nhiệt độ 55 Phụ lục 4: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh bacteriocin 58 vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Hình ảnh số khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 29 Hình 4.2 Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn 29 Hình 4.3 Biểu đồ thể khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn 30 Hình 4.4 Biểu đồ thể khả kháng khuẩn sau xử lí nhiệt độ 32 Hình 4.5 Khả kháng khuẩn sau xử lí với enzyme phân giải protein (proteinase K) 33 Hình 4.6 Biểu đồ thể khả kháng khuẩn sau xử lí enzyme phân giải protein (proteinase K) 34 Hình 4.7 Kết điện di DNA tổng số chủng HN1 NA1.3 35 Hình 4.8 Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA hai chủng vi khuẩn HN1 NA1.3 36 Hình 4.9 Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn HN1 37 Hình 4.10 Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn NA1.3 38 Hình 4.11 Khả di động chủng vi khuẩn có khả sinh bacteriocin 39 Hình 4.12 Biểu đồ hoạt tính bacteriocin chủng NA1.3 HN1 môi trường nuôi cấy khác (G: Glucose; Y: Yeast extract; N: NaCl) 40 Hình 4.13 Khả sinh acid chủng HN1 NA1.3 42 Phụ lục 3: Khả kháng khuẩn sau xử lí với nhiệt độ 57 Phụ lục 5: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh bacteriocin 59 viii 20 Gillor, O.; Etzion, A.; Riley, M.A The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics Appl Microbiol Biotechnol 2008, 81, 591–606 21 Gratia, A Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille C R Soc Biol 1925, 93, 1040–1041 22 Gross, E.; Kiltz, H.H.; Nebelin, E Subtilin, VI: the structure of subtilin (author's transl) Hoppe Seylers Z Physiol Chem 1973, 354, 810–812 23 Gross, E.; Morell, J.L Nisin The assignment of sulfide bridges of betamethyllanthionine to a novel bicyclic structure of identical ring size J Am Chem Soc 1970, 92, 2919–2920 24 Hammami, R.; Zouhir, A.; Ben Hamida, J.; Fliss, I BACTIBASE: a new webaccessible database for bacteriocin characterization BMC Microbiol 2007, 7, 89 25 Héchard Y., Sahl H.-G (2002), Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria, Biochimie, pp 545 - 557 26 Hernandez D, Cardell E, Zarate V (2005) Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillu plantarum TF711 J Appl Microbiol 99: 77–84 27 Holtsmark, I.; Eijsink, V.G.; Brurberg, M.B Bacteriocins from plant pathogenic bacteria FEMS Microbiol Lett 2008, 280, 1–7 28 Hoover D G (1992), Bacteriocins: activities and applications, Encyclopedia of microbiology, Encyclopedia of microbiology, 1, pp 181 - 192 29 Irfan A Rather et al (2017) Diversity of Marine Bacteria and Their Bacteriocins: Applications in Aquaculture doi 10.1080/23308249.2017.1282417 30 Jack, R.W.; Jung, G Lantibiotics and microcins: polypeptides with unusual chemical diversity Curr Opin Chem Biol 2000, 4, 310–317 47 31 Jacob, F.; Lwoff, A.; Siminovitch, A.; Wollman, E Définition de quelques termes relatifs la lysogenie Ann Inst Pasteur 1953, 84, 222–224 32 Jansen, E.F.; Hirschmann, D.J Subtilin, an antibacterial product of Bacillus subtilis: culturing conditions and properties Arch Biochem 1944, 4, 297– 304 33 Jiménez-Díaz, R.; Ruiz-Barba, J.L.; Cathcart, D.P.; Holo, H.; Nes, I.F.; Sletten, K.H.; Warner, P.J (1995) Purification and partial amino acid sequence of plantaricin S, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LPCO10, the activity of which depends on the complementary action of two peptides Appl Environ Microbiol., 61: 4459-4463 34 Juncioni de Arauza, L.; Jozalaa, A.F.; Mazzolab, P.G.; Vessoni Pennaa, T.C Nisin biotechnological production and application: a review Trends Food Sci Technol 2009, 20, 146–154 35 Kumar R S., Arul V (2009), Purification and characterization of phocaecin PI80: an anti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80 Isolated from the gut of Peneaus indicus (Indian white shrimp), J Microbiol Biotechnol , 19 (11), pp 1393 – 1400 36 M.P Castro, N.Z Palavecino et al, (2010) Lactic acid bacteria isolated from artisanal dry sausages: Characterization of antibacterial compounds and study of the factors affecting bacteriocin production Meat Science 87 (2011) 321– 329 37 Maftah, A.; Renault, D.; Vignoles, C.; Héchard, Y.; Bressolier, P.; Ratinaud, M.H.; Cenatiempo, Y.; Julien, R (1993) Membrane permeabilization of Listeria monocytogenes and mitochondria by the bacteriocin mesentericin Y105 J Bacteriol., 175: 3232-3235 38 Marwa A., Saad H M et al., (2015) Effect of pH, heat treatments and proteinase K enzyme on the activity of Lactobacillus Acidophilus bacteriocin Benha veterinary medical journal 28 (1) 210-215 48 39 Nes, I.F.; Johnsborg, O Exploration of antimicrobial potential in LAB by genomics Curr Opin Biotechnol 2004, 15, 100–104 40 Nwafor O E (2014) Isolation and identification of lactic acid bacterial (LAB) from yoghurt and antibacterial activity against some clinical isolates, International Journal of Food Nutrition and Safety, 5(1), 31–38 41 Ogunbanwo ST, Sanni AI, Onilude AA (2003) Influence of cultureal conditions on the production of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1 African J Biotechnol 2(7): 179–184 42 Oscáriz J C., Pisabarro A G (2001), Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria, International Micribiology, (1), pp 13 – 19 43 Özdemir G B., Oryaşın E., Bıyık H H., Özteber M., Bozdoğan B (2011), Phenotypic and Genotypic Characterization of Bacteriocins in Enterococcal Isolates of Different Sources, Indian J Microbiol, 51 (2), pp 182 - 187 44 Papagianni, M Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function and applications Biotechnol Adv 2003, 21, 465–499 45 Papagianni, M.; Anastasiadou, S Pediocins: The bacteriocins of Pediococci Sources, production, properties and applications Microb Cell Fact 2009, 8, 46 Rajaram, G., Manivasagan, P., Thilagavathi, B., Saravanakumar, A 2010 Purification and characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus lactis isolated from marine environment Advanced Journal of Food Science and Technology (2): 138-144 47 Reenen V., Dicks L M., Chikindas M (1998), Isolation, purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum, Journal of Applied Microbiology, 84 (6), pp 1131 – 1137 49 48 Reeves, P The bacteriocins Bacteriol Rev 1965, 29, 24–45 49 Rigos G, Troisi GM (2005) Antibacterial agents in Mediterranean finfish farming: a synopsis of drug pharmacokinetics in important euryhaline fish species and possible environmental implications Rev Fish Biol Fisher 15:53– 73 50 Rogers, L.A The inhibitory effect of Streptococcus lactis on Lactobacillus bulgaricus J Bacteriol 1928, 16, 321–325 51 S.T Ogunbanwo, A.I Sanni, and A A Onilude (2003) Influence of cultural conditions on the production of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1 African Journal of Biotechnology Vol (7), pp 179–184 52 Sahoo TK, Jena PK, Patel AK, Seshadri S (2014) Bacteriocins and their applications for the treatment of bacterial diseases in aquaculture: a review Aquac Res doi:10.1111/are.12556 53 Sahoo, T K., Jena, P K., Nagar, N., Patel, A K., & Seshadri, S (2015) In vitro evaluation of probiotic properties of lactic acid bacteria from the gut of Labeo rohita and Catla catla Probiotics and Antimicrobial Proteins doi:10.1007/s12602-015-9184-8 54 Samar L., Hadda O., Nicolas A., Ziad F., Pascal M., Abdellatif B (2012), Lacticin LC14, a new bacteriocin produced by Lactococcus lactis BMG6.14: isolation, purification and partial characterization, Infect Disord Drug Targets, pp 316 – 325 55 Schlegel R., Slade H D (1972), Bacteriocin Production by Transformable Group H Streptococci, Journal of Bacteriology, 112 (2), pp 824–829 56 Severinov, K.; Semenova, E.; Kazakov, A.; Kazakov, T.; Gelfand, M.S Lowmolecular-weight post-translationally modified microcins Mol Microbiol 2007, 65, 1380–1394 50 57 Smaoui S., Elleuch L., Bejar W., Karray-Rebai I., Ayadi I (2010), Inhibition of fungi and gram-negative bacteria by bacteriocin BacTN635 produced by Lactobacillus plantarum sp TN635, Biochemistry and Biotechnology, 162 (4), pp.1132 - 1146 58 Stephens, S.K.; Floriano, B.; Cathcart, D.P.; Bayley, S.A.; Witt, V.F.; Jiménez-Díaz, R.; Warner, P.J.; Ruiz-Barba, J.L (1998) Molecular analysis of the locus responsible for the production of plantaricin S, a two-peptide bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LPCO10 Appl Environ Microbiol., 64: 1871-1877 59 T Zendo, N Eungruttanagorn et al (2005) Identification and production of a bacteriocin from Enterococcus mundtii QU isolated from soybean Journal of Applied Microbiology 2005, 99, 1181–1190 60 Tahiri, I., M Desbiens, R Benech, E Kheadr, C Lacroix, S Thibault, D Ouellet, and I Fliss Purification, characterization and amino acid sequencing of divergicin M35: A novel class IIa bacteriocin produced by Carnobacterium divergens M35 Int J Food Microbiol., 97: 123–136 (2004) 61 Todorov S D (2009), Bacteriocins from Lactobacillus plantarum – production, genetic organization and mode of action, Brazilian Journal of Microbiology, 40 (2), pp 209 - 221 62 Todorov S D., Dicks L M (2007), Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza, Braz J Microbiol, 38 (1), pp 1678 4405 63 Vidaver, A.K Bacteriocins: the lure and the reality Plant Dis 1983, 67, 471– 474 53 Tagg, J.R.; Dierksen, K.P Bacterial replacement therapy: adapting 'germ warfare' to infection prevention Trends Biotechnol 2003, 21, 217–223 64 Wakil S M., Osamwonyi U O (2012), Isolation and screening of antimicrobial producing lactic acid bacteria from fermenting millet gruel, International Research Journal of Microbiology, 3(2), 072 –079 51 65 Wang, C.K.; Kaas, Q.; Chiche, L.; Craik, D.J CyBase: a database of cyclic protein sequences and structures, with applications in protein discovery and engineering Nucleic Acids Res 2008, 36, D206–D210 66 Wang, G.; Li, X.; Wang, Z APD2: the updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design Nucleic Acids Res 2009, 37, D933– D937 67 Wang, Z.; Wang, G APD: the Antimicrobial Peptide Database Nucleic Acids Res 2004, 32, D590–D592 68 Zacharof M., Lovitt R (2012), Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria, Biotechnology and Food Science, 2, pp 50 - 56 69 Zacharof, M P and R W Lovitt (2012) Bacteriocins produced by lactic acid bacteria: A Review Article APCBEE Procedia., 2: 50–56 52 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đặc điểm sinh hoá chủng vi khuẩn sinh bacteriocin Kí STT hiệu Hình thái khuẩn lạc chủng Màu HN1 Catalase bào trắng sữa, lạc hình khuẩn trịn, bề mặt lồi, - Gram + - Cầu khuẩn trơn Màu HN2 trắng đục, lạc trịn, khuẩn bóng, lồi Khuẩn NA1.1 nhỏ, NA1.3 - màu tròn trắng ngà, viền nhăn nhỏ, - Gram + - Hình que ngắn lạc Khuẩn Hình thái tế lạc màu - Gram + - Cầu khuẩn tròn trắng đục, dẹt - Gram + - Cầu khuẩn - Khuẩn lạc tròn, NA2 màu trắng sữa, bề mặt lồi - Gram + - Cầu khuẩn 53 Hình ảnh nhuộm Gram - Khuẩn lạc tròn NA3 nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt lồi, - Gram + - bóng Song cầu khuẩn - Khuẩn lạc trịn, HP1.1 bề mặt nhơ, màu trắng ngà, có chấm - Gram + - Hình que ngắn tâm - Khuẩn lạc tròn, HP2.2 bề mặt trơn, màu trắng đục - Gram + - Hình que ngắn 54 Phụ lục 2: Khả kháng khuẩn sau xử lí nhiệt độ Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d) mm Nhiệt độ Đối chứng 40℃/30 phút 60℃/30 phút Chủng Salmonella Escherichia coli HP1.1 12 ± 0.1 15 ± 0.1 HP2.1 11 ± 0.1 14 ± 0.1 HP2.2 13 ± 0.1 12 ± 0.1 NA1.1 13 ± 0.1 15 ± 0.1 NA1.3 21 ± 0.1 13 ± 0.1 NA2 14 ± 0.1 13 ± 0.1 NA3 14 ± 0.1 12 ± 0.1 HN1 15 ± 0.1 16 ± 0.1 HN2 15 ± 0.1 15 ± 0.1 HP1.1 11 ± 0.1 16 ± 0.1 HP2.1 13 ± 0.1 13 ± 0.1 HP2.2 14 ± 0.1 11 ± 0.1 NA1.1 12 ± 0.1 15 ± 0.1 NA1.3 19 ± 0.1 13 ± 0.1 NA2 13 ± 0.1 12 ± 0.1 NA3 12 ± 0.1 18 ± 0.1 HN1 13 ± 0.1 16 ± 0.1 HN2 13 ± 0.1 14 ± 0.1 HP1.1 10 ± 0.1 12 ± 0.1 HP2.1 13 ± 0.1 13 ± 0.1 HP2.2 12 ± 0.1 10 ± 0.1 NA1.1 11 ± 0.1 13 ± 0.1 NA1.3 18 ± 0.1 12 ± 0.1 NA2 0 NA3 11 ± 0.1 12 ± 0.1 HN1 13 ± 0.1 14 ± 0.1 HN2 11 ± 0.1 12 ± 0.1 55 Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d) mm Nhiệt độ 80℃/30 phút 100℃/30 phút 121℃/15 phút Chủng Salmonella Escherichia coli HP1.1 ± 0.1 10 ± 0.1 HP2.1 13 ± 0.1 11 ± 0.1 HP2.2 11 ± 0.1 ± 0.1 NA1.1 11 ± 0.1 11 ± 0.1 NA1.3 10 ± 0.1 12 ± 0.1 NA2 0 NA3 11 ± 0.1 12 ± 0.1 HN1 12 ± 0.1 11 ± 0.1 HN2 10 ± 0.1 ± 0.1 HP1.1 0 HP2.1 ± 0.1 ± 0.1 HP2.2 0 NA1.1 0 NA1.3 0 NA2 0 NA3 0 HN1 0 HN2 0 HP1.1 0 HP2.1 0 HP2.2 0 NA1.1 0 NA1.3 0 NA2 0 NA3 0 HN1 0 HN2 0 56 Phụ lục 3: Khả kháng khuẩn sau xử lí với nhiệt độ • 40℃ • 60℃ • 80℃ 100℃ 121℃ 57 Phụ lục 4: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh bacteriocin Thành phần môi trường G 1% G 2% G 3% Y 1% Y 2% Y 3% N 1% N 2% N 3% Chủng Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) mm Salmonella Escherichia coli HN1 10 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 ± 0.1 ± 0.1 HN1 12 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 ± 0.1 ± 0.1 HN1 12 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 12 ± 0.1 ± 0.1 HN1 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 ± 0.1 ± 0.1 HN1 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 ± 0.1 10 ± 0.1 HN1 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 10 ± 0.1 11 ± 0.1 HN1 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 ± 0.1 ± 0.1 HN1 ± 0.1 ± 0.1 NA1.3 ± 0.1 ± 0.1 HN1 ± 0.1 NA1.3 ± 0.1 58 Phụ lục 5: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh bacteriocin • Glucose 1%, 2%, 3% • NaCl 1%, 2%, 3% • Yeast extract 1%, 2%, 3% 59 Phụ lục 6: Kết giải trình tự đoạn gen 16S rRNA • Chủng HN1 CGAACCCCTTAAGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGG GTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGG AACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCT TCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAA GAGATTAGCTTAGCCTCGCGACTTCGCAACTCGTTGTACTTCCCATTGTA GCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCC CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTG AATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCC AACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTT GCCCCCGAAGGGGAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAG ACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACC GCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTA CTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGG AAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGG TATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACA GACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCAT TTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCC CAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGAC TTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGC TTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCT TTCTGGTTAGATACCGTCAAGGGATGAACAGTTACTCTCATCCTTGTTCT TCTCTAACACCAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGG CGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCC TCCCGTAGGAATTTGGGCCGGGTCTCAGTCCCAATGGGGCCGATCCCCT TTTCAGGTCGGCTATGCATCGGGGCCTTGGTGAACCGTTAC 60 • Chủng NA1.3 CATCCCCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGT GTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAA CGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTC ATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGA GATTTGCATGACCTCGCGGTCTAGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGC ACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCC ACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTAAA TGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAA CATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGT CCCCGAAGGGAAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGAC CTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGC TTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACT CCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAA ACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTA TCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGA CCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTC ACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAG TTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTA AGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTG CCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTC TGGTTAGATACCGTCAGGGGACGTTCAGTTACTAACGTCCTTGTTCTTCT CTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGT TGCTCGGTCAAACTTTCGTCCATTGCCGAAGATCCCTACTGCTGCCTCCC GTAGGAATCTGGGCCGGGTCTCAGTCCCAGGGTGGCCGATCACCCTTTT CAGGTCGGCTATGCATCGGGGCCTTGGTGAACCGTTAC 61