Tuyển chọn vi khuẩn azotobacter có khả năng cố định n và sinh tổng hợp iaa trong đất

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “TUYỂN CHỌN VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH N VÀ SINH TỔNG HỢP IAA TRONG ĐẤT” HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “TUYỂN CHỌN VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH N VÀ SINH TỔNG HỢP IAA TRONG ĐẤT” Người thực : Nguyễn Trà My Mã sinh viên : 639732 Lớp : K63KHMTA Khóa : Khóa 63 Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Khánh Huyền Địa điểm thực tập : Học viện Nông nghiệp Việt Nam HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG Độc lập - Tự - Hạnh phúc BIÊN BẢN HỌP TIỂU BAN CHẤM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đợt năm học 2021 - 2022 Họp Tiểu ban chấm bảo vệ khóa luận tốt nghiệp đại học: Cho sinh viên: Nguyễn Trà My Lớp: K63KHMTA Mã SV: 639732 Tên đề tài: Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định N sinh tổng hợp IAA đất Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Khánh Huyền Ngày bảo vệ: 28/06/2022 Tại địa điểm: Phòng Hội thảo khoa (201) *Các thành viên Tiểu ban (Kèm theo Quyết định số: 3545/QĐ-HVN ngày 27/6/2022) có mặt buổi bảo vệ gồm: 1/ PGS.TS Nguyễn Thanh Lâm - Trưởng tiểu ban 2/ ThS Nguyễn Thị Thu Hà - Thư ký 3/ TS Trần Nguyên Bằng - Ủy viên Vắng: *Nội dung bảo vệ: Sinh viên báo cáo tóm tắt khóa luận tốt nghiệp 15 phút Tiểu ban: Đọc nhận xét người phản biện đặt câu hỏi (5 phút) Sinh viên trả lời câu hỏi tiểu ban giải trình câu hỏi phản biện *Kết luận tiểu ban: Nhận xét chung khóa luận tốt nghiệp: đáp ứng yêu cầu chất lượng Khóa luận tốt nghiệp hệ đại học ngành Khoa học môi trường Tuy nhiên nhiều thơng tin cịn định tính, kết chưa xử lý thống kê, thuật ngữ sử dụng chưa thống toàn báo cáo Các vấn đề cần chỉnh sửa: + Thống thuật ngữ (cố định đạm, N , cố định nitơ…) + Bổ sung thông tin đất phục vụ thí nghiệm (nguồn đất đâu, đặc điểm địa chất, trồng, mùa vụ… đây) qua rõ chủng VSV phân lập đến từ nguồn nào? + Bổ sung giá trị trung bình độ lệch chuẩn kết cơng thức thí nghiệm biểu diễn kết đưa số liệu thô vào phụ lục Kết luận: - Điểm KLTN: - Yêu cầu chỉnh sửa: sinh viên sửa theo yêu cầu mục trước nộp lưu chiểu Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2022 Trưởng tiểu ban Thư ký PGS.TS Nguyễn Thanh Lâm ThS Nguyễn Thị Thu Hà CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Ngày tháng năm 2022 BẢN GIẢI TRÌNH SỬA CHỮA KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Kính gửi: - Ban Chủ nhiệm khoa Tài nguyên Môi trường - Bộ môn: Vi sinh vật Tên là: Nguyễn Trà My Mã sinh viên: 639732 Lớp: K63KHMTA Sinh viên ngành: Khoa học Môi trường Đã bảo vệ khóa luận tốt nghiệp Tiểu ban số ngày 28 tháng 06 năm 2022 Tên đề tài: “ Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định N sinh tổng hợp IAA đất” Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Khánh Tiểu ban chấm luận tốt nghiệp yêu cầu chỉnh sửa trước nộp khóa luận tốt nghiệp nội dung sau: STT Nội dung yêu cầu chỉnh sửa Nội dung giải trình (*) Tại trang Thống thuật ngữ (cố Thống thuật ngữ “ cố định Tại định đạm, N2, cố định N” nitơ…) trang 6, 7, Bổ sung thông tin đất - Bổ sung nguồn đất lấy mẫu, đặc điểm Trang phục vụ thí nghiệm (nguồn địa chất nơi lấy mẫu, trồng, mùa 22 đất đâu, đặc điểm địa chất, vụ, nơi lấy mẫu mục 3.1 trồng, mùa vụ… đây) - Chỉ rõ chủng VSV phân lập qua rõ chủng VSV đến từ nguồn đất canh tác rau củ phân lập đến từ i nguồn nào? Bổ sung giá trị trung bình - Số liệu thơ thí nghiệm đưa Trang độ lệch chuẩn kết vào phụ lục 62, 63, công thức thí nghiệm 64, 65 biểu diễn kết đưa số liệu thô vào phụ lục Tôi chỉnh sửa hồn thiện khóa luận tốt nghiệp theo u cầu Tiểu ban Vậy tơi kính mong thầy/cơ hướng dẫn xác nhận cho tơi để tơi có sở nộp khóa luận tốt nghiệp theo quy định Học viện Tôi xin chân trọng cảm ơn! NGƯỜI HƯỚNG DẪN SINH VIÊN i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp với nội dung: “Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định N sinh tổng hợp IAA đất” nghiên cứu tơi Những phần tham khảo khóa luận nêu phần danh mục tài liệu tham khảo Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp cảm ơn thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, hồn thành quy trình học tập Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, ngồi phấn đấu, nỗ lực thân, tơi cịn nhận quan tâm, giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân, tập thể ngồi trường Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Khánh Huyền thầy cô môn Vi sinh vật, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ, bảo suốt thời gian thực hoàn thành đề tài: “ Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định N sinh tổng hợp IAA đất” Tôi xin cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Tài nguyên & Môi trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày.….tháng …năm 2022 Sinh viên iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan N 1.1.1 Vai trò N sản xuất nông nghiệp 1.1.2 Các trình đồng hóa N 1.1.3 Các nhóm vi khuẩn có khả cố định N 1.2 Tổng quan IAA 1.2.1 IAA 1.2.2 Vai trị IAA nơng nghiệp 1.2.3 Các nhóm vi sinh vật có khả sinh IAA 1.3 Tổng quan số nghiên cứu nước 10 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 10 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Nội dung nghiên cứu 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 13 2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 14 2.4.3 Đánh giá khả cố định N chủng vi khuẩn phân lập 16 2.4.4 Xác định khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển 16 v 2.4.5 Đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn tuyển chọn 17 2.4.6 Đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 20 2.4.7 Phương pháp đếm khuẩn lạc 20 2.4.8 Phương pháp phân tích số liệu 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Azotobacter từ đất 22 3.2 Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter 26 3.2.1 Khả cố định N chủng phân lập 26 3.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA 27 3.3 Đặc tính sinh học khác chủng vi khuẩn 28 3.3.1 Xác định thời gian mọc khuẩn lạc điển hình 28 3.3.2 Xác định nhiệt độ nuôi cấy phù hợp 30 3.3.3 Đánh giá khả thích ứng pH 31 3.3.4 Đánh giá khả kháng kháng sinh 33 3.3.5 Đánh giá mức độ an toàn sinh học đến khả sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 3.3.6 Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 3.4 Kết tuyển chọn 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 46 v - Phương pháp trải đĩa - Phương pháp cấy ria làm - Phương pháp nhận dạng khuẩn lạc 2.2.3 Phương pháp đánh giá khả cố định N vi khuẩn Đánh giá khả cố định N chủng vi khuẩn thông qua xác định hàm lượng NH + dung dịch vi sinh vật sau nhân sinh khối phương pháp chưng cất chuẩn độ (TCVN 5988:1995) chất lượng nước xác định amoni - phương pháp chưng cất chuẩn độ 2.2.4 Phương phá đánh giá khả sinh tổng hợp IAA vi khuẩn Đánh giá khả sing tổng hợp IAA phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Van Urk Salkowski (Nguyễn Thị Thu Hằng & Nguyễn Thị Thủy, 2015) Nuôi cấy lắc (125 vịng/phút) chủng vi khuẩn mơi trường dịch thể Ashby nhiệt độ 30oC, có bổ sung thêm 0.1% Triptophan, ni lắc tủ tối 72h Định tính khả sinh IAA vào biến màu dịch khuẩn lạc với thuốc thử Salwkoski, qua so sánh nhận định chủng vi khuẩn có khả sinh IAA chủng phân lập 2.2.5 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn Xác định thời gian mọc khuẩn lạc điển hình: Các chủng vi khuẩn ni cấy mơi trường chuyên tính bán rắn điều kiện nhiệt độ 300C theo dõi theo mốc thời gian thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 xuất khuẩn lạc điển hình chủng vi khuẩn để xác định thời gian mọc chủng Xác định khoảng nhiệt độ nuôi cấy thích hợp: Các chủng vi khuẩn ni cấy mơi trường chun tính điều kiện nhiệt độ 200C, 250C, 300C, 350C, 400C Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc Xác định khả thích ứng pH: Các chủng vi khuẩn ni cấy mơi trường chun tính dạng lỏng thời gian 48 - 72 môi trường 52 có pH khác từ đến (4, 5, 6, 7, 8) Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc Đánh giá khả kháng kháng sinh: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy mơi trường chun tính có bổ sung bổ sung thêm kháng sinh streptomycin nồng độ khác nhau: 0, 300, 500, 800, 1000 (mg/L) Xác định mật độ tế bào sau 96h nuôi cấy phương pháp đếm khuẩn lạc đếm Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn tuyển chọn: Xác định khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn tuyển chọn theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (William, 1983; Balouiri,M & cộng sự, 2016) Nuôi dịch chiết: Cấy vịng que cấy VSV 9ml dung dịch mơi trường Ashby lỏng, đưa lên máy lắc 150 vòng/phút Sau 72 nuôi cấy lắc, dịch nuôi cấy sử dụng để đánh giá khả phân giải enzym Chuẩn bị mơi trường: đánh giá hoạt tính loại emzym: amylase, protease cellulose 2.2.6 Đánh giá độ an toàn sinh học loại rau Đánh giá độ an toàn sinh học loại rau củ quy mơ phịng thí nghiệm Mẫu rau từ khỏe sau rửa ngâm dung dịch NaCl 1% phút, rửa lại nước vô trùng; làm khô mẫu đặt đĩa petri khử trùng; Dùng que cấy khử trùng tạo vết thương bề mặt miếng rau củ xử lý sơ sau chấm vi sinh vật lên vết thương vừa tạo để nhiệt độ phịng Theo dõi hình thành vết thương mẫu rau củ sau 24-48h Vết thương bị ướt lan rộng chứng tỏ đối tượng vi sinh vật có khả gây bệnh đến thực vật 2.2.7 Phương pháp đếm khuẩn lạc: Để xác định mật độ vi sinh vật mẫu pha loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch sau đếm khuẩn lạc mọc Vi khuẩn cấy đĩa phát triển hình thành khuẩn lạc từ vi khuẩn ban đầu Những khuẩn lạc thấy đếm mắt thường kính hiển vi 53 Mật độ vi sinh vật tính theo cơng thức: A (CFU/ml) = N V ×10 − x Trong đó: A : Mật độ khuẩn lạc (CFU/ml) N : Số khuẩn lạc đĩa V : Thể tích dịch cấy (ml) 10-x : Nồng độ pha lỗng sử dụng 2.2.8 Phương pháp phân tích số liệu Các số liệu thu thập, nghiên cứu tổng hợp xử lý thống kê phần mềm excel số phần mềm khác Các số liệu thô ghi nhận lấy giá trị trung bình đối chiếu với biểu đồ tương ứng 54 CHƯƠNG III DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Phân lập chủng vi khuẩn Azotobacter Xác định có khơng khả cố định đạm chủng vi khuẩn phân lập Tính hàm lượng Đạm (N) mà chủng vi khuẩn cố định Xác định có chủng vi khuẩn Azotobacter có khả sinh tổng hợp IAA tất chủng phân lập Biết khả sinh enzyme nitrgenaza, điều kiện nuôi cấy sinh tối ưu, ảnh hưởng pH, mức kháng kháng sinh chủng vi khuẩn Azotobater tuyển chọn 55 Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Việt Đường Hồng Dật (2008) Kỹ thuật bón phân cân đối hợp lý cho trồng Nhà xuất Khoa học Cơng nghệ Nguyễn Hồng Nhựt Lynh Nguyễn Hữu Hiệp, 2019 Tuyển chọn vi khuẩn có khả cố định đạm, hịa tan lân, tổng hợp IAA nội sinh cà phê vối ( Coffea canephora Pierreex A froehner) trồng tỉnh Đắk Lắk Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 55 (Số chun đề: Cơng nghệ Sinh học)(2): 34-40 Nguyễn Đình Thi, 2012 Ảnh hưởng axit indol axetic (IAA) đến sinh trưởng, phát triển suất lạc (Arachis hypogaea) Thừa Thiên Huế Tạp chí Khoa học Trường Đại học Huế 75A Số 6: 142-152 Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Thanh Mai, Võ Thu Giang, Phạm Thế Hải Phân lập tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp IAA (Indol Acetic Acid) từ đất trồng sâm Việt Nam Quảng Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa Tự nhiên Công nghệ.33( Số 2S, 2017):219-226 Trung tâm nghiên cứu cơng nghệ hóa dinh dưỡng trồng Các loại phân đạm cách sử dụng (2021) http://khaonghiemkiemnghiemphanbon.vn/trung-tam-kien- thuc/cac-loaiphan-dam-va-cach-su-dung-143.html Thi, X L., Thanh, L D., & Khởi, N N (2020) Khảo sát khả kích thích nảy mầm sinh trưởng rau muống số dòng vi khuẩn cố định đạm tổng hợp IAA Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 56(CĐ Khoa học đất): 37-46 https://doi.org/10.22144/ctu.jsi.2020.067 56 Tài liệu Tiếng Anh Abd-Alla, Mohamed Hemida, El-Sayed A El-Sayed, and Abdel-Hamied M Rasmey.(2013)"Indole-3-acetic acid (IAA) production by Streptomyces atrovirens isolated from rhizospheric soil in Egypt." J Biol Earth Sci 3.2 : 182-193 Ahmad, Farah, Iqbal Ahmad, and M S Khan (2008) "Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities." Microbiological research 163.2:173-181 https://doi.org/10.1016/j.micres.2006.04.001 Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S K (2016) Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Journal of pharmaceutical analysis, 6(2), 71-79 Burgmann, H., F Widmer, W Von Sigler, and J Zeyer (2004) New molecular screening tools for analysis of free-living diazotrophs in soil Appl Environ Microbiol 70:240-247 Kahindi, J H P., et al (1997) Agricultural intensification, soil biodiversity and ecosystem function in the tropics: the role of nitrogen-fixing bacteria Appl Soil Ecol 6:55-76 Moser, A., & Haber, F (1910) Die elektrolytischen Prozesse der organischen Chemie (Vol 36) Halle Orr, Caroline H., et al (2011) "Diversity and activity of free-living nitrogenfixing bacteria and total bacteria in organic and conventionally managed soils." Applied and environmental microbiology 77.3: 911919 Okon, Y (1985) Azospirillum as a potential inoculant for agriculture Trends in Biotechnology, 3(9), 223-228 Puneet, K., Sohal, R P., Gupta, R P., & Pandher, M S (1998) Effect of inoculation of Azotobacter and PSM on fertilizer economy, plant 57 growth and yield of winter maize Nitrogen fixation with nonlegumes Kluwer Academic Publisher, 79, 271-273 Robertson, G P and P M Groffman 2015 Nitrogen transformations Pages 421-446 in E A Paul, editor Soil microbiology, ecology and biochemistry Fourth edition Academic Press, Burlington, Massachusetts, USA Shokri, D., Emtiazi, G (2010) Indole-3-Acetic Acid (IAA) Production in Symbiotic and Non- Symbiotic Nitrogen-Fixing Bacteria and its Optimization by Taguchi Design Curr Microbiol 61, 217–225 https://doi.org/10.1007/s00284-010-9600-y Teale, W D., Paponov, I A., & Palme, K (2006) Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development Nature reviews Molecular cell biology, 7(11), 847-859 Uchida, N., Buck, D W., He, D., Reitsma, M J., Masek, M., Phan, T V., & Weissman, I L (2000) Direct isolation of human central nervous system stem cells Proceedings of the national academy of sciences, 97(26), 14720-14725 58 PHỤ LỤC Bảng Thành phần môi trường Ashby Thành phần Khối lượng Glucoze 20g K2HPO4 0.2g MgSO4.7H2O 0.2g NaCl 0.2g K2SO4 0.1g CaCO3 5g Thạch (Agas) 20g Nước cất 1000ml pH - 7.2 59 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU STT Nội dung Thời gian thực Chuẩn bị đề cương 10/01 đến 19/02/2022 Bảo vệ đề cương 20/01/2022 Tiến hành khóa luận,lập kế hoạch 15/02 đến 20/04/2022 Báo cáo tiến độ 30/04/2022 Xử lí số liệu,viết khóa luận 01/05/2022 Nộp khóa luận 25/05/2022 Báo cáo khóa luận Tháng 06/2022 Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực đề tài (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) BỘ MÔN QUẢN LÝ SINH VIÊN 60 Phụ lục II Số liệu thơ thí nghiệm Xác định thời gian mọc khuẩn lạc điển hình Chủng A11 10-4 10-5 10-6 Chủng A14 24h 48h 72h 96h 125 265 411 672 133 303 387 697 104 276 398 653 25 41 143 312 14 39 111 395 17 37 109 357 23 37 65 18 45 53 14 36 72 24h 48h 72h 96h 12 12 23 15 19 18 16 17 21 5 11 1 -4 10 -5 10 10-6 61 2 Xác định khoảng nhiệt độ ni cấy thích hợp Chủng A11 10-4 10-5 10-6 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 30 128 256 243 244 35 136 276 273 219 27 106 243 286 226 11 15 125 126 80 18 133 97 84 18 28 104 87 97 19 16 14 15 18 15 32 10 Chủng A14 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 10-4 45 37 48 21 62 10-5 10-6 52 27 19 12 1 13 18 15 15 1 0 11 Xác định khả thích ứng pH Chủng A11 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 25 45 12 43 38 10 31 33 11 21 20 28 23 31 11 17 1 15 -4 10 -5 10 10-6 63 Chủng A14 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 34 32 0 41 11 0 29 0 25 0 0 0 12 -4 10 -5 10 10-6 64 Đánh giá khả kháng kháng sinh 24h 48h 72h 300 500 800 300 500 800 96h 300 500 800 300 500 800 Chủng 10-4 - - - - - - - - + + - - + + + + A11 10-5 - - - - - - - - + - - - + - - - 10-6 - - - - - - - - + - - - + - - - 10-4 - - - - - - - - + + - - + + - - Chủng 10-5 - - - - - - - - + - - - + - - - A14 10-6 - - - - - - - - + - - - + - - - 65 66