Khóa luận tốt nghiệp ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lạc chịu hạn hl22

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LẠC CHỊU HẠN HL22” Người thực : Nguyễn Thị Thủy Khóa : 62 MSV : 620465 Ngành : Cơng nghệ sinh học Người hướng dẫn : PGS.TS Trần Đăng Khánh PGS.TS Đồng Huy Giới Hà Nội - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây công trình nghiên cứu khoa học tơi thực hướng dẫn PGS.TS Trần Đăng Khánh PGS.TS Đồng Huy Giới Số liệu kết trình bày luận văn khách quan trung thực Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin, tài liệu trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên thực Nguyễn Thị Thủy                                 i     LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đến hồn thành khóa luận tốt nghiệp, ngồi cố gắng thân tơi nhận nhiều giúp đỡ thầy cô, anh chị Viện Di truyền Nông nghiệp Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trần Đăng Khánh thầy PGS.TS Đồng Huy Giới, người hướng dẫn tơi suốt thời gian thực khóa luận Bằng kiến thức phong phú dẫn nhiệt tình, thầy giúp đỡ tơi nhiều nghiên cứu này” Xin cảm tập thể cán thuộc môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp nhiệt tình giúp đỡ cung cấp cho tơi tài liệu cần thiết để hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học - Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình, bạn bè Đã đồng hành cùng, dành lời khuyên, lời động viên để vững bước học tập sống Tuy nhiên kiến thức chun mơn cịn hạn chế thân thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung báo cáo nhiều thiếu xót nên tơi mong nhận góp ý, bảo thêm quý thầy cô để báo cáo hoàn thiện Một lần xin gửi đến thầy cô, bạn bè anh chị lời cảm ơn chân thành tốt đẹp nhất! Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên thực Nguyễn Thị Thủy ii     MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ ix Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa đề tài Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu lạc 2.1.1 Đặc điểm lạc điều kiện hạn hán 2.1.2 Cơ chế chống chịu hạn lạc 2.2 Đất bị hạn vùng hạn Việt Nam 2.3 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 2.4 Giới thiệu giống lạc Sen Thắt giống lạc L18 12 2.5 Chỉ thị phân tử ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống lạc chịu hạn 13 2.5.1 Chỉ thị phân tử 13 2.5.2 Ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống lạc 14 Phần III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 3.1 Vật liệu nghiên cứu 22 3.2 Hóa chất thí nghiệm 24 iii     3.3 Thiết bị sử dụng 25 3.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 3.4.1 Thời gian nghiên cứu 26 3.4.2 Địa điểm nghiên cứu 26 3.5 Nội dung nghiên cứu 26 3.6 Phương pháp nghiên cứu 27 3.6.1 Thu thập đánh giá nguồn vật liệu thích hợp 27 3.6.2 Đánh giá điều kiện gây hạn nhân tạo 27 3.6.3 Đánh giá khả chịu hạn dịng/giống lạc thời kì hoa 27 3.6.4 Đánh giá mức độ héo khả phục hồi dòng/giống lạc 28 3.6.5 Công thức đánh giá khả chịu hạn 28 3.6.6 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 29 3.6.7 Kỹ thuật PCR 31 3.6.8 Kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR 32 3.6.9 Phương pháp xử lý số liệu 34 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Đánh giá điều kiện nhân tạo khả chịu hạn dòng/giống bố mẹ, dòng lai điều kiện nhân tạo 35 4.1.1 Kết đánh giá khả chịu hạn dòng/giống lạc bố mẹ, dòng lai thời kỳ mọc mầm 35 4.1.2 Kết đánh giá khả chịu hạn dòng/giống lạc bố mẹ dòng lai HL22 thời kỳ hoa rộ 36 4.1.3 Kết đánh giá mức độ héo khả phục hồi giống lạc bố mẹ dòng lai HL22 38 4.2 Sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống sử dụng thị phân tử liên kết QTL/gen chịu hạn, chọn lọc cá thể có tiềm năng suất, chịu hạn 40 4.2.1 Tách chiết tinh DNA tổng số 40 4.2.2 Xác định thị SSR đa hình 41 iv     4.2.3 Xác định gen chịu hạn giống triển vọng HL22 42 4.3 Thảo luận 44 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 TIẾNG VIỆT 47 TIẾNG ANH 47 v     DANH MỤC VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nghĩa chữ viết tắt AGI (Agriculture Genetics Viện Di truyền Nông nghiệp Institute) DNA Deoxyribonucleic Acid AFLP (Amplified Fragment Đa hình chiều dài đoạn Length Polymorphism) nhân chọn lọc APS Amonium Persulfate RNA Ribonucleic Acid Bp (Base pair) Cặp bazơ nitơ CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromine dNTPs Deoxynucleotide triphosphate EB (Extraction Buffer) Bộ đệm chiết xuất 10 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 11 EtBr Ethidium Bromide 12 Fw (Forward primer) Mồi thuận 13 Kb Kilo base 14 MABC (Marker assisted Chọn giống hồi giao nhờ thị backcrossing) phân tử 15 miRNA Micro RNA 16 NST Nhiễm sắc thể 17 NĐGM Nhiệt độ gắn mồi 18 PCR (Polymerase Chain Phản ứng chuỗi trùng hợp Reaction) 19 20 RAPD (Random Amplified Đa hình AND nhân Polymorphic DNA) ngẫu nhiên RFLP (Restriction Fragment Đa hình chiều dài đoạn phân cắt vi     Length Polymorphisms) giới hạn 21 Rv (Reverce primer) Mồi nghịch 22 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 23 SSR (Simple Sequence repeat) Sự lặp lại trình tự đơn giản 24 TLTK Tài liệu tham khảo 25 TBE Tris – Bric Acid - EDTA 26 TT Thứ tự 27 TE Tris – EDTA 28 TEMED Tetramethyl ethylenediamine vii     DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách SSR SSR đa hình cơng bố lạc 15  Bảng 3.1 Đặc điểm giống cho gen giống nhận gen 22  Bảng 3.2 Danh sách thị SSR giống cho nhận QTL/gen chịu hạn 25  Bảng 3.3 Thành phần dung dịch đệm chiết EB 29  Bảng 3.4 Thành phần dung dịch đệm CTAB 29  Bảng 3.5 Thành phần dung dịch đệm TE 30  Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 32  Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 32  Bảng 4.1 Khả chịu hạn giống lạc thời kỳ hoa rộ 38  Bảng 4.2 Ảnh hưởng hạn đến mức độ héo khả phục hồi giống lạc 39  Bảng 4.3 Thành phần chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 43  viii     DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ Hình 2.1 Giống lạc Sen Thắt 12  Hình 2.2 Giống lạc L18 13 Hình 2.3 Bản đồ di truyền QTL bão hòa cho giống lạc Vị trí QTL cho đặc điểm thành phần hạn hán khác màu hiển thị bên phải nhóm liên kết 17  Sơ đồ 2.1 Sơ đồ phương pháp lai backcross 20 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ lai tạo giống lạc chịu hạn HL22 23 Hình 4.2 Đánh giá khả chịu hạn thời kỳ giống lạc HL22 37 Hình 4.3 Kết kiểm tra DNA tổng số gel agarose 0.8% 41  Hình 4.4 Một số hình ảnh khảo sát đa hình vị trí QTL/gen quy liên kết với tính trạng chịu hạn 42 Hình 4.5 Kiểm tra dòng triển vọng HL22 03 thị liên kết TC4E10, TC1A02 TC4D02 43  ix     3.6.9 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm Excel 2013 phần mềm thống kê IRRISTAT 5.0 34     Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đánh giá điều kiện nhân tạo khả chịu hạn dòng/giống bố mẹ, dòng lai điều kiện nhân tạo 4.1.1 Kết đánh giá khả chịu hạn dòng/giống lạc bố mẹ, dòng lai thời kỳ mọc mầm Để đánh giá khả chịu hạn giống lạc “Sen Thắt” giống chịu hạn tốt giống lạc “HL22” bắt đầu đánh giá qua khả đâm xuyên rễ qua lớp sáp thí nghiệm thời kỳ nảy mầm thực Viện Di truyền Nông nghiệp Kết thể hình 4.1 cho thấy sau tuần rễ giống lạc “Sen thắt- giống đối chứng” đâm xuyên qua lớp sáp rễ giống lạc “HL22” đâm xuyên qua lớp sáp Nhờ vào khả rễ đâm xuyên qua lớp sáp, thấy lai HL22 có khả chịu hạn tốt thời kỳ nảy mầm so với giống bố “Sen Thắt” Giống lạc Sen Thắt Giống lạc HL22 Hình 4.1 Khả đâm xuyên giống lạc “Sen Thắt” giống lạc “HL22” qua lớp sáp sau tuần theo dõi 35     4.1.2 Kết đánh giá khả chịu hạn dòng/giống lạc bố mẹ dòng lai HL22 thời kỳ hoa rộ 4.1.2.1 Thời kỳ Sau gây hạn thời kỳ nảy mầm giống bố mẹ lai HL22 Tôi tiếp tục đánh giá khả chịu hạn thời kỳ thông qua thân lạc Cũng trồng khác, thân lạc phận quan trọng lạc Thân phận trực tiếp mang lá, hoa, lạc Thân phận trung gian vận chuyển vật chất từ rễ lên sản phẩm đồng hóa từ rễ, quả, hạt Thân lạc thuộc loại hình sinh trưởng vơ hạn nên suốt q trình sinh trưởng cây, thân khơng ngừng tăng lên Tốc độ tăng trưởng chiều cao tăng dần thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng (thời kỳ con) đạt cực đại vào thời kỳ hoa rộ, chuyển qua giai đoạn đâm tia, hình thành quả, tốc độ tăng chiều cao thân giảm rõ rệt Chiều cao tiêu giữ vai trò quan trọng định tới khả tốc độ phân cành Chiều cao phản ánh khả tích lũy chất khơ, đặc điểm di truyền giống Tốc độ vươn cao biểu mối tương quan trình sinh trưởng sinh dưỡng sinh trưởng sinh thực lạc, có ảnh hưởng trực tiếp đến suất Như với giống lạc, ứng với giai đoạn sinh trưởng, phát triển khác động thái tăng trưởng chiều cao thân khác Chiều cao phản ánh mối tương quan sinh trưởng sinh dưỡng sinh trưởng sinh thực Nếu chiều cao thân tăng trưởng mạnh yếu ảnh hưởng tới khả hoa kết lạc Ở mức độ định chiều cao tiêu đánh giá tốc độ sinh trưởng khả cho suất lạc Chiều cao hợp lý làm tăng khả chống đổ cây, tăng số hữu hiệu, làm tăng khả quang hợp tạo tiền đề cho suất sau Cây lạc sinh trưởng tốt thường có chiều cao cân phận dinh dưỡng khác, thân mập, cứng Trong suốt trình sinh trưởng cây, thân khơng 36     ngừng tăng trưởng chiều cao Tốc độ sinh trưởng chiều cao thân tăng dần từ mọc, hoa, tốc độ tăng chậm lại, sau hoa ra, tốc độ sinh trưởng chiều cao lại tiếp tục tăng nhanh đạt cao thời kỳ hoa rộ; hoa gần tắt, tốc độ tăng chiều cao thân giảm rõ rệt Trong thời kỳ chín gặp điều kiện thuận lợi tốc độ tăng chiều cao thân lại tăng lên (Lê Thị Thúy, 2016) Sau gieo tuần tiến hành lấy mẫu đo đếm tiêu chiều cao (cm), độ thiếu hụt bão hòa, số độ dày (SLA), hàm lượng diệp lục, khối lượng chất khơ tích lũy để đánh giá khả chịu hạn giống HL22 với giống đối chứng Kết thí nghiệm thể hình 4.2   Hình 4.2 Đánh giá khả chịu hạn thời kỳ giống lạc HL22 4.1.2.2 Thời kỳ hoa rộ Sau tháng trồng, qua quan sát đánh giá khả chịu hạn giống lạc bố mẹ, dòng lai “HL22” điều kiện nhà lưới có mái che cho thấy: khô hạn xảy thời kỳ hoa làm thay đổi rõ rệt chiều cao thân khả sinh trưởng lạc Ở điều kiện hạn, tất dòng/giống bị giảm chiều cao thân so với điều kiện tưới nước đầy đủ (đối chứng) 37     Đánh giá độ ẩm đất thời điểm héo kết bảng 4.1 cho thấy giống bố “Sen Thắt” dòng lai “HL22” chịu hạn mức độ tốt giống mẹ “L18” chịu hạn Bảng 4.1 Khả chịu hạn giống lạc thời kỳ hoa rộ Chiều cao thân (cm) TT Dòng/giống Sen Thắt 15,5 14,0 4,29 Tốt L18 14,5 11,0 8,38 Rất HL22 18,5 17,0 4,39 Tốt Gây hạn Đối chứng (không gây hạn) Độ ẩm Khả héo (%) chịu hạn Ghi chú: Độ ẩm héo < 5,0% = chịu hạn tốt; - 6% = chịu hạn khá; ; - < 7% = chịu hạn TB; - < 8% = chịu hạn kém; > 8% = chịu hạn Qua số liệu bảng 4.1, Với trường hợp gây hạn nhân tạo dịng lai “HL22” có chiều dài thân cao dịng bố “Sen Thắt” dòng mẹ “L18” 3cm 4cm Ở trường hợp đối chứng (khơng gây hạn) dịng lai “HL22” có chiều dài thân cao dịng bố mẹ 3cm 6cm Tương tự độ ẩm héo sau đánh giá dòng lai “HL22” (4,39%) giống bố Sen Thắt (4,29%) thấp nhiều so với giống mẹ L18 (8,38%) Do đánh giá độ ẩm đất thời điểm héo kết bảng 4.1 cho thấy giống bố “Sen Thắt” dòng lai “HL22” chịu hạn mức độ tốt giống mẹ “L18” chịu hạn 4.1.3 Kết đánh giá mức độ héo khả phục hồi giống lạc bố mẹ dòng lai HL22 Khi gặp hạn, phận nhạy cảm giúp ta nhận biết thay đổi hình thái sinh trưởng Trong điều kiện thiếu nước trình phát triển giảm, trình lão hóa tăng lên xuất hiện tượng héo rũ, chí rụng để làm giảm thoát nước Thời gian héo 38     kéo dài gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động sống như: ngừng quang hợp, ngừng sinh trưởng, gây nên tượng rụng hoa, rụng làm giảm suất trồng Bảng 4.2 Ảnh hưởng hạn đến mức độ héo khả phục hồi giống lạc Thời kỳ hoa rộ TT Tên Điểm héo dòng/giống sau 10 ngày gây hạn (15) Thời kỳ hình thành hạt Cấp độ phục hồi sau ngày tưới nước trở lại (1-3) Điểm héo sau 10 ngày gây hạn (15) Cấp độ phục hồi sau ngày tưới nước trở lại (1-3) Sen Thắt 2 L18 5 3 HL22 Ghi chú: - Đánh giá điểm héo: điểm = 10 - 20% ; điểm = 20 - 40%; điểm = 40 - 60% ; điểm = 60 - 80%; điểm = 80 - 100% số bị héo rũ - Đánh giá cấp độ phục hồi: cấp = phục hồi hoàn toàn ( 100% số hồi phục); cấp = phục hồi ( >60% số hồi phục); cấp = hồi phục (< 50% số hồi phục) Với thời kỳ hoa rộ: Sau 10 ngày gây hạn, giống lạc “bố Sen Thắt” dòng lai “HL22” bị héo mức điểm (có 40-60% số bị héo rũ); giống lạc mẹ L18 bị héo mức điểm (có 80-100% số bị héo) Tuy nhiên sau ngày tưới nước trở lại giống lạc bố Sen thắt dịng lai HL22 phục hồi nhanh cấp (có 80-100% số phục hổi); đặc biệt giống lạc mẹ L18 phục hổi nhanh tử cấp độ gây hạn nên cấp độ (có >60% số phục hồi) Với thời kỳ hình thành hạt: Sau 10 ngày gây hạn giống lạc “bố Sen thắt” bị héo mức điểm (có 80-100% số bị héo rũ); giống lạc mẹ L18 bị héo mức điểm (có 80-100% số bị héo); dịng lai “HL22” điểm héo mức điểm (có 60-80%) Qua ta thấy dịng lai “HL22” thời kỳ hình 39     thành hạt có số bị héo thấp so với giống bố mẹ (thời điểm sau 10 ngày gây hạn) Tuy nhiên sau ngày tưới nước trở lại giống lạc bố Sen thắt dịng lai HL22 phục hồi lên cấp độ (có 20-40% số phục hổi); giống lạc mẹ L18 phục hổi lên cấp độ (có 40-60% số phục hồi) Như vậy, thấy thời kỳ hình thành hạt nhu cầu nước lạc cao so với thời kỳ hoa rộ, điều lý giải tượng tỷ lệ dòng/giống mức độ héo thời kỳ hình thành hạt tăng lên khả phục hồi chậm lại gặp điều kiện hạn Thông qua đánh giá mức độ phục hồi 02 thời kỳ (i) hoa rộ (ii) thời kỳ hình thành hạt xác định giống bố Sen thắt dịng lai HL22 có khả phục hồi tốt sau hạn thời kỳ hoa rộ phục hồi thời kỳ hình thành hạt 4.2 Sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống sử dụng thị phân tử liên kết QTL/gen chịu hạn, chọn lọc cá thể có tiềm năng suất, chịu hạn 4.2.1 Tách chiết tinh DNA tổng số Tách chiết DNA bước quan trọng nghiên cứu sinh học phân tử Nếu có DNA đủ độ tinh điều kiện tốt cho bước nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chọn phương pháp tách chiết DNA phương pháp CTAB cải tiến phịng thí nghiệm di truyền Grent vương quốc Bỉ Lá non tuần sau cấy giống nghiên cứu thu để tách chiết DNA Nồng độ độ tinh DNA kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 0,8% với DNA chuẩn Nhuộm gel dung dịch ethidum bromide ghi nhận kết máy soi cực tím Kết tách chiết DNA minh hoạ (hình 4.3) 40       Hình 4.3 Kết kiểm tra DNA tổng số gel agarose 0.8% Ghi chú: Giếng số – Lamba DNA nồng độ chuẩn (200ng/ µl) Giếng số 2: Giống lạc bố (Sen Thắt) Giếng số 3: Giống lạc mẹ (L18) Giếng số 4: Giống lạc HL22 Kết hình 4.3 cho thấy phương pháp tách chiết DNA CTAB cho hiệu cao, băng điện di gọn, rõ chứng tỏ mẫu DNA bị đứt gãy, độ tinh cao, việc loại bỏ RNA RNase tiến hành tốt Những mẫu DNA đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.    4.2.2 Xác định thị SSR đa hình Giống có khả chịu hạn cao nhất, chống chịu tốt với sâu bệnh hại chính, giống Sen Thắt (viết tắt ST- với độ ẩm héo 4,29%), giống chọn làm giống cho gene thí nghiệm khác nhóm với giống nhận gen Đây giống chọn làm giống bố mẹ công tác lai tạo để tạo nguồn vật liệu khởi đầu Giống L18 có đặc tính nơng sinh học tốt, suất cao, nhiên khả chị hạn (độ ẩm héo 8,38%) giống sử dụng làm mẹ để tạo hệ lai có khả chịu hạn suất cao Sử dụng 02 giống Sen Thắt & L18 để đánh giá đa hình, tìm thị 41     liên kết với gen chịu hạn phục vụ cho mục đích chọn giống lạc chịu hạn Giống lạc Sen thắt giống lạc địa phương có khả chịu hạn tốt, nhằm mục đích tìm kiếm thị đa hình liên kết với tính trạng chịu hạn để phát QTL/gen chịu hạn cá thể lai Sau tiến hành phản ứng PCR với DNA giống nhận gen (giống L18) Trong 10 thị SSR khảo sát để xác định thị đa hình giống cho nhận QTL/gen chịu hạn, kết khảo sát 03 thị cho đa hình TC1A02, TC4D02 TC4E10 Có 07 thị đơn hình TC3A12, TC3H07, RN5G08, RN7D04, PM377, GM2301, PM343 giống lạc Sen thắt giống lạc L18   Hình 4.4 Một số hình ảnh khảo sát đa hình vị trí QTL/gen quy liên kết với tính trạng chịu hạn Ghi chú: M: Marker chuẩn Lane: 1, 3, 5: Giống L18 Lane: 2, 4, 6: Giống Sen Thắt Kết : Thu 03 thị cho đa hình thị TC1A02, TC4D02 TC4E10 Các thị sử dụng để xác định cá thể mang QTL/gen chịu hạn hệ lai (Hình 4.4) 4.2.3 Xác định gen chịu hạn giống triển vọng HL22 Nhằm mục đích tìm kiếm thị đa hình liên kết với tính trạng chịu hạn để phát QTL/gen chịu hạn cá thể lai HL22 với giống lạc bố giống cho gen giống lạc Sen Thắt, tiến hành thực phản ứng PCR với DNA giống nhận gen Kiểm tra gen chịu hạn thị SSR đa hình 42     TC1A02, TC4D02 TC4E10 vừa sàng lọc từ 10 thị SSR để xác định cá thể liên kết với QTL/gen chịu hạn hệ lai Bảng 4.3 Thành phần chu trình nhiệt cho phản ứng PCR   Sau tiến hành PCR, tiến hành kiểm tra dòng triển vọng HL22 gel polyacrylamide với thị liên kết TC1A02, TC4D02 TC4E10   Hình 4.5 Kiểm tra dịng triển vọng HL22 03 thị liên kết TC4E10, TC1A02 TC4D02 Ghi chú: Lane 1: Marker chuẩn 50bp Lane 2: dòng triển vọng HL22; Lane 3: giống nhận gen L18; Lane 4: giống cho gen Sen Thắt 43     Kết điện di cho thấy giống lạc HL22 sau kiểm tra thị liên kết với tính trạng chịu hạn (TC1A02, TC4D02 TC4E10) giống lạc HL22 mang kiểu gen đồng hợp tử giống cho gen (Sen Thắt) vị trí trí từ 166276 bp Do đó, HL22 mang số đặc điểm chịu hạn tốt Sen Thắt mang lại suất cao giống L18 thông qua 03 liên kết chặt với QTL/gen chịu hạn 4.3 Thảo luận Trong nghiên cứu này, việc chọn thu thập đánh giá nguồn vật liệu ban đầu giống lạc Sen Thắt giống lạc L18 Giống Sen Thắt (là giống bố - giống cho gen) biết đến giống lạc tiếng Nghệ An khả thích nghi tốt với điền kiện khô hạn, nhiên suất Sen Thắt lại Vì cần có giống mang lại suất cao để làm giống mẹ - giống nhận gen, giống L18 Khi thực lai tạo giống bố mẹ với nhằm mục đích tạo lai vừa chịu hạn tốt mang lại suất cao Mặc dù vậy, việc ứng dụng giống Sen Thắt nhân giống lạc, đặc biệt Việt Nam cịn thiếu Cịn L18 đóng vai trị giống nhận gene có suất cao chịu hạn Trong điều kiện tưới tiêu tốt, sản lượng L18 cao Do đó, giống HL22 có khả chịu hạn đặc tính phát triển vượt trội so với Sen Thắt - giống cho gene L18 - giống nhận gene Qua thí nghiệm lai tạo, đánh giá giống lạc HL22 điều kiệu nhân tạo so sánh với giống đối chứng Trải qua q trình sàng lọc giống lạc HL22 có đặc tính: + Có khả chịu hạn tốt (điểm 1-3); + Thời gian sinh trưởng ngắn (vụ xuân từ 120 – 125 ngày); + Năng suất cao (> 3,5 tấn/ha); + Dạng hình đẹp, số cành cấp I cao (>5 cành/cây); + Tỷ lệ nhân > 70%; + Chống chịu tốt với số sâu bệnh hại 44     Với phát triển công nghệ sinh học, việc sử dụng thị SSR liên kết với đặc tính chịu hạn cách tiếp cận hiệu để nhân giống lạc Trong nghiên cứu tất 10 thị SSR Nandini công bố vào năm 2018 Mục tiêu nghiên cứu xác định cho dòng lai HL22 đồng hợp tử dựa thị SSR đa hình TC1A02, TC4D02 TC4E10 số chịu hạn Qua việc thực phản ứng PCR điện di gel agarose gel polyacrylamide có 02 vấn đề cần lưu ý Đầu tiên, mồi cho thị SSR độ đặc hiệu cao Kết điện di tìm thấy dải băng khơng đặc hiệu Do đó, kết gel phải dựa kích thước sản phẩm dự kiến để tìm trình tự khuếch đại phân tách băng vạch mồi không rõ ràng yêu cầu điện di thời gian dài Cuối số lượng thị SSR sử dụng nghiên cứu có 10 thị, có 03 thị đa hình 07 thị đơn hình.      45     Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Xác định giống Sen Thắt (giống cho gen có khả chịu hạn tốt) giống L18 (giống nhận gen có suất cao) Dựa vào phương pháp lai backcross (Bố Sen Thắt X Mẹ L18), chọn tạo thành công giống lạc lai BC4F1 Đánh giá khả chịu hạn 03 dòng/giống điều kiện nhân tạo xác định 02 giống có khả chịu hạn tốt giống Sen Thắt giống HL22 Các dòng/giống lạc xác định khả chịu hạn nêu nguồn vật liệu quan trọng cho công tác chọn tạo giống lạc chịu hạn Xác định 03 thị đa hình TC1A02, TC4D02 TC4E10 từ 10 thị SSR, nhằm phục vụ cho nghiên cứu chọn giống lạc chịu hạn HL22 Ứng dụng thành công kỹ thuật tách chiết DNA tổng số, kỹ thuật PCR, điện di sản phẩm PCR gel agarose gel polyacrylamide với mồi đánh dấu SSR việc xác định di truyền giống “Sen Thắt” dòng HL22 5.2 Đề nghị Để phát triển giống lạc HL22 trở thành giống thương mại cần tiếp tục nghiên cứu chọn lọc đồng ruộng với kịch chịu hạn khác nhau, đồng thời nghiên cứu cách đầy đủ đặc điểm sinh lý sinh hóa giống tạo Cần sử dụng thêm mồi thị SSR liên kết với tính trạng chịu hạn lạc để thử nghiệm với dòng lai “HL22” dòng bố mẹ để khẳng định thành công tổ hợp chéo Mở rộng việc sử dụng thị SSR nghiên cứu khả chịu hạn trồng việc chọn, lai tạo giống chịu hạn khác 46     TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Văn Lợt Tạ Quốc Tuấn (2006) Cây đậu phộng - kỹ thuật trồng & thâm canh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Tuấn Lê Vũ Đình Ngạn (2010) Nghiên cứu đời sống lạc (Arachis hypogea L.) điều kiện nóng hạn vụ hè Đà Nẵng Tạp chí Khoa học Công nghệ, 05 tr 117-124 Vũ Thị Thu Thủy (2011), Tạo dòng chịu hạn phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.) Luận văn Tiến sĩ Đại học Thái Nguyên tr 27 Phạm Thị Mai, Đồng Thị Kim Cúc, Nguyễn Văn Quang, Phan Thanh Phương, Lê Thanh Nhuận, Nguyễn Xuân Thu, Phạm Văn Cường (2017) Kết đánh giá khả chịu hạn điều kiện nhân tạo số dịng/giống lạc làm vật liệu phục vụ cơng tác chọn tạo giống 23(12) Trần Anh Tuấn, Vũ Ngọc Thắng Vũ Đình Hịa (2007) Ảnh hưởng số vật liệu che phủ đến sinh trưởng, phát triển suất giống lạc L14 điều kiện vụ thu đất Gia Lâm - Hà Nội Tap chí KHKT Nơng nghiêp 2007 03 tr 17-22 Phạm Thị Thúy (2006) Nghiên cứu sử dụng thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeats) chọn giống lúa Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Đại học Nông nghiệp Báo Nghệ An - In - Phát hành (2019) Diễn Châu mùa lạc xuân Nghệ Anh, 15 tháng năm 2019 Nguyễn Văn Thắng, Nguyễn Thị Chinh, Trần Đình Long, Nguyễn Xuân Thu, Phan Quốc Gia Hoàng Minh Tâm (2009) Giống lạc L18 Viện lương thực thực phẩm Lê Thị Thúy (2017) Đánh giá sinh trưởng phát triển số giống lạc điều kiện không tưới nước, vụ hè thu năm 2016 Gia Lâm - Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Học viện Nơng nghiệp Việt Nam TIẾNG ANH 10 Britannica (2021) The Editors of Encyclopaedia "Peanut" Encyclopedia Britannica on 24 Feb 2021 at https://www.britannica.com/plant/peanut 11 Akram N.A, Shafiq F and Ashrap M (2018) Peanut (Arachis hypogaea L.): A prospective legume crop to offer multiple health benefits under changing climate Vol 17(5) p 1325-1338 12 Vaidya S., M Vanaja, N Jyothi Lakshmi, P Sowmya, Y Anitha and P Sathish (2015) Variability in drought stress induced responses of groundnut (Arachis hypogaea L.) genotypes Vol 4(149) p 13 Okello D.K., M Biruma and C.M Deom (2010), Overview of groundnuts research in Uganda: Past, present and future African Journal of Biotechnology Vol 9(39) p 64486459 14 Falke A.B (2019) Assessment of Groundnut Elite Lines under Drought Conditions and Selection of Tolerance Associated Traits 2019 Vol (303427) p 1-10 15 Arunachalam P and P.J.A.J.o.A.R Kannan (2013) Screening for drought tolerant groundnut (Arachis hypogaea L.) lines suitable for rainfed alfisol Vol 7(1) p 35-42 47     16 He Y., Shujing M, Zhongguo H, Baizong W and Yufa L (2020) Ectopic expression of MYB repressor GmMYB3a improves drought tolerance and productivity of transgenic peanuts (Arachis hypogaea L.) under conditions of water deficit Vol 29(5) p 563-574 17 Ravi K (2011) Identification of several small main-effect QTLs and a large number of epistatic QTLs for drought tolerance related traits in groundnut (Arachis hypogaea L.) Theoretical and Applied Genetics Vol 122(6) p 1119-1132 18 Guo B., M K.Pandey, and G He (2013) Recent Advances in Molecular Genetic Linkage Maps of Cultivated Peanut Peanut Science Vol 40 (2) p 95–106 19 Wikipedia, Marker-assisted selection 20 Hopkins M S., Casa A M., Wang T., Mitchell S E., Aean R E., Kochert G D, Kresovich S., (1999) Discovery and characterization of polymorphic simple sequence repeats (SSR’s) in peanut Vol 39 1243-1247 21 He G., Meng R., Newman M., Gao G., Pittman R N., Prakash C S., (2003) Microsatellite as DNA Marker in cultivated Peanut (Arachis hypogea L.) BMC Plant Biol., 3: 22 Ferguson M E., Burow M F, Schulze S R., Bramel P J., Paterson A H., Kresovich S., Mitchell S., (2004) Microsatellite identification and characterization in peanut (Arachis hypogea L.) Theor Appl Genet., 108: 1064-1070 23 Nandini C., Savithramma D., Doddaraju, Pushpa., Kumar, Pavan (2018) Polymorphic SSR marker identification for water use efficiency in groundnut (Arachis hypogea L.) parental lines Legume Research - An Interational Journal 10.18805/LR-3980 24 Moretzsohn M C., Leoi L., Proite K (2005) A microsatellite-based, gene-rich linkage map for the AA genome of Arachis (Fabaceae) Theor Appl Genet 111, 1060–1071 48