Khóa luận tốt nghiệp giải trình tự và phân tích đặc điểm quy định tổng hợp anthocyanin của gen rc ở giống lúa nếp cẩm tuyên quang

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -🕮🕮 - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM QUY ĐỊNH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN CỦA GEN Rc Ở GIỐNG LÚA NẾP CẨM TUYÊN QUANG HÀ NỘI – 09/2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -🕮🕮 - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM QUY ĐỊNH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN CỦA GEN Rc Ở GIỐNG LÚA NẾP CẨM TUYÊN QUANG Sinh viên thực : Bùi Phương Thảo Lớp : K62CNSHB Mã SV : 620542 Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Quốc Trung HÀ NỘI – 09/2021 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan khóa luận hồn thiện tìm tịi nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn ThS Nguyễn quốc Trung, khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Em xin cam đoan số liệu, hình ảnh kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực Các thơng tin, tài liệu tham khảo luận văn ghi rõ nguồn gốc Em xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng nhà trường Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Bùi Phương Thảo i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, ngồi cố gắng thân, em nhận nhiều quan tâm cá nhân tập thể, em xin gửi lời cảm ơn chân thành Lời em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giảng viên ThS Nguyễn Quốc Trung- Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ sinh học ứng dụng - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tâm huyết, tận tình giúp đỡ hướng dẫn em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên khác làm luận văn Trung tâm Nghiên cứu Thực vật Quốc tế Việt Nam Nhật Bản Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam người động viên, hướng dẫn truyền cảm hứng cho em suốt thời gian học tập Cuối em xin gửi tới gia đình, bạn bè tập thể lớp K62CNSHB lời cảm ơn tình cảm chân thành Mặc dù cố gắng để hồn thành Khóa luận tốt nghiệp cách hoàn chỉnh Tuy nhiên, số hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm thực tế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót mà thân chưa thấy Em mong góp ý q Thầy, Cơ giáo để khóa luận hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Bùi Phương Thảo ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT viii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự tiến hóa hóa giống lúa 2.1.1 Nguồn gốc lúa 2.1.2 Những xác định đại nguồn gốc lúa trồng Châu Á 2.2 Tổng quan gen Rc 12 2.2.1 Các nghiên cứu gen Rc 12 2.2.2 Anthocyanin 14 2.2.3 Ứng dụng Anthocyanin 17 2.2.4 Nghiên cứu gen kiểm soát tổng hợp anthocyanin 19 2.3 Đa dạng nguồn gen lúa Việt Nam 20 2.4 Đa dạng nguồn gen lúa màu Việt Nam 22 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu 25 3.2 Địa điểm 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu 25 iii 3.3.1 Phương pháp 25 3.4 Phương pháp phân tích trình tự 29 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết giải trình tự đoạn gen Rc 30 4.1.1 Thiết kế đoạn mồi để giải trình tự 30 4.1.2 Kết giải trình tự đoạn gen Rc 31 4.2 Sự liên kết gen Rc hoàn chỉnh 32 4.3 Xác định exon/intron, vùng UTR gen Rc 34 4.4 Sự đoạn 14 base 35 4.5 Cây phát sinh loài 39 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bHLH Chuỗi xoắn – vòng – xoắn ốc DFR Dihydroflavonol‐4‐reductase FNP Đa hình chức nucleotide PCR Chuỗi phản ứng pholymerase SNP Đa hình đơn nucleotide v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thống kê nguồn gen lúa gạo màu theo vùng sinh thái 24 Bảng 3.1: Thành phần chạy phản ứng PCR 27 Bảng 3.2: Nhiệt độ gắn mồi mồi 28 Bảng 4.1: Danh sách 34 gen Rc NCBI 36 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Lịch sử tiến hóa lồi lúa trồng (Chang) Hình 2.2: Cấu trúc anthocyanidin anthocyanin 16 Hình 3.1: Giống lúa nếp cẩm Tuyên Quang 25 Hình 4.1: Kết kiểm tra ADN tổng số giống Nếp cẩm Tuyên Quang 30 Hình 4.2: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân dòng đoạn gen Rc 31 Hình 4.3: Một phần kết giải trình tự gen thể qua Chromas 32 Hình 4.4: So sánh trình tự gen lúa Nếp cẩm TQ với trình tự gen 34 giống lúa có gen Rc khác 37 Hình 4.5: Hình ảnh SNP phân nhóm haplotypes 35 giống 39 Hình 4.6: Sơ đồ phát sinh loài lúa Nếp Cẩm Tuyên Quang với 34 giống lúa có gen Rc khác 40 vii TÓM TẮT Nếp cẩm loại vơ đặc biệt, màu sắc không màu đen tuyền mà giống màu tím đen, màu sắc gặp giới thực phẩm Màu tím thẫm tạo dư thừa anthocyanin mà Rc gen điều tiết quan trọng đường tích lũy proanthocyanidin lớp vỏ cám gạo Một nghiên giải trình tự phân tích đặc điểm di truyền gen Rc quy định tổng hợp anthocyanin cung cấp chứng để hiểu tiến hóa giống Nếp cẩm Tuyên Quang Trong nghiên cứu này, 18 cặp mồi sử dụng để khuếch đại trước nhân dịng giải trình tự Gen Rc từ giống Nếp cẩm Tuyên Quang lắp ráp chỉnh thành công phần mềm BioEdit với 7888 bp, phát gen Rc chứa intron exon Phân tích trình tự tiết lộ đoạn 14 bp intron thứ sáu cách so sánh với 34 giống lúa điển hình giới phát 55 SNP gen Rc Tiếp theo, phân tích phát sinh lồi chúng tơi thấy Nếp cẩm Tun Quang có liên quan chặt chẽ với giống Bengkongang Indonesia Trong nghiên cứu này, trình tự đầy đủ gen Rc từ giống Nếp cẩm Tuyên Quang lưu trữ liệu sơ để nghiên cứu biến đổi trình tự gen q trình hóa Việt Nam viii CGTCACGAGCAGCCGCCCGGGCGCCATCGGCGGCGGCCGCCGGGAGGCGGAGGAAGAGATCCGCCGCCGCCGCCA CTGCCACGGCGGCGGAAGGGATGAGCAGCAGCAATGGCCGCAATGGCGGCGAGGCGGCGGAGGTGGTGCAGGTGT CCATCATCGAGAGCGACGCGCTGCTGGAGCTCCGGTGCGGTTGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGTGGTGCTGCTCC GGGTGATGCAGGCGATGCAGGAGCTCCAGCTGGAGGTCACCGCCGTCCAGGCCTCGTGCGCCGGTGGCGAGCTGC TCGCCGAGCTGCGCGCCAAGGTCGTCGTTATGATCCTGATCTGCATGAAAATGCAAATGCAAATGCAAATGCAGA ATTAAGCTTTCATTCTTGCTCCTCTGAATTCTGAATTTATATATTCACCCTTCTTTCGATCTGCTCGTACGTTCG TTTCGCCTAAATTATGTACAAATTAACTGAATCTTTGAACTGAAAATAACTGAATCTTTTTTGTGTGTTTTTGTG TGGGTGAATTGGTTGGCGCAGGTGAAGGGGAGGAGGAGGAGCAGCATCGCTCAGGTGAAGAGGGCCATCCATCTC GTCCTCTCCTCCTCATCGATATGCTCGTCCCTTTTTTCTTTGCTCATGGGGATTTTTTTCCAACGGTTATATATA TAGAAAGTTCACATATATAAATCATGATAATTACCTTTTAGAAAATTCAAACAAAGAATCGATATATATAGTTCT ATCTATGCATCATTTTCCTAAATCACGATAATTACCTCAAGCTTGATAAAATGGCATTACATTACTATTATTATT ACTAGAGTTTTTTCACTTCCCTGATCTAACCAATTTGCCACGATGGTTAGATATATAGATGGTTCTAATTAATCT AATGTTAATGTACTCCACATATATGATATATGTACATACATATCTAGTTTTAACATTTGCAAATGAATTGCAATC AGAATATATATATGCATGCAGCACAGGTGCTTGATTGCAATTATATGATTATTACTCTCTCACATATTGATATGG TAAATTTGTATATATTTGTGGCATGCATTCATGCACGAAGCTAGATTAATTATTAATTAATTCAGGGTGATATCG ATGAGGAGGAGAGGACGAGATGGATGGCCCTCTTCACCTGAGCGATGCTGCTCCTCCTCCTCCCCTTCACCTGCG CCAACCAATTCACCCACACAAAAACACACAAAAAAGATTCAGTTATTTTCAGTTCAAAGATTCAGTTAATTTTAC ATTATTGAATCGG Chuỗi gen Rc từ giống Nếp cẩm Tuyên Quang ghép hồn chỉnh so sánh với trình tự tham chiếu Oryza sativa với số gia nhập KX549256 Sự tương đồng gen Rc nếp cẩm Tuyên Quang với trình tự tham chiếu quan sát lên đến 99% Đoạn gen giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang ghép hồn chỉnh có chiều dài lớn gen Rc khác khoảng 1kb Các gen Rc khác thường có chiều dài 6,4kb đến 6,9kb 4.3 Xác định exon/intron, vùng UTR gen Rc Trong loại gạo khác, gen Rc phân tích cấu trúc mơ hình intron-exon Mã hóa gen Rc cho protein bHLH lần giải trình tự Furukawa cộng sự., 2006 sau Li cộng sự., 2014, với exon intron Mơ hình intron-exon giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang vẽ phần mềm GSDS2.0 Gen phân tích có kết bao gồm intron exon kết Furukawa cộng (2006) intron exon 34 Cấu trúc intron-exon lúa Nếp cẩm Tuyên Quang : intron : exon : UTR Việc xác định intron trình tự gen thực nhờ intron điển hình có trình tự bắt đầu 5’-GU kết thúc AG- 3’ Tuy vậy, thực tế dấu hiệu này, việc cắt bỏ intron cịn cần trình tự khác vùng nối intron exon UTR vùng không dịch mã xác định 4.4 Sự đoạn 14 base Gen Rc Nếp cẩm Tuyên Quang hoàn chỉnh đem so sánh chỉnh với 34 gen Rc khác để xác định vị trí đoạn cách sử dụng phần mềm BioEdit 34 giống gồm 22 giống có vỏ lụa trắng, 12 giống có vỏ lụa màu, có nguồn gốc từ nước khác có liệu đầy đủ NCBI 35 Bảng 4.1: Danh sách 34 gen Rc NCBI Số TT Tên Mã gen NCBI Nguồn gốc Hanyangjo DQ885811.1 Korea Mudgo DQ885809.1 India Bengkongang DQ885810.1 Indonesi Kasalath DQ885812.1 India Gangdodo DQ885805.1 Korea Pae Daya Indolobye DQ885808.1 Indonesia Padi Rata DQ885806.1 Indonesia Huma gadog DQ885807.1 Indonesia Dhala Shaitta DQ885821.1 Bangladesh 10 IR64 DQ885813.1 Phillipines 11 Arias DQ885799.1 Indonesia 12 Keton Jalumpang DQ885820.1 Indonesia 13 Cuba 65 DQ885823.1 Cuba 14 ARC 10352 DQ885822.1 India 15 Dee Geo Woo Gen DQ885818.1 Taiwan 16 Arang DQ885819 Indonesia 17 Popot 165 DQ885817.1 Indonesia 18 Macan Binundok DQ885816.1 Philippines 19 Hsia Chioh Keh Tu DQ885815.1 Taiwan 20 IR DQ885814.1 Philippines 21 Koshihikari DQ885803.1 Japan 22 Nipponbare DQ885804.1 Japan 23 Asse Y Pung DQ885795.1 Philippines 24 Azucena DQ885796.1 Japan 25 Khao Hawm DQ885797.1 Thailand 26 Lemont DQ885798.1 USA (Texas) 27 Porosi DQ885800.1 Indonesia 28 Pare Pulung Cina DQ885801.1 Indonesia 29 Jefferson DQ885802.1 USA 30 Basmati DQ902352.0 Japan 31 Jefferson brown vỏ lụa and seed coat DQ204736.1 Japan 32 Surjamkuhi brown vỏ lụa and seed coat DQ204738.1 33 IRGC105491 brown vỏ lụa and seed coat DQ204737.1 34 H75 brown vỏ lụa and seed coat DQ204735.1 36 Japan Hình 4.4: So sánh trình tự gen lúa Nếp cẩm TQ với trình tự gen 34 giống lúa có gen Rc khác Trong gen Rc Nếp Cẩm Tuyên Quang có tìm thấy đoạn 14 bp xác định vị trí từ 5759 đến 5772 tổng vị trí đoạn gen Vị trí 14 bp xác định nằm exon thứ gen Phân tích tồn gen Nếp cẩm Tun Quang ta thấy chúng có kiểu gen rc, điều thể vỏ lụa giống lúa màu trắng Tuy nhiên màu vỏ lụa giống lúa thu sau gieo trồng màu tím đen Brooks cộng (2008) chứng minh biến thể vỏ lụa đỏ tự phát giống trồng Hoa Kỳ ‘Wells’ phát vào năm 2005 phát sinh thông qua đoạn 1-bp nằm phía đoạn 14-bp ban đầu; đột biến phục hồi khung đọc, chức protein lớp màng sắc tố proanthocyanidin Tương tự, Lee cộng (2009) ghi nhận xóa bp nằm phía ngược dịng 44 bp q trình xóa chức chất hồn nguyên vỏ lụa đỏ giống trồng Ý ‘Perla’ 37 Sau phân tích so sánh kĩ gen giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang nhận thấy giống lúa có đoạn 14bp khơng có xuất biến thể nghiên cứu trước Dựa vào phần mềm bioEdit Sequence Alignment chúng tơi trình tự để so sánh gen Rc Nếp cẩm Tuyên Quang với 34 trình tự tham chiếu thấy có 55 SNP, SNP vùng exon 49 SNP vùng intron gen Rc Nếp cẩm Tuyên Quang Giống lúa nhiều giống khác SNP Có thể cho SNP tạo nên khác biệt số lượng intron exon giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang Và SNP nguyên nhân làm cho lúa Nếp cẩm Tuyên Quang có kiểu gen rc có vỏ lụa màu tím đen Tác dụng biến thể, SNP phát có đóng góp vào tích tụ pro-anthocyanin Nếp cẩm đen Tuyên Quang, cần phân tích thêm trình tự axit amin phân tích chức protein Phân biệt rõ ràng tổ tiên nguồn gen, xác định SNP không ảnh hưởng đến màu sắc vỏ gạo Để phân loại nhóm haplotypes chúng tơi dùng trình tự trỉnh, chỉnh sửa Bioedit sử dụng phần mềm DNASp6 Bằng phần mềm xác định 35 giống lúa liệu chia thành 16 haplotypes khác lúa Nếp cẩm Tun Quang nằm nhóm happlotypes thứ 16 Có thể nhận thấy Hap thứ có nhiều giống lúa giống, Hap 13 có giống 38 Hình 4.5: Hình ảnh SNP phân nhóm haplotypes 35 giống 4.5 Cây phát sinh loài Để phát nguồn gốc mối quan hệ di truyền giống lúa nếp cẩm Tuyên quang với giống lúa khác, phát sinh loài xây dựng với 34 trình tự gen Rc đại diện phần mềm Mega X Trong phát sinh loài nút đại diện cho đơn vị phân loại, nút chi nhánh tương ứng với kết thúc gen Với nút tương ứng bên để suy nút nội đại diện cho tổ tiên chung 39 Hình 4.6: Sơ đồ phát sinh loài lúa Nếp Cẩm Tuyên Quang với 34 giống lúa có gen Rc khác Từ Hình 4.6 nhận thấy giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang có liên quan chặt chẽ với giống có mã gen gia nhập NCBI DQ885810.1 có tên đầy đủ NCBI “Oryza sativa (indica cultivar-group) cultivar Bengkongang Rc protein (Rc) gene” có nguồn gốc từ Indonesia Khoảng cách di truyền hiển thị khơng phân nhóm rõ ràng gạo đỏ gạo trắng Trong phát sinh lồi (Hình 4.6), xác định giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang kết gần với nhóm Oryza sativa indica Vì nhận định giống lúa Nếp Cẩm Tuyên Quang có nguồn gốc từ Nam Á Đông Nam Á 40 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong đề tài này, nghiên cứu biến đổi di truyền gen Rc giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang Việt Nam Tất 18 đoạn gen Rc giống lúa giải trình tự thành cơng Sau lắp ghép hịan chỉnh, phân tích gen xác định trình tự đoạn 14 bp exon thứ giống lúa Xác định giống lúa có kiểu gen rc chưa giải thích vỏ lụa có màu Cuối cùng, xác định nguồn gốc Nếp cẩm Tuyên Quang có nguồn gốc từ Nam Á Đơng Nam Á thơng qua phát sinh lồi 5.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn khơng thể tìm biến thể làm gen Rc giống lúa Nếp cẩm Tuyên Quang phục hồi khung đọc đẫn đến vỏ lụa mang màu tím đen nên kế hoạch tới em nghiên cứu sâu để tìm biến thể Đồng thời nghiên cứu chức gen Rc tổng hợp anthocyanin ảnh hưởng mơi trường đến hàm lượng anthocyanin q trình trồng lúa cẩm đen Tuyên Quang 41 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đới Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Hiền Nghiên cứu khai thác CSDL nguồn gen lúa gạo màu nhằm khuyến khích sử dụng Hong Tuoi, T, N., Van Cuong, P., Van Hoan, N., (2014) Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống lúa cẩm thị SSR Tạp chí Khoa học Phát Triển, (4), 485-494 Hồ Đình Hải Nguồn gốc lúa trồng Châu Á Truy cập ngày 01/8/2021 https://sites.google.com/site/kysuhodhinhhai/cay-lua-thegioi/nguon-goc-cay-lua-trong-o-chau-a Sở khoa học công nghệ Quảng Bình (2014) Khai thác phát triển nguồn gen lúa tháng năm 2014 Đới Hồng Hạnh, Nguyễn Khắc Quỳnh Nguyễn Thị Hiền ( ) Thực trạng thu thập, nhân giống mô tả đánh giá nguồn gen tập đoàn lúa cạn lưu trữ ngân hàng gen trồng Quốc gia Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam Tài liệu tiếng anh Brooks, S A., Yan, W., Jackson, A K., & Deren, C W (2008) A natural mutation in rc reverts white-rice-vỏ lụa to red and results in a new, dominant, wild-type allele: Rc-g Theoretical and Applied Genetics, 117(4), 575-580.Furukawa, T., Maekawa, M., Oki, T., Suda, I., Iida, S., Shimada, H., & Kadowaki, K I (2007) The Rc and Rd genes are involved in proanthocyanidin synthesis in rice vỏ lụa The Plant Journal, 49(1), 91-102 Garris, A J., Tai, T H., Coburn, J., Kresovich, S., & McCouch, S (2005) Genetic structure and diversity in Oryza sativa L Genetics, 169(3), 16311638 42 Gross, B L., Steffen, F T., & Olsen, K M (2010) The molecular basis of white vỏ lụas in African domesticated rice: novel mutations at the Rc gene Journal of evolutionary biology, 23(12), 2747-2753 Lee, D., Lupotto, E., & Powell, W (2009) G-string slippage turns white rice red Genome, 52(5), 490-493 10 Wei, X., & Huang, X (2019) Origin, taxonomy, and phylogenetics of rice In Rice (pp 1-29) AACC International Press 11 LI, X Y., Qiang, S., SONG, X L., Kun, C A I., SUN, Y N., SHI, Z H., & DAI, W M (2014) Allele Types of Rc Gene of Weedy Rice from Jiangsu Province, China Rice Science, 21(5), 252-261 12 Oka HI 1988 Indica-japonica differentiation of rice cultivars In: Origin of cultivated rice Tokyo/Amsterdam: Japan Science Society Press/ Elsevier, 141 - 179 13 Sweeney, M T., Thomson, M J., Cho, Y G., Park, Y J., Williamson, S H., Bustamante, C D., & McCouch, S R (2007) Global dissemination of a single mutation conferring white vỏ lụa in rice PLoS genetics, 3(8), e133 14 Sweeney, M T., Thomson, M J., Pfeil, B E., & McCouch, S (2006) Caught red-handed: Rc encodes a basic helix-loop-helix protein conditioning red vỏ lụa in rice The Plant Cell, 18(2), 283-294 15 Saitoh, K., Onishi, K., Mikami, I., Thidar, K and Sano, Y (2004) Allelic diversification at the C (OsC1) locus of wild and cultivated rice: nucleotide changes associated with phenotypes Genetics, 168, 997–1007 16 Hock Eng Khoo, Azrina Azlan, Sou Teng Tang, See Meng Lim (2017) Anthocyanidins and anthocyanins: colored pigments as food, pharmaceutical ingredients, and the potential health benefits 17 Brooks, S A., Yan, W., Jackson, A K., & Deren, C W (2008) A natural mutation in rc reverts white-rice-vỏ lụa to red and results in a new, dominant, wild-type allele: Genetics, 117(4), 575-580 43 Rc-g Theoretical and Applied 18 Gross, B L., Reagon, M., HSU, S C., Caicedo, A L., Jia, Y., & Olsen, K M (2010) Seeing red: the origin of grain pigmentation in US weedy rice Molecular ecology, 19(16), 3380-3393 44 PHỤ LỤC Phụ lục1: Kết giải trình tự gen với 18 đoạn mồi Kích Mồi thước Trình tự đoạn gen (bp) AF1 AF2 AF3 AF4 AF5 593 AGGACTTACTACTAGCTCCTCACTCACTCGCCTTTACTTATCGATCTCGATCATCCACGAGC TAGCTAGCAGTGCTCGCCATGGCCGGCGGCGAGGCGCATGCGGCGCTGCAGGCGGTGGCGCA GAGCCTCCGGTGGACCTACAGCCTCCTCTGGCAGCTCTGCCCCCACCAAGGGTACCTACCCT ACCTACCTACGACACGATGCACAGTGTTCATCCATGGCCGGCCATGGCGGATCGTCGTCGTT GTCGATGATCATCGAAGGAAGCTAGAGGATATGGCTCAATACTTTGATAATATATATACTGA TCTCTCCGTACAACAAAAATATAAAAATTCTAGCTAGTATCGAATGAGACATATGCTATGCT AGTACTACGAATCTAAAAAGATGTACATATTTTGATTCGTATTATTAGGATATATCACGAGT TTTTATATTTTGAGACGGATGTAATAATTCTGAATTTAGTTGTGATCGCATGGCATAATCTC GCAGTATACTACCTATTTTTTTGCATCCTTGGAGTACGGCGAGGTCCGTATATATATGGTCA TGGTGGTGAGCGGTGTACTCTGGCTTTTTTCGTTG 541 TCGGTTCGAATGAGACATACTGCTATGCTGTACTACGAATCTAAAAAGATGTACATATTTTG ATTCGTATTATTAGGATATATCACGAGTTTTTATATTTTGAGACGGATGTAATAATTCTGAA TTTAGTTGTGATCGCATGGCATGCAGGAGCTCGCTGGTGTGGGGGGAGGGGCACTACAACGG CGCCGTCAAGACGCGGAAGTCGACGGTGATGCAGCCGCCGCCGGCGGAGGAGGAGGACGACG CCGACCACGCGGCGCGCCACCGGAGCCGGCAGCTGAGGGAGCTCTACGACTGGCTGCAGCAG GCCGGGGAGAACTCCAGCGGCGGCGTGCAGACGTCGTCGACGACGGCGAGCCGGCGGCCGGG GGCGGCTCTGTCGCCGGAGGACCTGACGGAGACGGAGTGGTTCTTCCTCATGTCGGCATCCT ACTCCTTCCCTCCCGGCATCGGGTATATAATAAAAAATATAGATATAAATATTTAAGCATGC ATGCATAAATTAAACCACACTTCTTGTTACGTGTTTTCTTGGCAA 585 AGGCGGGGGAATCCAGCGGCGGCGTGCAGACGTCGTCGACGACGGCGAGCCGGCGGCCGGGGG CGGCTCTGTCGCCGGAGGACCTGACGGAGACGGAGTGGTTCTTCCTCATGTCGGCATCCTACT CCTTCCCTCCCGGCATCGGGTATATAATAAAAAATATAGATATAAATATTTAAGCATGCATGC ATAAATTAAACCACACTTCTTGTTACGTGTTCTTGGCAAAATGATGAACAATTACCACTAATT AATTGGAGCCAGAAACCCTAAAGATTTACCCACCTGGTTAATTAATCGGTGTGTTGATCCACG CATGCATGCATGCAGAAAATCAAGATCAGGATAGCTCCTTTTCTTTTGCAGGTTAATTAGCTA GATCTTCACGTATAATTAGCTAGCTAGATTTTAAAATATAATTTATTCAATTTGATTTATGAT TTTTATTTTTTATTTCAAATAGATACAACTGTATACAAAATTTTATTTTGGTACATACCTCCG ATCCAACTACATCAGAGGTAAAAAAAAAATTAAACCGTTGGAATTGATTAGAACAAGATCGTG CGGACAGGCGGAGACTAG 570 CTTGATAGCTCCCTTTCTTTTGCAGGTTAATTAGCTAGATCTTCACGTATAATTAGCTAGCTA GATTTTAAAATATAATTTATTCAATTTGATTTATGATTTTTATTTTTTATTTCAAATAGATAC AACTGTATACAAAATTTTATTTTGGTACATACCTCCGATCCAACTACATCAGAGGTAAAAAAA AAATTAAACCGTTGGAATTGATTAGAACAAGATCGTGCGGTCAAATTATATCATAACTAACTT TTCTGATTCTCTAAAGCATAGAGATGTATATATACATCGTATTATTAGGCTCTATATTTCCTG ATTAACACTAGATGCATATATAATTTTGATAGTCAAAATATACTTTTGATAGGCTCTAAAGAA AAACTTAATAACATGTACTCCCTCCATATACTTTTGATAGTCATATTTCATCTTGACACACAG ATCAAGTATAAGTAATTCTACTTATCATCCATTTAAACACGCTACTAGTTATTCCTCATAAAC AAGCGATTCATTAATATTTACATTTCTCGATGCTTGTGTAGCCCAATATTGTGGGAAGAATGA AGA 541 CTTTTGAAGGATGTCATTAAGAGGATAGGTTGTTGGATTGAATATGCCTATCAAAAATAAATT TTTAGATTTGAAAATATGCCTATCAAAAGTAGATGGAGGGAGTATTAATTAATGTGAATTTCC AATCCTACTGTTGTGATATTAGGCTTTGTACCTTCTTGTCCAGGAGGTATATATATGGCTCTT TTAAGGATGGGAGAAAATATCATCTTTAATACAACTATATATGGCTTTTGTTTGATAAATACA ACTTTTATTTTGTATGAATACAAATATATTGATAAATATCCACCATTATAATCCTAACCCATT AGGATCATATGGTGTATATTTTTTTAACTATTTGTTTTTTATAAATTAATATTAAGAGATCAC 45 AATAAAAATATAGTATTATGAAAGTACTCTTAACAACATATCCAATGATAAAATTATTATTAT TACAAAATATAGTGGTCAAATTGTATAGAATTCAATAGCCTGATTTTATGACGTCAAGTAAAT TAAATAAAGAATGAAGGTAGTGCTAGAGTGATCAAAA AF6 AF7 AF8 AF9 AF10 AF11 543 ATAAAGAAGAAGGTAGTGCTAGAGTGATCAAACAATATCTCTCCTAAAATATGTCCTATAAGT TTTACTCCATAAATCCAAGGGTCAAAAGTTGTTGGGTTATTTTTTTAGATAATAACATACTAC CCCTTTTCAAAATGTATGATTCTATTGACTTTTTGCACAACATTTAACCATTTGTCATATTAA AAATTAGTATAAACATCTAAAAATATAAGTTACAATTATATTTTATTTGATGATAAAACAACT CACAACAAAATAAATAATATTTATATAATCTTTTTGGAATAAAACGAATGATCAAACATTATT CAAAAAGTCAATGGTATAGTACGTTTTGAAATTGATAGACTATGAGAGCAAAATTTTGAGATA ACATGGAAAATTATCCTCTTAGACATTGCACTGTGTAATAATTAATAATAATGAATGAAAGGC TAAGACTTTTCTTCCACCTTATATAAGTGGTTGAATATATAGCAATCACATCATTACATGATT TTGTAACCAACCGTCTCTATAGCTCCGATACAGTGCAAA 494 AATGGTGAATATAGCAATCAACATCATTACATGATTTTGTAACCAACCGTCTCTATAGCTCCG ATACAGTGCTAGTTTCACATCGTAATAATTAAAGAGTATAATAATAAATCGAGGTGTACTTCT CATCGATGAAGTGATGTGCCGCTTAGCTAAATTAAACTCGTATGCGAAAAATCAGTATATGTC CGGTTAATTTCTAAGAGAGAGATTGAGAGAGAATAATTGCGCCCCTCCAAATCCCCCTCTTGG ACGTTAGGGAGCTATATAGACGGTATTGCTAAGTGCGATGTGTACATAACGTACCTGTCGTAG GAACATTTCTCATCCAAATTAAGTAGTAATGCATGGCATGAAATCCATTTTTGTATTTTGCAT GGCAAAGAATGACAACAAGGAATACACTAGCTAGCCCTGCCCTTTTTCAATTTAATTTAACAT CAAACTTAGTTATTGTATTTCTTTTGTCAGAATAGCTGGCATTGCAAAATACA 568 TTTTTTGCATGGCAAAGAAAGACAACAAGGAATACACTAGCTAGCCCTGCCCTTTTTCAATTT AATTTAACATCAAAATTAGTTATTGTATTTTTTTTGTCAGAATAGCACGCATTGCATACTCTT TAAAAATAATTAATTAGTGTATTTTTCTAGTCTTACAAAAGTATCAAGAGAGACAACTAATTA TAGTTGGGGGACACCAAACTTGTTTTTAATAATGACAATTAAAACCCTACCTCTACATCCAAC ATAGACGTACATAGTCCGAAGGCGCCAAATATTTGTACATTTAGCTACCAGATTTCAGTACGA GTTCTCACATTATAATTTTGATTTTTTTATTTTTTTTATAAACAATCTGGTACCCTTTTATGT CTGGAAGGAAAAAAAAAATCTAAATTGCAACATTTTAGTCGGTGAGAATGGTACTCTGTCCTA GCTACTTTCTACACATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCCTTTAATTGCCCTTGCCCA TGCATCTTTCTTTGCACACATGTATGCTTTTCACATTGTCATGAGGAGAGAACTGTAAGCCCT T 490 ACGTGCTTTTCCAATTGTCATGAGGAGAGAACTTGTTAAGTTGCACACATGTGTGCTTTGCA TGTCTTCAGGTTACCTGGAAGGGCATTTGCAAGGAGAGGCCATGTATGGCTCACTGGAGCAA ATGAAGTTGACAGCAAAGTATTCCTAAGAGCAATTCTTGCCAAGGTTCAGCCATCACCTTCT CTTACCTATTTTTCACTCTGAATGCCAACAGTGCTTTGCACATTGTAGTCTGTTTGCAGACT GCAAATGATGACCATAATCAGATCAGAAAATAAAATAATATTATATACTTTTTGAGCCAGCT AGCAAGAATATGTAACAATAATTCTCCTTTTTTTTTCTTGTTCTTTTCCCTGATGTGGTGCA TAACAAATAACCAAACTGATGAATGGCAGAGTGCTGGTATCCAGGTATTTGCCTCTAAAAGT AGCTACACGTTTACTATGAAATTTTGTGGCTTTTGTTCATCTTTGAATGGCAGTGG 510 ACAAGAGGCAGAGTGCTGGTATCCAGGTATTTGCCTCTAAAAGTAGCTACACGTTTACTAT GAAATTTTGTGGCTTTTGTTCATCTTTGGATGCAGTGGCCATTATCTAAAAACTATGAATT TCCAGACTGCAGTTTTTATCTAATTTTGTGACTTTGTACATCAGACAGTTGTGTGCATTCC TGTTGTCGATGGCGTCCTGGAAATTGGAACTACGGAAAAGGTGATTTCGTATATTATCAGC TGACAATCTAATTATATGGGCCATATAATTAAGTATAAATCAAAATACCTCATAATATATT ATAAAGTATCTAATGTGATTATGTGAATATTGGCTATTTCAATGTAATTTGATATATGAAA CTGATAATCCTCTGAAACTCCGTAAGGATCAAACTAATCAAAATGTATATATTTTCAAGGT GGAGGAAGATATGGGCCTGATTCAGTATGCAAGGGGCATCTTCATGGATCAACATGGCATC CACATGAAGCCCTACACTCAAA 564 CATCCACATGAAGCCTACCCTCTCACAGCACTCAACATCCAACCCAGTCACCCACTGTACT CATCAGCATCCAATCCAGGTTCAGATGCAACTAGGTATCACCAGCCAAACAAAGTTTGATT ATTCAGATGAGCTCAATGCAGATGAGGAGAATGATGACACAGAAGAAGAGGGCATGTCAGG TTCAGACACTAACAACACTGACACTGAAAGGAATTCAGGCCAGCTGCAACTTCAAATGCAA GACCAACTGAACATGGTGAGCAATGACCACCAGACAATACCAAATAATGCAGTTTCCAGTG AGCTAATGCAGTGTGAGATGTCAGAAGTGGTAAGAGATGGCTGCTCAAATAATATTTTAGA GGATGAAATCCAAATGCTGATGGATTGCCAAAACAGTAATTGTCAGTTAAATTTGCAAGGG CCAGATGAGCCTTGTCACTCTTGGCATTTTCTCTGCGAGGAGTTACAAAATGATTACCAGC CAGGTATTACATTTGAGAAGATAATCCTTCAAAAGCACCCTTGTTCCATCCCTTCTCAATC TGACTCATACCCATA 46 AF12 AF13 AF14 AF15 AF16 837 TCCTATCCTGGTCTCTTGTGATTTATATGTATATTTATATTTTTTATTTATATTTTTTATATTT TTATTATTAATTTTATTATTATNTATTTATATATATATATATATATATATATNTATATATATAT TTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT ATATATATATATATATATATATATATATGTATATATATATATATATATATATATATATATATAT ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAATATATATATATA TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA TATAT 502 AGAGAGATGTTCCAGTAGTCACTGCAGTTACAGGGGAGCAGAAACACCTGAATCAAGGGGCGGG AAAGGCGCAAGTGGATGCCATCCAAGGTGATTTCAGTGCCAACCATGTGCTGAAAGAGAGGAGA AGAAGAGAGAAGCTCAATGAGAAGTTCATAATTCTGCGATCTTTGGTACCTTTCATGACAAAGG TAATTAAGTACTCCCTCTATTTCTATAAAGCCGTATTTGACTAGTTATCTTATTTAGAAAGTAT GTGCAAATATGTAAAATATAAGTCATACTTAAAGAACTTTTAATGTTATTAAATAATAAGTCAC ACCAAAAATAAAACATATATATTTTTAATAAGATAAATGATTAAATGTATATATAAAAATTAAT AGCGTCACATATTTTAAAATAGAGGGGTATTTAAGTACCCACAGGATCATCAAAATTCAGTTAT CTTTTCTTAAGCCTCTAACGAACATTGGAAGATCCTCACTAATGGGCAGCATGA 863 TTAGCCTTTTTAACGACATTGGAAGATCCTCACTAATGGCAGCATGAATCTAGGGTTCACTATT TCGGAATGCAAAATATGTTTTACCGGGCATCCGATTTTTAAAAAATTCAGAATGAAGAAAATTG AATCTTTTTTATGGATTTGAATAAATCTTGATAAATTCGAAAAAATTTCCGAACTTTTGGCCAG AAGTGAATCCTACCCGTATCCACCGGTAATAAACCTAAATTTTTGGGAGTAATGAATTAATGTT ATATATAATCCATGAATTATATAGTTCCAAACTACTCCGTAACAAATTTTCAGGAGTAGTGAAA TTAATATTATTACAATCTCAGAAAAAAATGGCAGAAACAATTAATCTGTTTTCAATTATTAATT AATTTGTTTTTGTGTCCAGATGGACAAGGCGTCGATACTAGGCGACACGATCGAGTACGTGAAG CAGCTAAGGAACCGCATACAAGAGCTCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCACGAGCAGCCGCCCGGG CGCCATCGGCGGCGGCCGCCGGGAGGCGGAGGAAGAGATCCGCCGCCGCCGCCACTGCCACGGC GGCGGAAGGGATGAGCAGCAGCAATGGCCGCAATGGCGGCGAGGCGGCGGAGGTGGTGCAGGTG TCCATCATCGAGAGCGACGCGCTGCTGGAGCTCCGGTGCGGTTGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTG TGGTGCTGCTCCGGGTGATGCAGGCGATGCAGGAGCTCCAGCTGGAGGTCACCGCCGTCCAGGC CTCGTGCGCCGGTGGCGAGCTGCTCGCCGAGCTGCGCGCCAAGGTCGTCGTTATGATCCTGATC TGCATGAAAATGCAAATGCAAATGCAAGAAT 550 GACCACACAAGGGAAAGGCTCGATTAGCATCCTTACACTTTTCTCGNAGTAGTCAATGCACTTT CAGCGGGAGCGGAAACGCCCGCATCAATGGGCGTTAATGGCATTAAGTGGGTGACCATCACAAG GCGATTTACCGTGTCGTCCATTGCTGGATGCGTAGGAGAACGCTGCAGAATCTACGAGCAAGTT CCATAATAAGCGATAGGGTGGTATCCTTTCGATAACCAAGGGAACTCGAGGACTCCCGATTATT GTCAGATAGCCGCATGAGACGTTGTTATCAGACCTAGCAACGTGTGCGCAACTATGTACTGTTA AGTCAATCTAGTTGAGCACTTAAGGCTGTGTACTAGTGACTCACCGCAGGAATTAGCGCATATG TTTTTTTCTACGGTCAATGATTATATGTATTTACACAAGTTCTTCGAGTGGCACTTTTAGATTC GCGGGGTAGTGAGGGCCACACAGCATCTTCTAACCTGACTTCTATGTAGTTACTACGCGTCTCA TGAACATACGAAGATCTTGGAATAATATCCCCTTGAAT 900 AAGATAGTCTCCCTCTATTTCTATAAAGCCGTATTTGACTAGTTATCTTATTTAGAAAGTATGT GCAAATATGTAAAATATAAGTCATACTTAAAGAACTTTTAATGTTATTAAATAATAAGTCACAC CAAAAATAAAACATATATATTTTTAATAAGATAAATGATTAAATGTATATATAAAAATTAATAG CGTCACATATTTTAAAATAGAGGGGTATTTAAGTACCCACAGGATCATCAAAATTCAGTTATCT TTTCTTAAGCCTCTAACGAACATTGGAAGATCCTCACTAATGGCAGCATGAATCTAGGGTTCAC TATTTCGGAATGCAAAATATGTTTTACCGGGCATCCGATTTTTAAAAAATTCAGAATGAAGAAA ATTGAATCTTTTTTATGGATTTGAATAAATCTTGATAAATTCGAAAAAATTTCCGAACTTTTGG CCAGAAGTGAATCCTACCCGTATCCACCGGTAATAAACCTAAATTTTTGGGAGTAATGAATTAA TGTTATATATAATCCATGAATTATATAGTTCCAAACTACTCCGTAACAAATTTTCAGGAGTAGT GAAATTAATATTATTACAATCTCAGAAAAAAATGGCAGAAACAATTAATCTGTTTTCAATTATT AATTAATTTGTTTTTGTGTCCAGATGGACAAGGCGTCGATACTAGGCGACACGATCGAGTACGT GAAGCAGCTAAGGAACCGCATACAAGAGCTCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCACGAGCAGCCGCC CGGGCGCCATCGGCGGCGGCCGCCGGGAGGCGGAGGAAGAGATCCGCCGCCGCCGCCACTGCCA CGGCGGCGGAAGGGATGAGCAGCAGCAATGGCCGCAATGGCGGCGAGGCGGCGGAGGTGGTGCA GGTG 47 AF17 AF18 640 TCAATCGTCGTCACGAGCAGCCGCCCGGGCGCCATCGGCGGCGGCCGCCGGGAGGCGGAGGAAG AGATCCGCCGCCGCCGCCACTGCCACGGCGGCGGAAGGGATGAGCAGCAGCAATGGCCGCAATG GCGGCGAGGCGGCGGAGGTGGTGCAGGTGTCCATCATCGAGAGCGACGCGCTGCTGGAGCTCCG GTGCGGTTGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGTGGTGCTGCTCCGGGTGATGCAGGCGATGCAGGAG CTCCAGCTGGAGGTCACCGCCGTCCAGGCCTCGTGCGCCGGTGGCGAGCTGCTCGCCGAGCTGC GCGCCAAGGTCGTCGTTATGATCCTGATCTGCATGAAAATGCAAATGCAAATGCAAATGCAGAA TTAAGCTTTCATTCTTGCTCCTCTGAATTCTGAATTTATATATTCACCCTTCTTTCGATCTGCT CGTACGTTCGTTTCGCCTAAATTATGTACAAATTAACTGAATCTTTGAACTGAAAATAACTGAA TCTTTTTTGTGTGTTTTTGTGTGGGTGAATTGGTTGGCGCAGGTGAAGGGGAGGAGGAGGAGCA GCATCGCTCAGGTGAAGAGGGCCATCCATCTCGTCCTCTCCTCCTCATCGATATCACCCTGAAA 678 CTTCTTCGATCTGCTCGTCCCTTTTTTCTTTGCTCATGGGGATTTTTTTCCAACGGTTATATAT ATAGAAAGTTCACATATATAAATCATGATAATTACCTTTTAGAAAATTCAAACAAAGAATCGAT ATATATAGTTCTATCTATGCATCATTTTCCTAAATCACGATAATTACCTCAAGCTTGATAAAAT GGCATTACATTACTATTATTATTACTAGAGTTTTTTCACTTCCCTGATCTAACCAATTTGCCAC GATGGTTAGATATATAGATGGTTCTAATTAATCTAATGTTAATGTACTCCACATATATGATATA TGTACATACATATCTAGTTTTAACATTTGCAAATGAATTGCAATCAGAATATATATATGCATGC AGCACAGGTGCTTGATTGCAATTATATGATTATTACTCTCTCACATATTGATATGGTAAATTTG TATATATTTGTGGCATGCATTCATGCACGAAGCTAGATTAATTATTAATTAATTCAGGGTGATA TCGATGAGGAGGAGAGGACGAGATGGATGGCCCTCTTCACCTGAGCGATGCTGCTCCTCCTCCT CCCCTTCACCTGCGCCAACCAATTCACCCACACAAAAACACACAAAAAAGATTCAGTTATTTTC AGTTCAAAGATTCAGTTAATTTTACATTATTGAATCGG Phục lục 2: Hình ảnh băng vạch chạy PCR 48