Tuyển chọn và đánh giá một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây mã đề (plantago major)

HỌC VIỆN NÔNG NGIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY MÃ ĐỀ (Plantago major) Sinh viên thực : ĐOÀN THỊ ĐẶNG HÀ Mã sinh viên : 620386 Lớp : K62-CNSHA Giáo viên hƣớng dẫn : PGS TS NGUYỄN VĂN GIANG Hà Nội, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thực dƣới hƣớng dẫn PGS TS Nguyễn Văn Giang Tôi xin cam đoan kết số liệu nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đƣợc ghi rõ nguồn gốc phân tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Đoàn Thị Đặng Hà i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực khóa luận Bộ môn Công nghệ vi sinh, xin chân thành cảm ơn quan tâm, giúp đỡ thầy, giáo, cán phịng thí nghiệm Bộ môn nhƣ khoa Công nghệ sinh học truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm vô quý báu suốt quãng thời gian thực khóa luận Tơi xin đặc biệt cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Giang tận tình bảo hƣớng dẫn tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh tồn thể cán Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh, anh chị bạn giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi thực tốt khóa luận Cuối xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ, anh chị, ngƣời thân yêu động viên, tạo điều kiện cho suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Đoàn Thị Đặng Hà ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN x PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.2.1 Ý nghĩa khoa học 1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.3 Nội dung nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn nội sinh 2.2.1 Nguồn vi khuẩn nội sinh 2.2.2 Vai trò vi khuẩn nội sinh 2.2 Tổng quan mã đề 2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh có khả kích thích sinh trƣởng trồng giới nƣớc 2.3.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh có khả kích thích sinh trƣởng trồng giới 2.3.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh có khả kích thích sinh trƣởng trồng Việt Nam 10 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu, vật liệu, địa điểm nghiên cứu 13 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 13 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 13 iii 3.1.3 Hóa chất 13 3.1.4 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 14 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Thu nhận bảo quản mẫu 14 3.2.2 Phân lập chủng vi khuẩn từ mã đề 14 3.2.3 Phƣơng pháp nhuộm Gram 15 3.2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào 15 3.2.5 Khảo sát khả phân giải phosphate khó tan 16 3.2.6 Xác định khả sinh siderophore 16 3.2.7 Khảo sát số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 17 3.2.8 Phƣơng pháp khảo sát khả sinh IAA 19 3.2.9 Phƣơng pháp xác định khả phân giải phosphate khó tan chủng vi khuẩn 20 3.2.10 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ, thời gian, pH tới khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 21 3.2.11 Khảo sát số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng tới khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 22 PHẦN IV KẾT QUẢ 23 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn nội sinh từ mã đề 23 4.2 Khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn nội sinh phân lập đƣợc 24 4.3 Khả đối kháng chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh Clavibacter michiganensis 26 4.4 Sàng lọc chủng vi khuẩn nội sinh có khả tổng hợp IAA, phân giải phosphate khó tan sinh siderophore 28 4.4.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả sinh IAA 28 4.4.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả phân giải phosphate khó tan 30 4.4.3 Sàng lọc khuẩn có khả sinh siderophore 33 4.5 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy dinh dƣỡng đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 iv 4.5.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 4.5.2 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn cacbon, nitơ tới khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 38 4.6 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phản ứng hóa sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn 41 4.6.1 Kết nhuộm Gram hình thái tế bào chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn 41 4.6.2 Khả di động 42 4.6.3 Phản ứng Catalase 42 4.6.4 Khả biến dƣỡng Citrate 43 4.6.5 Phản ứng MR 43 4.7 Kết định danh chủng vi khuẩn nội sinh TC9.2 phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rRNA 44 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 55 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn phân lập 25 Bảng 4.2 Tƣơng quan giá trị OD530nm với nồng độ IAA (µg/ml) 28 Bảng 4.3 Tƣơng quan giá trị OD820nm nồng độ PO43- 31 Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 41 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cây bơng mã đề Hình 4.1 Kết phân lập 23 Hình 4.2 Một số khuẩn lạc sau đƣợc làm môi trƣờng NA 24 Hình 4.3 Kết đối kháng chủng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh Clavibacter michiganensis 27 Hình 4.4 Đồ đƣờng chuẩn IAA 28 Hình 4.5 Hàm lƣợng IAA sinh tổng hợp chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 29 Hình 4.6 Khả phân giải phosphate khó tan số chủng vi khuẩn nội sinh đƣợc phân lập 30 Hình 4.7 Đƣờng chuẩn thể tƣơng quan số OD820nm nồng độ PO43- 32 Hình 4.8 Khả phân giải phosphate chủng vi khuẩn 32 tuyển chọn 32 Hình 4.9 Hàm lƣợng phosphate chủng vi khuẩn phân giải 33 Hình 4.10 Khả sinh siderophore số chủng vi khuẩn nội sinh 34 Hình 4.11 Hàm lƣợng IAA (μg/ml) chủng vi khuẩn tuyển chọn theo thời gian 35 Hình 4.12 Hàm lƣợng IAA (µg/ml) đƣợc đo theo pH chủng vi khuẩn tuyển chọn 36 Hình 4.13 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 37 Hình 4.14 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh IAA bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 Hình 4.15 Ảnh hƣởng nguồn nito tới khả sinh IAA bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 Hình 4.16 Khả di động chủng vi khuẩn tuyển chọn 42 Hình 4.17 Phản ứng catalase chủng vi khuẩn tuyển chọn 42 vii Hình 4.18 Khả sử dụng citrate chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 Hình 4.19 Phản ứng MR 44 Hình 4.20 Kết so sánh trình tự nucleotide chủng TC9.2 Genbank .46 Hình 4.21 Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn nội sinh TC9.2 46 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết đầy đủ Từ viết tắt µl Microliter ml Mililiter mg Miligram µg Microgram NA CAS LB CMC NBRIP IAA Nutrient Agar Chorome Azurol S Luria and Bertani Carboxymethyl cellulose National Botanical Research Institute's phosphate growth medium Indole -3 – acetic acid ĐC Đối chứng OD Optical Density (Mật độ quang) DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid NXB Nhà xuất ix Hình 4.20 Kết so sánh trình tự nucleotide chủng TC9.2 Genbank Cây phân loại đƣợc dựng theo phƣơng pháp Neighbor- joining phần mềm MegaX, số bootstrap ghi đầu nhánh cho thấy nức độ tin cậy cao Hình 4.21 Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn nội sinh TC9.2 46 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập đƣợc 31 chủng vi khuẩn nội sinh từ mã đề, 31 chủng có khả sinh IAA, 23 chủng sinh siderophore, chủng có khả hịa tan phosphate khó tan chủng có khả đối kháng với chủng vi khuẩn Clavibacter michiganensis gây bệnh thối loét cà chua TT12.1, KT1, KT12, KT16, KT17, KT18, CB2 Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn TC9.2, TT7.1, TT8, TT11 vừa có khả sinh tổng hợp IAA cao nhất, vừa có khả phân giải phosphate khó tan, vừa sinh tổng hợp siderophore Điều kiện ni cấy tối ƣu để bốn chủng vi khuẩn TC9.2, TT7.1, TT8, TT11 tổng hợp IAA nhiều sau ngày nuôi cấy nhiệt độ 30ºC pH môi trƣờng Chủng TC9.2 có khả sinh tổng hợp IAA trội chủng tuyển chọn Đã lựa chọn đƣợc nguồn cacbon nitơ tốt cho sinh trƣởng sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn D- glucose, maltose, fructose, lactose, peptone cao nấm men Chủng vi khuẩn TC9.2 đƣợc xác định có quan hệ gần với lồi Enterobacter tabaci strain YIM Hb-3 dựa phân tích so sánh trình tự 16S rRNA, đƣợc đặt tên Enterobacter tabaci strain TC9.2 5.2 Kiến nghị - Tiến hành đánh giá khả kích thích sinh trƣởng thực vật chủng TC9 - Sử dụng chủng TC9.2, TT11 để sản xuất phân vi sinh điều kiện phịng thí nghiệm 47 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt Cao Ngọc Điệp Nguyễn Thành Dũng (2010) Đặc tính vi khuẩn nội sinh phân lập từ khóm trồng đất phèn Vĩnh Thuận tỉnh Kiên Giang Tạp chí khoa học 2010, số 15a, trang 54-63 Cao Ngọc Điệp Phan Thị Nhã (2011) Phân lập xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh khóm (Ananas comosus L) trồng đất phèn thị xã Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang Tạp trí khoa học công nghệ Đỗ Kim Nhung, Vũ Thành Công (2011) Khảo át khả sinh tổng hợp IAA cố định đạm vi khuẩn Gluconacrtobacteria sp Và Azospirillum sp đƣợc phân lập từ mía Tạp chí Khoa học trƣờng Đại học Cần Thơ 161- 167 Lê Nhƣ Kiều, Trần Quang Minh, Lê Thị Thanh Thủy Nguyễn Văn Huân (2010) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng Ralstonia solanacaerum gây bệnh héo xanh lạc vừng Tạp chí khoa học cơng nghệ tập 48, số 3, 2010, trang 33- 42 Lƣơng Đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Lƣơng Thị Hồng Hiệp Cao Ngọc Điệp (2011) Phân lập nhận diện vi khuẩn cúc xuyến chi (Wedelia trilobata (L) Hitche) kỹ thuật PCR Tạp chí khoa học, 18a, 168- 176 Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Thị Hải Lý (2012) Phân lập dịng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột Tạp chí Khoa học 2012:21a 37-44 Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng (2006) Vi sinh vật Nxb Giáo dục Nguyễn Thị Thúy Nga (2015) Phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn nội sinh tạo chất kích thích sinh trƣởng indole- 3- acetic acid (IAA) đối kháng nấm gây bệnh thối rễ thơng Tạp chí khoa học Lâm nghiệp 3/2015 (3948- 3959) 48 10.Nguyễn Thu Hà, Hà Thanh Toàn, Cao Ngọc Điệp (2009) Phân lập đặc tính dòng vi khuản nội sinh số cỏ chăn ni Tạp chí Cơng nghệ Sinh Học 7(2):241- 250, 2009 11.Nguyễn Thu Hằng Đặng Thị Ngọc Thanh (2016) Phân lập, xác định đặc tính nhận diện vi khuẩn nội sinh mía (Saccharum Officinarum L.) trồng tỉnh Tây Ninh Tạp chí Khoa học Đại học Sài Gòn Số 12 (37) Tháng 2/2016 12.Nguyễn Thu Trang, Trần Thị Thúy Hà, Nguyễn Xuân Trƣờng , Nguyễn Văn Giang (2018) Phân lập khảo sát số đặc điểm sinh học chugnr vi khuẩn nội sinh rễ hồ tiêu Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(95)/2018 13.Nguyễn Văn Giang, Trần Thị Đào, Trịnh Thị Thúy An (2016) Phân lập đánh giá đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ nha đam (Aloe vera) Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 5: 772778 14 Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Thanh Mai, Phạm Hƣơng Sơn, Phạm Thế Hải (2017) Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải lân từ đất trồng sâm Ngọc Linh Quảng Nam Tạp cí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam- số 2(75), 2017 15.Trần Thanh Phong (2012) Đánh giá khả cố định đạm vi khuẩn nội sinh đến suất chất lƣợng trái khóm trồng huyện Tân Phƣớc, tỉnh Tiền Giang 16 Trần Thị Tuyết Nguyễn Văn Giang (2017) Phân lập đánh giá số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ nghệ (Curcuma longa L.) 17 Trần Trọng Hiếu, Nguyễn Hữu Hiệp (2016) Phân lập khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh trinh nữ (Mimosa pudica L.) tỉnh Trà Vinh Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ Tập số 46 trang: 23-29 49 18.Văn Thị Phƣơng Nhƣ Phân lập khảo sát đặc tính chủng vi khuẩn nội sinh lúa trồng đất tỉnh Phú Yên Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học.Bộ Giáo dục Đào tạo trƣờng Đại học Cần Thơ B Tài liệu Tiếng Anh Ames, B.N (1996) Assay of Onorganic Phosphate, total phosphate and phosphateses Methods in Enzymology, 8, 115- 118 Ananya Mukherjee, Puja Bhattacharjee, Rituparna Das, Arundhati Pal Amal K Paul (2017) Endophytic bacteria with plant growth promoting abilities from Ophioglossum reticulatum L AIMS Microbiol 2017; 3(3): 596–612 Azevedo JL Maccheroni J Jr Pereira O Ẩ WL (2000) Endophytic microorganisms: a review on insect control and recent advances on tropical plants Electr J Boitech 3: 40- 65 Baby Joseph and R Mini Priya (2011) Bioactive compounds from endophytes and their potential in pharmaceutical effect: A review Am J Biochem Mol Bio 1, 291–309 doi: 10.3923/ajbmb.2011.291.309 Brain C Louden, Deniel Haarmann and Aaron M Lynne (2011) Use os Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection, J Microbiol Biol Educ, 2011; 12(1): 51- 53 Chakrapong Rangjaroen1 , Saisamorn Lumyong2,3,4, William T Sloan5 and Rungroch Sungthong (2019) Herbicide-tolerant endophytic bacteria of rice plants as the biopriming agents for fertility recovery and disease suppression of unhealthy rice seeds Rangjaroen et al BMC Plant Biology (2019) 19:580 Chen M., Lin L., Zhang Y., Sun L., An Q (2013) Genome sequence of Klebsiella oxytoca SA2 an endophytic nitrogen-fixing bacterium isolated from the pioneer grass Psammochloa villosa Genome Announc 1:e0060113 10.1128/genomeA.00601-13 50 Chung H., Park M, Madhaiyan M, Seshadri S, Song J, Cho H, Sa T (2005) Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea Soil Boil Biochem 37 (10): 1970- 1974 El-Khawas, H and Adachi, K 1999 Identification and quantification of auxins in culture media of Azospirillum and Klebsiella and their effect on rice roots Biol Fertil Soils 28: 377–381 10.Andreote Fernando Dini Thiago Gumiere, Ademir Durrer (2014) Exploring interactions of plant microbiomes Sci Agric 71, 528–539 doi: 10.1590/0103-9016-2014-0195 11.Gary Strobel, Bryn Daisy (2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products Microbiol Mol Biol Rev 67, 491–502 doi: 10.1128/MMBR.67.4.491-502.2003 12.Gary A.Strobel (2003) Endophytes as sources of bioactive products Microbes Infect 5, 535–544 doi: 10.1016/S1286-4579(03)00073X 13.Oldroyd Giles E.D., Jeremy D Murray, Philip S Poole, and J Allan Downie (2011) The Rules of Engagement in the Legume-Rhizobial Symbiosis Annu Rev Genet 45, 119–144 doi: 10.1146/annurev-genet-110410-132549 14.Glickmann E., and Y Dessaux (1995) A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indo;ic compounds produced by phytopathogenic bacteria Appl Environ Microbiol, 61(2): 793- 796 15.Godstime, O C., Enwa, F O., Augustina, J O., and Christopher, E O (2014) Mechanisms of antimicrobial actions of phytochemicals against enteric pathogens – a review J Pharm Chem Biol Sci 2, 77–85 16.Hallmann J., A Quadt-Hallmann, W F Mahaffee, and J W Kloepper (1997) Bactreial andophytes in agricultural creps Can J Microbiol 43, 895–914 doi: 10.1139/m97-131 17.Ke Zhao, Petri Penttinen, Tongwei Guan, Jing Xiao, Qiang Chen, Jun Xu, Kristina Lindström, Lili Zhang, Xiaoping Zhang & Gary A Strobel (2011) The diversity and anti-microbial activity of endophytic actinomycetes 51 isolated from medicinal plants in Panxi Plateau China Curr Microbiol 62, 182–190 doi: 10.1007/s00284-010-9685-3 18.Khan, M.S., A Zaidi, M Ahemad, M Oves and Wani, P.A (2010) Plant growth promotion by phosphate solubilising fungi—current perspective Arch.Agric SoilSci 56:73–98 19.Jalgaonwala, R E., Mohite, B V., and Mahajan, R T (2011) Natural products from plant associated endophytic fungi J Microbiol Biotechnol Res 1, 21–32 20.Joseph, B., and Priya, R M (2011) Bioactive compounds from endophytes and their potential in pharmaceutical effect: a review Am J Biochem Mol Bio 1, 291–309 doi: 10.3923/ajbmb.2011.291.309 21 Lodewyckx C, Vangronsveld J, Porteous F, Bmoore ER, Taghavi S, Mezgeay M, Van der Lelie D (2002) Endophytic bacteria and their potential applications Crit Rev Plant Sci 21:583–606 22 Lin L., Wei C., Chen M., Wang H., Li Y., Li Y., et al (2015) Complete genome sequence of endophytic nitrogen-fixing Klebsiella variicola strain DX120E Stand Genomic Sci 10:22 10.1186/s40793-015-0004-2 23 Madhusmita Borah, Pompi Das , Susanta Sarmah Pathak , Robin Chandra Boro and Madhumita Barooah (2017) Phosphate Solubilization by Endophytic Bacteria isolated from Oryza sativa Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (2017) 6(10): 2713-2721 24 Malfanova, N., Kamilova, F., Validov, S., Chebotar, V and Lugtenberg, B 2013.Is L-arabinose important for the endophytic lifestyle of Pseudomonas Arch Microbiol 195: 9-17 25 Mundt JO, Hinkle NF (1976) Bacteria within ovules and seeds Appl Environ Microbiol 32:694– 698 26 Patel, H.A., Patel, R.K., Khristi, S.M., Parikh, K and Rajendran, G 2012 Isolation and characterization of bacterial endophytes from Lycopersiconesculentum plant and their plant growth promoting characteristics Nepal J Biotech., 2: 37–52 52 27 Rengel, Z., and Marschner, P 2005 Nutrient availability and management in the rhizosphere: exploiting genotypic differences New Phytol 168:305–312 28 Richardson, A., 2001 Prospect for using soil microorganisms to improve the acquisition of phosphorous by plants Aust J Plant Physiol 28:897–906 29 Samiksha Joshi , Ajay Veer Singh and Birendra Prasad (2018) Enzymatic Activity and Plant Growth Promoting Potential of Endophytic Bacteria Isolated from Ocimum sanctum and Aloe vera International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences ISSN: 2319-7706 Volume Number 06 (2018) 30.Sang Hye Ji , Mayank Anand Gururani , Se-Chul Chun (2014) Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars Microbiol Res 2014; 169 : 83–98 31.Shwyn B And Neilands, J.B (1987) Universal chemical assay for the detection and determination of siderophore, Analytical Biochemistry, 160, 47-56 32.Thamizhvendan, R., Yu, Y.J., Lee, S.H and Rhee, Y.H 2010.Diversity of endophytic bacteria in ginseng and their potential for plant growth promotion J Microbiol., 48: 559–565 33 Turner Thomas R, Euan K James & Philip S Poole (2013) The plant microbiome Genome Biol 14:209 doi: 10.1186/gb-2013-14-6-209 34.Zhao, J., Shan, T., Mou, Y., and Zhou, L (2011a) Plant-derived bioactive compounds produced by endophytic fungi Mini Rev Med Chem 11, 159– 168 doi: 10.2174/138955711794519492 35.Zhao, J., Zhou, L., Wang, J., Shan, T., Zhong, L., Liu, X., et al (2011b) ―Endophytic fungi for producing bioactive compounds originally from their host plants,‖ in Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, ed A Mendez-Vilas (Badajoz: Formatex Research Center) 36.Zhu B., Chen M., Lin L., Yang L., Li Y., An Q (2012) Genome sequence of Enterobacter sp strain SP1 an endophytic nitrogen-fixing bacterium 53 isolated from sugarcane J Bacteriol 194 6963–6964 10.1128/JB.01933-12 37.Zgadzaj R., James E K., Kelly S., Kawaharada Y., de Jonge N., Jensen D B., et al (2015) A legume genetic framework controls infection of nodules by symbiotic and endophytic bacteria PLoS Genet 11:e1005280 10.1371/journal.pgen.1005280 38.Zou, K., D Binkley and Doxtader, K.G 1992 A new method for estimating gross phosphorus mineralization and immobilization rates in soils Plant Soil 147:243–250 54 PHỤ LỤC Ảnh nhuộm gram bốn chủng tuyển chọn TC9.2 TT8 TT11 TT7.1 Hình ảnh đƣờng chuẩn IAA 55 Hình ảnh đƣờng chuẩn phosphate Khảo sát khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn 56 Kết ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy ngày Kết ảnh hƣởng pH pH4 pH5 57 pH6 pH7 pH8 Kết ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 30ºC 40ºC 35ºC 45ºC 58 50ºC Kết sinh tổng hợp IAA từ nguồn cacbon, nito khác Nguồn cacbon Xyltose D- Sobitol Maltose Fructose Glucose Lactose Tinh bột 59 Nguồn nito Peptone Cao nấm men NH4Cl KNO3 (NH4)2HPO4 NH4NO3 60