Nghiên cứu phân lập một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp iaa ở vi khuẩn bacillus megaterium

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP IAA Ở VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM Hà Nội, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP IAA Ở VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM Sinh viên thực : Nguyễn Siêu Tuấn Vũ Lớp : K63CNSHC Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phạm Bích Ngọc Th.S Trịnh Thị Thu Thủy Bộ môn : SHPT&CNSHƯD Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan thực hết nội dung nghiên cứu luận văn tốt nghiệp này, số liệu kết nghiên cứu mang tính trung thực, khách quan chưa sử dụng nghiên cứu khoa học Các thông tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Sinh viên i năm 2022 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận cách tốt đẹp, nỗ lực cố gắng thân, nhận giúp đỡ, động viên từ cá nhân, tập thể Lời xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Bích Ngọc trưởng phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng người hướng dẫn trực tiếp tơi ln tận tình giúp đỡ, ủng hộ, cung cấp hóa chất, trang thiết bị đại, phịng thí nghiệm để tơi hồn thành khóa luận Thứ hai, xin chân thành cảm ơn Th.S Trịnh Thị Thu Thủy thầy cô môn SHPT CNSH ứng dụng đồng hành quan tâm giúp đỡ tơi suất thời gian tơi làm đề tài khóa luận Thứ ba, xin cảm ơn cán cơng tác Phịng Cơng Nghệ ADN ứng dụng (Viện Công nghệ Sinh học -Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam) quan tâm, dạy cho tơi nhiều kiến thức, kỹ phịng thí nghiệm để tơi hồn thành đề tài khóa luận Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ suốt thời gian học tập làm đề tài khóa luận Hà Nội, ngày tháng Sinh viên ii năm 2022 MỤC LỤC Chương Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan vi khuẩn Bacillus megaterium 2.2 Một số đường, gen sinh tổng hợp IAA thực vật vi khuẩn 2.3 Các đường trao đổi chất Bacillus megaterium 1TM7 từ sở liệu KEGG 2.4 Sinh tổng hợp IAA Bacillus megaterium .10 2.5 Nghiên cứu chức gen 12 2.6 Các công nghệ giải trình tự DNA giới 17 2.6.1 Giải trình tự DNA hệ 17 2.6.2 Giải trình tự DNA hệ 19 2.6.3 Giải trình tự DNA hệ thứ ba thứ tư 20 2.7 Các công cụ tin sinh học 22 2.7.1 Cơ sở liệu NCBI: 22 2.7.2 Cơ sở liệu KAAS - KEGG Automatic Annotation Server for ortholog assignment and pathway mapping 24 2.7.3 Cơ sở liệu Interpro 25 Chương vật LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 3.1 Vật liệu 26 3.2 Phương pháp 26 3.2.1 Phương pháp khai thác sở liệu gen 26 3.2.2 Phương pháp tách DNA genome (gDNA) Bacillus megaterium(Minas et al 2011) 28 3.2.3 Phương pháp khuếch đại gen phản ứng PCR 30 iii Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết dự đoán đường sinh tổng hợp IAA vi khuẩn Bacillus megaterium 1TM7 33 4.2 Xác định gen tiềm tham gia vào đường chuyển hóa IAA 36 4.3 Khuếch đại 1TM7-03404, ysnE yclC từ gDNA Bacillus megaterium 1TM7 36 4.4 Kết giải trình tự 1TM7_03404, ysnE yclC .39 4.4.1 Trình tự ysnE 39 4.4.2 Trình tự 1TM7_03404 .40 4.4.3 Trình tự yclC 41 4.5 Thảo luận .42 Chương kết luận VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận .43 5.2 Kiến nghị .43 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Con đường indole-3-pyruvic acid Ký hiệu: trp – tryptophan, IPyA – indole-3-pyruvic acid, IAAld – indole-3-acetaldehyde (Duca et al 2014b) .4 Hình 2.2 Con đường indole-3-acetamide Ký hiệu: IAM – indole-3-acetamide, IAN – indole-3-acetinitrile, IAOx – indole-3-acetaldoxime (Duca et al 2014b) Hình 2.3 Con đường indole-3-acetonitrile/indole-3-acetaldoxime Trp – tryptophan, IAOx - indole-3-acetaldoxime, IAN – indole-3-acetinitrile (Duca et al 2014b) Hình 2.4 Phức hợp Cas9-sgRNA-DNA 14 Hình 2.5 Ứng dụng CRISPR/Cas9 recombineering (Cho et al 2017b) .15 Hình 2.6 Cơ chế can thiệp RNA động vật có vú(D H Kim and Rossi 2007) 17 Hình 3.1:Các đường chuyển hóa tryptophan Bacillus megaterium từ sở liệu Kegg .27 Hình 3.2: Kết domains truy vấn 28 Hình 4.1 Con đường indole-3-pyruvic acid Bacillus megaterium Ký hiệu: trp – tryptophan, IPA – indole-3-pyruvic acid, IAAld – indole-3-acetaldehyde, IAA – Indole 3-acetic acid Error! Bookmark not defined Hình 4.2 Con đường indole-3-acetamide Bacillus megaterium Ký hiệu: Trptryptophan, IAM – indole-3-acetamide, Indole 3-acetic acid 10 Hình 4.3 Con đường tryptamine Bacillus megaterium Ký hiệu: : Trptryptophan, IAAld–indole-3-acetaldehyde, IAA -Indole 3-acetic acid 11 Hình 4.4 Kết PCR gen 1TM7_03404 .37 Hình 4.5.Kết điện di sản phẩm PCR ysnE A PCR cặp mồi ysnE.F ysnE.R B PCR Up.CP.F Dn.CP.R (2 giếng đầu) YE.TM10.F2 YE.TM10.R (2 giếng sau) 38 Hình 4.6 Kết PCR gen yclC .39 Hình 4.7 Các peak kết giải trình tự gen ysnE phương pháp Sanger.39 Hình 4.8 Kết trình tự nối (ysnEseq) trình tự ban đầu (ysnE) 40 Hình 4.9 Các peak kết giải trình tự 1TM7_03404 phương pháp Sanger .40 Hình 4.10 Các peak kết giải trình tự yclC(1TM7_00770) phương pháp Sanger .41 Hình 4.11 Kết trình tự nối (yclCseq) trình tự ban đầu (yclC) 42 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: 30 đường trao đổi chất Bacillus megaterium 1TM7 từ sở liệu KEGG Bảng 2.2:Một số gen tham gia vào đường chuyển hóa IAA B amyloliquefaciens SQR9 đề xuất (Shao et al 2015) 11 Bảng 3.1.Thành phần đệm CTAB 28 Bảng 3.2 Thành phần PCI 29 Bảng 3.3 Thành phần PCI 29 Bảng 3.4 Thành phần đệm TE 30 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cas CRISPR associated protein CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CSDL Cơ sở liệu CTAB Cetyltrimethylammonium bromua DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate EDTA Axit etylenediaminetetraacetic HMM Mơ hình Markov ẩn (hidden Markov model) IAA Indole 3-acetic acid IAAld Indole-3-acetaldehyde IAM Indole-3-acetaminde IAN Indole-3-acetonitrile IPyA Indole-3-pyruvic acid NADP Nicotinamid adenin dinucleotid NGS Next generation sequencing PCI Phenol, Chloroform, Isoamyl ahcohol PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid TAM Tryptamine vii CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Indole 3-acetic acid (tên IUPAC: 2-(1H-indol-3-yl) acetic acid, viết tắt: IAA) axit monocacboxylic có cơng thức phân tử C10H9NO2 IAA lần phát thực vật vào cuối kỷ 19 khám phá đặt móng cho lĩnh vực “auxinology” (Spartz and Gray 2008) IAA chất trung tâm điều hòa trình sinh học, có tác dụng kích thích kéo dài tế bào cách thay đổi điều kiện sinh lý tăng tính thấm nước, tính thấm lọc, giảm áp lực tế bào xuống mức thấp v.v IAA cịn ngăn chặn trì hỗn tượng sinh lý lá, thúc đẩy hoa, tạo quả, rễ, phân chia tế bào v.v Do đó, việc sinh tổng hợp IAA quan trọng việc điều hòa sinh trưởng Với tác dụng vậy, IAA chất hướng đến tổng hợp để hỗ trợ sinh trưởng phát triển lồi lương thực ngành nơng nghiệp, đặc biệt bối cảnh nhu cầu lương thực ngày gia tăng Trong tự nhiên, IAA tổng hợp thực vật lẫn vi sinh vật vùng rễ thực vật Trong đó, Bacillus megaterium vi khuẩn phổ biến vùng rễ thực vật Bacillus megaterium chứng minh có khả sản sinh IAA với lượng lớn Nó có hệ gen nhỏ giải trình tự, thời gian sinh trưởng phát triển nhanh cộng với khả thao tác gen dễ dàng Do đó, B megaterium loài vi khuẩn tiềm việc sản xuât IAA ứng dụng vào nông nghiệp" Tuy nhiên, đường sinh tổng hợp IAA Bacillus vi khuẩn Gram dương khác chưa nghiên cứu kỹ Người ta tập trung làm rõ đường sinh tổng hợp IAA thực vật số vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên, để tối ưu hóa sản xuất IAA B megaterium để ứng dụng, điều hiểu rõ đường sinh tổng hợp IAA lồi Vì lý 4.2 Xác định gen tiềm tham gia vào đường chuyển hóa IAA Như trình bày trên, gen ysnE có tham gia xúc tác vào nhiều đường chuyển hóa khác Mà bất hoạt gen lượng IAA giảm tới 86% chủng B amyloliquefaciens SQR9 (Shao et al 2021) Tương tự với gen yclC, gen 1TM7_03404 tham gia vào hai đường chuyển hóa quan trọng IPyA TAM Do đó, gen ysnE, yclC 1TM7_03404 cho gen tiềm nên chọn để phân lập 4.3 Khuếch đại 1TM7-03404, ysnE yclC từ gDNA Bacillus megaterium 1TM7 Để chắn gen tìm thực có genom 1TM7 tiến hành khuếch đại gen phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction, PCR) Với gen 1TM7_03404, thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân gen lên tạo sản phẩm 408bp Tên mồi Trình tự 5’- 3’ 03404-F CCGATGAAGCAGGATTCCCA 03404-R CAAGCGGACCCATTGTTGTC 36 Hình 4.1 Kết PCR gen 1TM7_03404 Với gen ysnE (1TM7_03535) thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân lên: Tên mồi Trình tự (5’- 3’) YsnE-F1 AGATGAGCACCACGGAGAAA YsnE-R1 TAGAAAACGGTTCGCACTCG UP.CP.F CCTAAAGTCACGTATAGTTTATTAAATAACAAGG DN.CP.R TCCAACAAACAACCCTTCTAAAATTACTGC YE.TM10.F2 AAGAGACCACTTAACGAACAATG YE.TM10.R TTACTCATTCAATTTCTTTGTCATAAACACACTG 37 Hình 4.2.Kết điện di sản phẩm PCR ysnE A PCR cặp mồi ysnE.F ysnE.R B PCR Up.CP.F Dn.CP.R (2 giếng đầu) YE.TM10.F2 YE.TM10.R (2 giếng sau) Với gen yclC (1TM_00770) thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân lên sản phẩm có kích thước 970bp Tên mồi Trình tự 5’- 3’ YclC-R CTTGTTTCTGGTGCAACCGG YclC-F ACCTTTTGCCATTGTTCCGC 38 Hình 4.3 Kết PCR gen yclC 4.4 Kết giải trình tự 1TM7_03404, ysnE yclC 4.4.1 Trình tự ysnE Hình 4.4 Các peak kết giải trình tự gen ysnE phương pháp Sanger 39 Hình 4.5 Kết trình tự nối (ysnEseq) trình tự ban đầu (ysnE) Trình tự ysnE chủng B.megaterium 1TM7 có độ tương đồng lên 99% so với trình tự ysnE priestia aryabhattai, tương đồng tới 86% so với trình tự ysnE B.subtilis 168, tưởng đồng 56% so với ysnE Bacillus amyloliquefaciens SQR9 công bố 4.4.2 Trình tự 1TM7_03404 Hình 4.6 Các peak kết giải trình tự 1TM7_03404 phương pháp Sanger 40 Trình tự gen 30404 B.megaterium 1TM7 có độ tương đồng 80% so với trình tự Priestia flexa tương đồng 75% so với trình gen có chức tương tự Bacillus vallismortis Bacillus tequilensis cơng bố trước 4.4.3 Trình tự yclC Hình 4.7 Các peak kết giải trình tự yclC (1TM7_00770) phương pháp Sanger 41 Hình 4.8 Kết trình tự nối (yclCseq) trình tự ban đầu (yclC) Trình tự gen yclC B.megaterium 1TM7 có độ tương đồng lên tới 81% so với trình yclC B Subtillis tương đồng 82% so với trình tự yclC Bacillus atrophaeus cơng bố trước 4.5 Thảo luận Cả ba trình tự có kết tín hiệu cao, khơng bị nhiễu liệu chứng tỏ DNA tinh nguyên vẹn cho kết giải trình tự xác Đề tài dự đốn phân lập thành cơng số gen tham đường sinh tổng hợp IAA B megaterium 1TM7, cở sở cho nghiên cứu tiếp chỉnh sửa gen hay đánh gia hoạt tính enzyme mã hóa Ngồi ra, kết làm tham chiếu cho nghiên cứu chức gen tham tổng hợp IAA vi khuẩn khác 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đề tài dự đoán xây dựng số đường số gen tham đường sinh tổng hợp IAA B.megaterium 1TM7 Khuếch đại giải trình tự thành cơng gen tiềm từ gADN B megaterium 1TM7 (03404, yclC ysnE) 5.2 Kiến nghị Sử dụng công cụ chỉnh sửa hay bất hoạt gen để nghiên cứu vai trò cụ thể gen sinh tổng hợp IAA Xây dựng đường tổng hợp IAA Bacillus megaterium hồn chỉnh PHỤ LỤC Trình tự ysnE: GTTCTCACCTTCAAGGAATGAACTTACATTCCCCCCCTGAAAGTATTCA TGCTCTAGATATTGAAAGTTTAAAACAACGTCATATTACGTTTTGGAGC GTGTGGGAAGGAAGTCAGCTAGCAGGGTGCGGAGCTGTAAAAGAGTTA GATGAGCACCACGGAGAAATTAAATCGATGCGAACAGCTACCGCTCAT TTGCGGAAAGGAATTGCTAGAGAGCTGCTGCAGTACATAATAAATGAA GCGCAAAAACGAGGGTACCGACGCTTAAGCTTAGAAACAGGATCCGCA CCCGCTTTTGAACCGGCTAGAAAGCTATACGCCAG Trình tự gen 1TM7_03404: TCCGATGAAGCAGGATTCCCAAAAGGCGTGTTAAACATTGTGCCAGGC TACGGGAAAACAGCAGGTGAACCGCTCGTTATCATGATCTTGTCGATA AAATTGCTTTTACAGGATCTACTGCTGTCGGAAAAGCAATTATGAAACA AGCTAGCGACTCTTTAAAGCGTGTGACGTTAGAGCTTGGAGGAAAATC ACCAAACATTATCCTCCCGGATGCAGACTTAACAAAAGCTGTTCCTGGT GCGCTTTCAGGTATTATGTTTAACCAGGGACAAGTATGTTGTGCTGGAA GTCGTCTGTATGTCCAAAAAAGCTTATATGATAATGTCGTAGCTGATTT 43 AGTTCTCCAAACGAAATCTATTAAACAAGGAAATGGATTAGCTGATGA GACAACAATGGGTCCGCTTGA Trình tự yclC: TTCCTTTGCCATGTTCCGCTTGAATCAAGGAGACGGAGGCTACTATCTA GATAAAGCGTGCGTTATTTCTCGTGATCAGCATGATAAGGCGCATTTCG GCAAACAAAACGTAGGTATATATCGTATGCAGGTCAAAGGGAAAGACC GTCTAGGCATTCAGCCCGTGCCACAGCATGATATTGCCATTCACTTAAA ACAAGCCGAAGAAAAAGGTGAAAACCTCCCTGTATCAATTGCTTTAGG ATGTGAACCCGCGATTGTCACAGCAGCTGCTACGCCGCTTCATTACGAT CAATCAGAGTATGAAATGGCAGGAGCTATTCAAGGTGAGCCGTACAGA ATTGTGAAGTCTCAGCTTTCTGATTTAGATGTACCTTGGGGAGCAGAAG TGATTTTAGAGGGAGAAATCTTAGCTGGTGAACGTGAGTATGAGGGTC CTTTTGGTGAATTTACAGGTCATTACTCCGGTGGCAGAAGCATGCCTGT TATCAAAATCAATCGCGTATACCATCGCAAAGATCCTATTTTTGAAAGT CTATATATCGGTATGCCTTGGACAGAAACAGATTATTTAATTGGAATCA ATACAAGCGTTCCTTTATATCAGCAGCTAAAAGAAGCATATCCTGAAG AGATTGAAGCGGTGAACGCGATGTATACTCATGGTCTCGTTGCTATCAT TTCAACGAAAAGCCGATACGGAGGATTTGCTAAGGCGGTTGGTATGAG GGCATTGACTACGCCGCATGGATTAGGATATTGCAAGCTAGTTATTTTA GTAGACGAAGATGTGGATCCGTTTAATTTACCGCAAGTCATGTGGGCG CTATCGACAAAAATGCACCCAAAACATGATGTTATAACAGTGCCTAAT CTCTCAGTTCTGCCACTTGATCCAGGATCTGATCCGGCTGGTATTACAG ATAAAATGATTTTGGATGCTACAACACCGGTTGCACG 44 Tài liệu tham khảo Apweiler, R 2001 “The InterPro Database, an Integrated Documentation Resource for Protein Families, Domains and Functional Sites.” Nucleic Acids Research 29 (1): 37–40 https://doi.org/10.1093/nar/29.1.37 Benson, D A., I Karsch-Mizrachi, D J Lipman, J Ostell, and D L Wheeler 2007 “GenBank.” Nucleic Acids Research 35 (Database): D21–25 https://doi.org/10.1093/nar/gkl986 Cho, Jae Sung, Kyeong Rok Choi, Cindy Pricilia Surya Prabowo, Jae Ho Shin, Dongsoo Yang, Jaedong Jang, and Sang Yup Lee 2017a “CRISPR/Cas9Coupled Recombineering for Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum.” Metabolic Engineering 42 (July): 157–67 https://doi.org/10.1016/j.ymben.2017.06.010 ——— 2017b “CRISPR/Cas9-Coupled Recombineering for Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum.” Metabolic Engineering 42 (July): 157–67 https://doi.org/10.1016/j.ymben.2017.06.010 Cooney, TerrenceP., and HeatherM Nonhebel 1991 “Biosynthesis of Indole-3Acetic Acid in Tomato Shoots: Measurement, Mass-Spectral Identification and Incorporation of ?2H from ?2H2O into Indole-3-Acetic Acid, d- and lTryptophan, Indole-3-Pyruvate and Tryptamine.” Planta 184 (3) https://doi.org/10.1007/BF00195339 De Luca, Vincenzo, Jesus Alvarez Fernandez, Douglas Campbell, and Wolfgang G W Kurz 1988 “Developmental Regulation of Enzymes of Indole Alkaloid Biosynthesis in Catharanthus Roseus.” Plant Physiology 86 (2): 447–50 https://doi.org/10.1104/pp.86.2.447 Downward, Julian 2004 “RNA Interference.” BMJ 328 (7450): 1245–48 https://doi.org/10.1136/bmj.328.7450.1245 Duca, Daiana, Janet Lorv, Cheryl L Patten, David Rose, and Bernard R Glick 2014a “Indole-3-Acetic Acid in Plant–Microbe Interactions.” Antonie van Leeuwenhoek 106 (1): 85–125 https://doi.org/10.1007/s10482-013-0095-y ——— 2014b “Indole-3-Acetic Acid in Plant–Microbe Interactions.” Antonie van Leeuwenhoek 106 (1): 85–125 https://doi.org/10.1007/s10482-013-0095-y Edwards, Al, Hartmut Voss, Peter Rice, Andrew Civitello, Josef Stegemann, Christian Schwager, Juergen Zimmermann, Holger Erfle, C.Thomas Caskey, and Wilhelm Ansorge 1990 “Automated DNA Sequencing of the Human HPRT Locus.” Genomics (4): 593–608 https://doi.org/10.1016/08887543(90)90493-E Eppinger, Mark, Boyke Bunk, Mitrick A Johns, Janaka N Edirisinghe, Kirthi K Kutumbaka, Sara S K Koenig, Heather Huot Creasy, et al 2011 “Genome Sequences of the Biotechnologically Important Bacillus Megaterium Strains 45 QM B1551 and DSM319.” Journal of Bacteriology 193 (16): 4199–4213 https://doi.org/10.1128/JB.00449-11 Fong, Jessica H, and Aron Marchler-Bauer 2008 “Protein Subfamily Assignment Using the Conserved Domain Database.” BMC Research Notes (1): 114 https://doi.org/10.1186/1756-0500-1-114 Goodwin, Sara, John D McPherson, and W Richard McCombie 2016 “Coming of Age: Ten Years of next-Generation Sequencing Technologies.” Nature Reviews Genetics 17 (6): 333–51 https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49 Guillet, Gabriel, Julie Poupart, Juan Basurco, and Vincenzo De Luca 2000 “Expression of Tryptophan Decarboxylase and Tyrosine Decarboxylase Genes in Tobacco Results in Altered Biochemical and Physiological Phenotypes.” Plant Physiology 122 (3): 933–44 https://doi.org/10.1104/pp.122.3.933 Hannon, Gregory J 2002 “RNA Interference.” Nature 418 (6894): 244–51 https://doi.org/10.1038/418244a Howden, Andrew J M., and Gail M Preston 2009 “Nitrilase Enzymes and Their Role in Plant-Microbe Interactions: Nitrilase Enzymes and Plant-Microbe Interactions.” Microbial Biotechnology (4): 441–51 https://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2009.00111.x Idris, ElSorra E., Domingo J Iglesias, Manuel Talon, and Rainer Borriss 2007 “Tryptophan-Dependent Production of Indole-3-Acetic Acid (IAA) Affects Level of Plant Growth Promotion by Bacillus Amyloliquefaciens FZB42.” Molecular Plant-Microbe Interactions® 20 (6): 619–26 https://doi.org/10.1094/MPMI-20-6-0619 Jinek, Martin, Krzysztof Chylinski, Ines Fonfara, Michael Hauer, Jennifer A Doudna, and Emmanuelle Charpentier 2012 “A Programmable Dual-RNA– Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.” Science 337 (6096): 816–21 Kim, Daniel H., and John J Rossi 2007 “Strategies for Silencing Human Disease Using RNA Interference.” Nature Reviews Genetics (3): 173–84 https://doi.org/10.1038/nrg2006 Kim, Sunghwan, Jie Chen, Tiejun Cheng, Asta Gindulyte, Jia He, Siqian He, Qingliang Li, et al 2021 “PubChem in 2021: New Data Content and Improved Web Interfaces.” Nucleic Acids Research 49 (D1): D1388–95 https://doi.org/10.1093/nar/gkaa971 Lai, Eric C 2002 “Micro RNAs Are Complementary to 3′ UTR Sequence Motifs That Mediate Negative Post-Transcriptional Regulation.” Nature Genetics 30 (4): 363–64 https://doi.org/10.1038/ng865 Lebuhn, Michael, and Anton Hartmann 1993 “Method for the Determination of Indole-3-Acetic Acid and Related Compounds of l-Tryptophan Catabolism 46 in Soils.” Journal of Chromatography A 629 (2): 255–66 https://doi.org/10.1016/0021-9673(93)87039-O Leray, Matthieu, Nancy Knowlton, Shian-Lei Ho, Bryan N Nguyen, and Ryuji J Machida 2019 “GenBank Is a Reliable Resource for 21st Century Biodiversity Research.” Proceedings of the National Academy of Sciences 116 (45): 22651–56 https://doi.org/10.1073/pnas.1911714116 Lone, Bilal Ahmad, Shibendra Kumar Lal Karna, Faiz Ahmad, Nerina Shahi, and Yuba Raj Pokharel 2018 “CRISPR/Cas9 System: A Bacterial Tailor for Genomic Engineering.” Genetics Research International 2018 (September): 1–17 https://doi.org/10.1155/2018/3797214 Makarova, Kira S., Daniel H Haft, Rodolphe Barrangou, Stan J J Brouns, Emmanuelle Charpentier, Philippe Horvath, Sylvain Moineau, Francisco J M Mojica, Yuri I Wolf, Alexander F Yakunin, et al 2011 “Evolution and Classification of the CRISPR–Cas Systems.” Nature Reviews Microbiology (6): 467–77 https://doi.org/10.1038/nrmicro2577 Makarova, Kira S., Daniel H Haft, Rodolphe Barrangou, Stan JJ Brouns, Emmanuelle Charpentier, Philippe Horvath, Sylvain Moineau, Francisco JM Mojica, Yuri I Wolf, and Alexander F Yakunin 2011 “Evolution and Classification of the CRISPR–Cas Systems.” Nature Reviews Microbiology (6): 467–77 Mano, Y., and K Nemoto 2012 “The Pathway of Auxin Biosynthesis in Plants.” Journal of Experimental Botany 63 (8): 2853–72 https://doi.org/10.1093/jxb/ers091 Martín, L 1995 “Cloning and Sequencing of the Pac Gene Encoding the Penicillin G Acylase of Bacillus Megaterium ATCC 14945.” FEMS Microbiology Letters 125 (2–3): 287–92 https://doi.org/10.1016/0378-1097(94)00510-X Maxam, A M, and W Gilbert 1977 “A New Method for Sequencing DNA.” Proceedings of the National Academy of Sciences 74 (2): 560–64 https://doi.org/10.1073/pnas.74.2.560 Metzker, Michael L 2010 “Sequencing Technologies — the next Generation.” Nature Reviews Genetics 11 (1): 31–46 https://doi.org/10.1038/nrg2626 Mignardi, Marco, and Mats Nilsson 2014 “Fourth-Generation Sequencing in the Cell and the Clinic.” Genome Medicine (4): 31 https://doi.org/10.1186/gm548 Minas, Konstantinos, Neil R McEwan, Charles Jamie Newbold, and Karen P Scott 2011 “Optimization of a High-Throughput CTAB-Based Protocol for the Extraction of QPCR-Grade DNA from Rumen Fluid, Plant and Bacterial Pure Cultures.” FEMS Microbiology Letters 325 (2): 162–69 https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2011.02424.x 47 Moriya, Y., M Itoh, S Okuda, A C Yoshizawa, and M Kanehisa 2007 “KAAS: An Automatic Genome Annotation and Pathway Reconstruction Server.” Nucleic Acids Research 35 (Web Server): W182–85 https://doi.org/10.1093/nar/gkm321 Nascimento, Francisco X., Anabel G Hernández, Bernard R Glick, and Márcio J Rossi 2020a “Plant Growth-Promoting Activities and Genomic Analysis of the Stress-Resistant Bacillus Megaterium STB1, a Bacterium of Agricultural and Biotechnological Interest.” Biotechnology Reports 25 (March): e00406 https://doi.org/10.1016/j.btre.2019.e00406 ——— 2020b “Plant Growth-Promoting Activities and Genomic Analysis of the Stress-Resistant Bacillus Megaterium STB1, a Bacterium of Agricultural and Biotechnological Interest.” Biotechnology Reports 25 (March): e00406 https://doi.org/10.1016/j.btre.2019.e00406 Rusk, Nicole 2011 “Torrents of Sequence.” Nature Methods (1): 44–44 https://doi.org/10.1038/nmeth.f.330 Sanger, F., and A.R Coulson 1975 “A Rapid Method for Determining Sequences in DNA by Primed Synthesis with DNA Polymerase.” Journal of Molecular Biology 94 (3): 441–48 https://doi.org/10.1016/0022-2836(75)90213-2 Schadt, E E., S Turner, and A Kasarskis 2010 “A Window into ThirdGeneration Sequencing.” Human Molecular Genetics 19 (R2): R227–40 https://doi.org/10.1093/hmg/ddq416 Shao, Jiahui, Shuqing Li, Nan Zhang, Xiaoshuang Cui, Xuan Zhou, Guishan Zhang, Qirong Shen, and Ruifu Zhang 2015a “Analysis and Cloning of the Synthetic Pathway of the Phytohormone Indole-3-Acetic Acid in the PlantBeneficial Bacillus Amyloliquefaciens SQR9.” Microbial Cell Factories 14 (1): 130 https://doi.org/10.1186/s12934-015-0323-4 ——— 2015b “Analysis and Cloning of the Synthetic Pathway of the Phytohormone Indole-3-Acetic Acid in the Plant-Beneficial Bacillus Amyloliquefaciens SQR9.” Microbial Cell Factories 14 (1): 130 https://doi.org/10.1186/s12934-015-0323-4 Shao, Jiahui, Yucong Li, Zunfeng Li, Zhihui Xu, Weibing Xun, Nan Zhang, Haichao Feng, Youzhi Miao, Qirong Shen, and Ruifu Zhang 2021 “Participating Mechanism of a Major Contributing Gene YsnE for Auxin Biosynthesis in Bacillus Amyloliquefaciens SQR9.” Journal of Basic Microbiology 61 (6): 569–75 https://doi.org/10.1002/jobm.202100098 Shendure, Jay, and Hanlee Ji 2008 “Next-Generation DNA Sequencing.” Nature Biotechnology 26 (10): 1135–45 https://doi.org/10.1038/nbt1486 Sorek, Rotem, C Martin Lawrence, and Blake Wiedenheft 2013 “CRISPRMediated Adaptive Immune Systems in Bacteria and Archaea.” Annual Review of Biochemistry 82: 237–66 48 Spartz, Angela K., and William M Gray 2008 “Plant Hormone Receptors: New Perceptions.” Genes & Development 22 (16): 2139–48 https://doi.org/10.1101/gad.1693208 Suga, Ken-Ich, Yoichiro Shiba, Tomoko Sorai, Suteaki Shioya, and Fumihiro Ishimura 1990 “Reaction Kinetics and Mechanism of Immobilized Penicillin Acylase from Bacillus Megaterium.” Annals of the New York Academy of Sciences 613 (1 Enzyme Engine): 808–15 https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1990.tb18269.x Sugawara, Satoko, Shojiro Hishiyama, Yusuke Jikumaru, Atsushi Hanada, Takeshi Nishimura, Tomokazu Koshiba, Yunde Zhao, Yuji Kamiya, and Hiroyuki Kasahara 2009 “Biochemical Analyses of Indole-3-AcetaldoximeDependent Auxin Biosynthesis in Arabidopsis.” Proceedings of the National Academy of Sciences 106 (13): 5430–35 https://doi.org/10.1073/pnas.0811226106 Tivendale, Nathan D., John J Ross, and Jerry D Cohen 2014 “The Shifting Paradigms of Auxin Biosynthesis.” Trends in Plant Science 19 (1): 44–51 https://doi.org/10.1016/j.tplants.2013.09.012 Vary, Patricia S., Rebekka Biedendieck, Tobias Fuerch, Friedhelm Meinhardt, Manfred Rohde, Wolf-Dieter Deckwer, and Dieter Jahn 2007 “Bacillus Megaterium—from Simple Soil Bacterium to Industrial Protein Production Host.” Applied Microbiology and Biotechnology 76 (5): 957–67 https://doi.org/10.1007/s00253-007-1089-3 Wei, Chuanxian, Jiyong Liu, Zhongsheng Yu, Bo Zhang, Guanjun Gao, and Renjie Jiao 2013 “TALEN or Cas9–Rapid, Efficient and Specific Choices for Genome Modifications.” Journal of Genetics and Genomics 40 (6): 281–89 Wiedenheft, Blake, Samuel H Sternberg, and Jennifer A Doudna 2012 “RNAGuided Genetic Silencing Systems in Bacteria and Archaea.” Nature 482 (7385): 331–38 Won, Christina, Xiangling Shen, Kiyoshi Mashiguchi, Zuyu Zheng, Xinhua Dai, Youfa Cheng, Hiroyuki Kasahara, Yuji Kamiya, Joanne Chory, and Yunde Zhao 2011a “Conversion of Tryptophan to Indole-3-Acetic Acid by TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASES OF ARABIDOPSIS and YUCCAs in Arabidopsis.” Proceedings of the National Academy of Sciences 108 (45): 18518–23 https://doi.org/10.1073/pnas.1108436108 ——— 2011b “Conversion of Tryptophan to Indole-3-Acetic Acid by TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASES OF ARABIDOPSIS and YUCCAs in Arabidopsis.” Proceedings of the National Academy of Sciences 108 (45): 18518–23 https://doi.org/10.1073/pnas.1108436108 Xie, Baoen, Ke Xu, Hong Xin Zhao, and San Feng Chen 2005 “Isolation of Transposon Mutants from Azospirillum Brasilense Yu62 and 49 Characterization of Genes Involved in Indole-3-Acetic Acid Biosynthesis.” FEMS Microbiology Letters 248 (1): 57–63 https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.05.020 Zdunek-Zastocka, Edyta 2008 “Molecular Cloning, Characterization and Expression Analysis of Three Aldehyde Oxidase Genes from Pisum Sativum L.” Plant Physiology and Biochemistry 46 (1): 19–28 https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2007.09.011 Zhang, Pengfan, Tao Jin, Sunil Kumar Sahu, Jin Xu, Qiong Shi, Huan Liu, and Yayu Wang 2019 “The Distribution of Tryptophan-Dependent Indole-3Acetic Acid Synthesis Pathways in Bacteria Unraveled by Large-Scale Genomic Analysis.” Molecules 24 (7): 1411 https://doi.org/10.3390/molecules24071411 Zhao, Yunde 2010 “Auxin Biosynthesis and Its Role in Plant Development.” Annual Review of Plant Biology 61 (1): 49–64 https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042809-112308 Zhao, Yunde, Sioux K Christensen, Christian Fankhauser, John R Cashman, Jerry D Cohen, Detlef Weigel, and Joanne Chory 2001 “A Role for Flavin Monooxygenase-Like Enzymes in Auxin Biosynthesis.” Science 291 (5502): 306–9 https://doi.org/10.1126/science.291.5502.306 50