Khóa luận tốt nghiệp đánh giá độ đồng nhất của các dòng g1 của các giống lúa nếp cẩm đặc sản địa phương bằng chỉ thị phân tử

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỒNG NHẤT CỦA CÁC DÒNG G1 CỦA CÁC GIỐNG LÚA NẾP CẨM ĐẶC SẢN ĐỊA PHƯƠNG BẰNG THỊ PHÂN TỬ Sinh viên : VŨ KHẮC DUY Lớp : K62CNSHA Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : GS TS PHAN HỮU TÔN Hà Nội, Tháng năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu khoa học tơi thực hướng dẫn GS.TS Phan Hữu Tôn cán Trung tâm Bảo tồn Phát triển nguồn gen Cây trồng Học viện Nông nghiệp Việt Nam Số liệu khóa luận tốt nghiệp hồn tồn dựa sở thực tiễn mà làm thời gian vừa qua không sử dụng số liệu từ cơng trình báo cáo cơng bố trước Sự giúp đỡ báo cáo khóa luận gửi lời cảm ơn tận tình, thơng tin chúng tơi xử dụng đươc trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2021 Sinh viên thực Vũ Khắc Duy i LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực phịng thí nghiệm Bộ mơn sinh học phân tử Công nghệ sinh học Ứng dụng khu thí nghiệm Trung tâm Bảo tồn Phát triển nguồn gen trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, tơi cố gắng hết lực kiến thức học để làm, với dạy bảo quan tâm thầy cô khoa Học viện Nơng nghiệp Việt Nam giúp đỡ tận tình từ bạn bè người than gia đình tơi Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết sâu sắc tới GS.TS Phan Hữu Tôn, người hướng dẫn chi tiết công việc cần làm kiến thức chun mơn đê hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn giảng viên cán Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ sinh học Ứng dụng, Trung tâm Bảo tồn Phát triển Nguồn gen Cây trồng - Khoa Công nghệ sinh học hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập Bộ môn Trung tâm Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn người thân gia đình, bạn bè bên để động viên giúp đỡ suốt q trình để hồn thành khóa luận cách thuận lợi Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2021 Sinh viên thực Vũ Khắc Duy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU vii TÓM TẮT viii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giá trị sử dụng nếp cẩm 2.2 Hiện tượng thối hóa giống 2.2.1 Khái niệm thối hóa giống 2.2.2 Ngun nhân thối hóa giống 2.2.3 Các biện pháp khắc phục 2.3 Nghiên cứu phục tráng giống 2.3.1 Khái niệm phục tráng giống 2.3.2 Quy trình phục tráng giống 2.4 Kỹ thuật thị phân tử 2.4.1 Khái niệm thị phân tử 2.4.2 Kỹ thuật đa hình trình tự lặp lại đơn giản- SSR 2.5 Bệnh bạc lúa 10 2.5.1 Nguyên nhân gây bệnh bạc lúa 10 2.5.2 Nghiên cứu chủng nòi phát triển bệnh bạc 10 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 11 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệp đồng ruộng 11 3.4.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học 12 3.4.3 Phương pháp đánh giá chọn cá thể phòng 24 iii 3.4.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 25 3.4.5 Ứng dụng thị phân tử DNA xác định khả chứa gen kháng bệnh bạc dòng G1 giống lúa nếp cẩm: Blau Cẩm, Khẩu Lếch, Khẩu Cảng, T68 26 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học Khẩu Lếch, Khẩu Cảng, T68 28 4.1.1 Kết đánh giá đặc trưng mẫu giống lúa nếp cẩm Blau Cẩm, Khẩu Lếch, Khẩu Cảng, T68 28 4.1.2 Kết đánh giá, chọn lọc hệ G1 dựa tính trạng nơng sinh học 36 4.2 Kết đánh giá chọn lọc cá thể phòng 37 4.3 Kết lây nhiễm nhân tạo 38 4.4 Ứng dụng thị phân tử vào đánh giá gen kháng bệnh bạc 39 4.5 Kết đánh giá tính đồng dòng G1 thị SSR 41 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các tính trạng đặc trưng giống lúa 13 Bảng 3.2.Thành phần dung dịch (1 lit) môi trường nuôi cấy vi khuẩn bạc 25 Bảng 3.3.Trình tự mồi sử dụng để phát gen kháng bạc Xa4 Xa7 27 Bảng 3.4.Trình tự dung để xác định gen đồng giống lúa 27 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái nơng sinh học mẫu giống Blau Cẩm 28 Bảng 4.2 Bảng mô tả tính trạng đặc trưng giống Khẩu cảng 30 Bảng 4.3 Bảng mô tả tính trạng đặc trưng giống Khẩu Lếch 32 Bảng 4.4 Bảng mô tả tính trạng đặc trưng giống T68 34 Bảng 4.5 Các tính trạng vủa 20 dòng G1 chọn lọc dựa đặc điểm nông sinh học 36 Bảng 4.6.Phạm vi chọn tính trạng 20 dịng 37 Bảng 4.7 Đặc điểm nơng sinh học 12 dịng chọn lọc 38 Bảng 4.8 Kết lây nhiễm nhân tạo 38 Bảng 4.9 Kết kiểm tra khả chứa gen Xa4, Xa7 12 dòng chọn lọc 40 v DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH Sơ đồ 2.1 Kỹ thuật phục tráng từ hạt giống sản xuất Hình 4.1 Điện di sản phẩm PCR gen Xa7 sử dụng cặp mồi P3 (Giếng số 6: BB7đối chứng dương, giếng số 8: IR24- đối chứng âm) 39 Hình 4.2 Điện di sản phẩm PCR gen Xa4 sử dụng cặp mồi Npb181 (Giếng số 1: IR24- đối chứng âm, giếng số 2: BB4- đối chứng dương) 40 Hình 4.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi RM119 41 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi thị RM161 41 Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi thị RM224 42 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ARN : Acid Ribonucleic DNA : Acid Deoxyribo Nucleic BNNPTNN : Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn CNSH : Công nghệ sinh học Cs : Cộng DNA : Acid Deoxyribo Nucleic EDTA : EthyleneDiamineTetraacetic Acid IRRI : International Rice Research Institute - Viện Nghiên cứu lúa quốc tế NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase Chain Reaction - phản ứng khuếch đại gen TE BL : Tris-EDTA : Blau Cẩm KL :Khẩu Lếch KC :Khẩu Cảng vii TÓM TẮT Khẩu Cảng, Khẩu Lếch, T68, Blau Cẩm giống lúa đặc sản địa phương mnag nhiều đặc điểm tốt nên người giữ lại trồng trọt tạo đặ sản riêng vùng núi phía Bắc Việt Nam Tuy nhiên nhiều nguyên nhân (các yếu tố giới, trình thụ phấn chéo, canh tác, chăm sóc lúa…) mà giống lúa bị lẫn tạp nhiều dạng khác nhau, bị thối hóa, cần đánh giá độ dòng Hiện Trung tâm Bảo tồn Phát triển nguồn gen trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam thực đánh giá gieo trồng thành dòng G0 Và đề tài :’’ Đánh giá đọ đồng dòng G1 giống lúa nếp cẩm đặc sản địa phương thị phân tử” tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái, nơng sinh học, suất chất lượng giống lúa tham gia thí nghiệm, đồng thời kiểm tra khả mang gen kháng bệnh bạc (Xa4, Xa7) độ dòng G1 thị phân tử DNA Từ kết theo dõi tiêu hình thái, nơng sinh học, suất, chất lượng điện di sản phẩm PCR chọn giống dòng G1 bốn giống: Khẩu Cảng, Khẩu Lếch, T68, Blau Cẩm đồng kiểu hình kiểu gen Sử dụng làm nguyên liệu cho vụ mùa (G2) để nghiên cứu đánh giá độ đồng bốn giống: Khẩu Cảng, Khẩu Lếch, T68, Blau Cẩm viii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Còn gọi nếp than, nếp nương, trồng miền núi phía Bắc Việt Nam, nếp cẩm dễ nhận biết hạt tròn, màu đỏ nâu Khơng đẹp mắt với ăn chế biến khéo léo, thứ “ngọc thực” danh châu Âu đặc tính giàu chất xơ dinh dưỡng Trong bốn giống: Khẩu Cảng, Khẩu Lếch, T68, Blau Cẩm giống lúa đặc sản địa phương mnag nhiều đặc điểm tốt nên người giữ lại trồng trọt tạo đặ sản riêng vùng núi phía Bắc Việt Nam Nhưng q trình bảo quản trồng trọt bị lẫn giới, chăm sóc chưa dẫn tới thối hóa lẫn tạp giống khác Chính nguyên Trung tâm Bảo tồn phát triển nguồn gen trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam thu thập, gieo trồng đánh gia độ đồng vụ mùa 2020 dựa đặc điểm hình thái nông sinh học , tiến hành chọn lọc giống G0 Từ G0 gieo trồng thành dịng G1 vụ xn năm 2021 Ngồi đặc điểm nơng sinh học nguồn gen yếu tố quan trọng, thị phân tử trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeat-SSR) Chỉ thị SSR phổ biến gen thực vật, chúng phân bố rải rác khắp nơi gen có tính đặc trưng cho lồi Chỉ thị chứng minh đa hình quần thể lúa (Olufowote et al., 1997) Việc trình tự gen lúa giải mã cho phép thị SSR có nhiều lựa chọn Trong gen kháng bệnh bạc tiêu để đánh giá độ chủng phương pháp sử dụng thị phân tử.Vì để khẳng định giá trị nguồn gen kháng bệnh giống cần thiết phải xác định liệu giống có gen kháng bệnh bạc hữu hiệu cách xác định có gen Xa4, Xa7 hay khơng ( Phan Hữu Tơn cộng (2002)) Chính vậy, cho phép môn Sinh học phân tử Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công Nghệ Sinh Học, hướng dẫn GS.TS Phan Hữu Tôn, tiến hành thực đề tài: ‘’Đánh giá độ đồng dòng G1 giống lúa nếp cẩm đặc sản địa phương thị phân tử.’’ 26 27 Vỏ trấu: Mầu sắc (trừ mỏ hạt) Hạt thóc (màu sắc mỏ hạt) Hoa: Màu sắc vịi nhụy Thân: Đường kính than Thân: Chiều cao (khơng tính bơng, trừ hạt nổi) Thân: Sắc tố antoxian đốt Thân: Sắc tố antoxian long 28 Bơng: Chiều dài trục 29 30 31 32 33 34 35 36 38 Bông: Trạng thái trục Bơng: Số bơng /khóm Hạt: Mức độ lơng vỏ trấu Bông: Mức độ rụng hạt Bông: Râu Bông: Gié thứ cấp Bơng: Trạng thái bơng Bơng: Thốt cổ Thời gian chin (Giống cảm quang) Số ngày từ gieo đến chin Lá: Sự tàn 39 Mày hạt: Chiều dài 92 40 Mày hạt: Màu sắc 90 41 Hạt thóc: Khối lượng 1000 hạt 92 42 43 Hạt thóc: Chiều dài Hạt thóc: Chiều rộng Hạt thóc: Phản ứng với phenol vỏ trấu Hạt thóc: Mầu sắc với phenol (chỉ giống phản ứng với phenol) Hạt gạo lật: (chiều dài) Hạt gạo lật: Chiều rộng) Hạt gạo lật: (D/R) Hạt gạo lật: Mầu sắc Nội nhũ: Dạng Nội nhũ: Hàm lượng amylose Hạt gạo xát (đã bóc vỏ cám): Độ bạc bụng Nhiệt độ hóa hồ Hạt gạo lật: Hương thơm 92 92 Nâu đỏ Tím Trắng Nhỏ (2,5 mm ngắn vỏ trấu) 2,96 Vàng nhạt (vàng rơm) Trung bình (30 35g) Rất dài (8,5 mm) Trung bình 2,96 92 Có 92 Trung bình 92 92 92 92 92 92 Dài 8,55 Rộng 3,52mm Bán thon Đỏ Có sáp aminose Rất thấp Khơng có độ bạc bụng nhỏ Cao(>74oC) Thơm 9 21 22 23 24 25 37 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 65,90 80,90 65 65 70 70 70 72 90 70 60,80 90 90 90 90 90 90 92 92 92 92 31 3 1 5 7 Bảng 4.3 Bảng mơ tả tính trạng đặc trưng giống Khẩu Lếch TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Tính trạng Lá mầm: Mầu Lá gốc (lá cùng): Mầu bẹ Lá: Mức độ xanh Lá: Sắc tố antoxian Bẹ lá: Sắc tố antoxian Lá: Lông phiến Lá: Tai Lá: Gối (cổ lá) Lá: Sắc tố antoxian gối (cổ lá) Lá: Thìa lìa Lá: Hình dạng thìa lìa Lá: Màu sắc thìa lìa Lá: Độ dầy Lá: Chiều dài phiến Lá: Chiều rộng phiến Lá đòng: Trạng thái phiến (quan sát sớm) Lá đòng: Trạng thái phiến ( quan sát muộn) Khóm (góc than) Thời gan trỗ (giống cảm quang) 50% số có bơng trỗ Bất dục đực Vỏ trấu: Mầu sắc (trừ mỏ hạt) Hạt thóc (màu sắc mỏ hạt) Hoa: Màu sắc vòi nhụy Thân: Đường kính than Thân: Chiều cao (khơng tính bơng, trừ hạt nổi) Thân: Sắc tố antoxian đốt Thân: Sắc tố antoxian long Bơng: Chiều dài trục Bơng: Trạng thái trục Giai đoạn 10 40 Mức độ biểu Xanh Xanh Mã số 1 40 40 40 40 40 40 40 Xanh trung bình Khơng có Khơng có Rất Khơng có Có Khơng có 1 1 40 40 40 40 50-60 50-60 60 Có Nhọn Xanh Trung bình Dài 31,5-45cm Hẹp