Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng năng suất trứng ở giống gà liên minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ BÌNH NGUN ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN VÀ PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT TRỨNG Ở GIỐNG GÀ LIÊN MINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ BÌNH NGUYÊN ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN VÀ PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT TRỨNG Ở GIỐNG GÀ LIÊN MINH Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1: TS Nguyễn Thị Diệu Thúy 2: TS Nguyễn Hữu Đức Hà Nội, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học tơi hướng dẫn tận tình Thầy Cô giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu thuộc Phịng Cơng nghệ Gen động vật - Viện Công nghệ Sinh học Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 18 tháng 06 năm 2020 Tác giả luận án Trần Thị Bình Nguyên i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hoàn thiện luận án nổ lực thân, tơi cịn nhận nhiều đồng hành, quan tâm hỗ trợ từ cá nhân tổ chức Trước tiên, xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Diệu Thúy TS Nguyễn Hữu Đức cô, thầy hướng dẫn tạo điều kiện, hỗ trợ hướng dẫn suốt thời gian thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, thầy cô giáo cán Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Viện Di truyền Nông nghiệp hướng dẫn, tạo điều kiện hỗ trợ tơi q trình học tập, nghiên cứu thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo, cán đồng nghiệp phịng Cơng nghệ gen động vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Khoa Công nghệ sinh học; môn Di truyền giống - Khoa Chăn nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điệu kiện giúp đỡ kiến thức trang thiết bị để tơi hồn thành luận án Xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Cơng Q, Hồng Thị Yến cán Trung tâm ứng dụng tiến Khoa học Công nghệ, Sở Khoa học Công nghệ TP Hải Phịng giúp tơi nhiều sở vật chất, trang thiết bị thí nghiệm q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam hỗ trợ kinh phí tạo điều kiện thuận lợi cho tơi tập trung hồn thiện luận án Tơi xin cảm ơn nguồn kinh phí tài trợ từ đề tài hợp tác KHCN với địa phương mã số VAST.NĐP.01/15-16 - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; đề tài cấp sở mã số: T2018 - 12 - 83 - Học Viện Nông Nông nghiệp Việt Nam hỗ trợ từ nhiệm vụ quỹ gen "Khai thác phát triển giống gà Liên Minh Hải Phòng" mã số NVQG-2013/14 Cuối tối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bạn sinh viên đồng hành, hỗ trợ động viên tơi hồn thành luận án Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Trần Thị Bình Nguyên i MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục bảng iv Danh mục hình vi Danh mục từ viết tắt viii Mở đầu 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Những đóng góp đề tài Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài Chƣơng I Tổng quan tài liệu 1.1 Đánh giá nguồn gen gà 1.1.1 Sơ lược vị trí phân loại gà nhà 1.1.2 Đại cương phân loại học 1.1.3 Cấu trúc hệ gen ty thể gà 1.2 Mối liên quan đa hình gen ứng viên khả sinh sản 18 1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới sản lượng trứng gà 18 1.2.2 Phân tích đa hình gen ứng viên mối liên quan với khả sản xuất trứng gà 21 1.2.3 Nghiên cứu đa hình gen ứng viên liên quan đến tính trạng sinh sản gà giới 24 1.2.4 Tình hình nghiên cứu đa hình gen ứng viên gà Việt Nam 34 1.3 Gà Liên Minh 35 1.3.1 Giới thiệu gà Liên Minh 35 1.3.2 Các nghiên cứu gà Liên Minh 36 Chƣơng II Vật liệu phƣơng pháp 38 2.1 Vật liệu 38 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 38 2.1.2 Các hóa chất 41 2.1.3 Máy móc thiết bị sử dụng 42 2.2 Nội dung nghiên cứu 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 42 2.3.1 Phương pháp thu mẫu máu 42 ii 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.5 2.3.6 2.3.7 2.3.8 Phương pháp tách ADN hệ gen từ máu 43 Phương pháp nhân đoạn ADN kỹ thuật chuỗi polymerase (PCR) 43 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 43 Phương pháp giải trình tự gen 43 Phương pháp phân tích đa hình gen ứng viên 43 Đánh giá tiêu liên quan tính trạng sản xuất trứng gà 44 Khối lượng thể 45 Phương pháp xử lý số liệu 45 Chƣơng iii Kết thảo luận 47 3.1 Kết phân tích đa dạng nguồn gen gà Liên Minh 47 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.2 3.2.1 3.2.2 Tách chiết ADN hệ gen 47 Khuếch đại vùng D-loop ADN ty thể kỹ thuật PCR 48 Giải trình tự nucleotide vùng D-loop 48 Phân tích đa hình nucleotide vùng D-loop gà Liên Minh số gà địa có mã số Genbank 49 Phân tích thị phân tử liên quan tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 69 Theo dõi tiêu liên quan tính trạng sản xuất trứng 90 cá thể gà Liên Minh 69 Tần số alen/kiểu gen đa hình gen PRL, PRLR, VIP, VIPR1, NPY, GH GHR; phân tích mối liên quan với tính trạng sản xuất trứng gà Liên Minh 73 Kết luận kiến nghị 108 Kết luận 108 Kiến nghị 109 Danh mục cơng trình cơng bố liên quan đến luận án 110 Tài liệu tham khảo a iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 2.4 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Mức độ đa dạng mối quan hệ di truyền giống gà dựa trình tự nucleotide D-loop ty thể 13 Nghiên cứu đa hình di truyền gen liên quan tính trạng sinh sản gà 25 Thơng tin trình tự nucleotide vùng D-loop giống gà sử dụng phân tích đa dạng nguồn gen 38 Thông tin mồi sử dụng khuếch đại vùng D-loop 40 Thông tin mồi sử dụng kỹ thuật PCR gen ứng viên 40 Thông tin phản ứng enzyme cắt hạn chế (RE) 41 Kết đo quang phổ ADN hệ gen 47 Chỉ số đa hình di truyền vùng D-loop gà Liên Minh (455 nucleotide) số giống gà địa 50 Phân bố gà Liên Minh haplotype (1050 nucleotide) 62 Kết phân bố gà Liên Minh haplotype 63(455 nucleotide) 63 Một số tiêu sinh sản 90 cá thể gà Liên Minh từ 25 đến 44 tuần tuổi 69 Một số tiêu chất lượng trứng (n=90) 72 Phân tích tần số alen/kiểu gen ba đa hình gen PRL 77 Tần số alen/ kiểu gen PRL/2402 gà Liên Minh số giống gà địa 79 Mối liên quan đa hình gen PRL24 tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 80 Mối liên quan đa hình gen PRL2402 tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 81 Mối liên quan đa hình gen PRL2161 với tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 82 Mối liên quan đa hình gen PRL24 PRL/2402 với tính trạng sản xuất trứng gà Liên Minh 83 Mối liên quan hai đa hình PRL24 PRL/2161 với tiêu liên quan tính trạng sản xuất trứng gà Liên Minh 84 Mối liên quan hai đa hình PRL/2402 PRL/2161 với tính trạng sản xuất trứng gà Liên Minh 84 Tần số alen/kiểu gen hai đa hình gen VIP 88 Mối liên quan đa hình gen VIP/513892 với tính trạng sản xuất iv Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 3.20 Bảng 3.21 trứng giống gà Liên Minh 89 Mối liên quan đa hình gen VIP/338 tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 90 Tần số alen/kiểu gen hai đa hình gen VIPR1 93 Mối liên quan đa hình gen VIPR1/1715301 với tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 94 Mối liên quan đa hình gen VIPR1/1704887 với tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 94 Mối liên quan đa hình gen VIPR1/1715301 VIPR1/1704887 với tính trạng sản xuất trứng gà Liên Minh 95 Bảng 3.22 Phân tích tần số alen/kiểu gen hai vị trí đa hình gen NPY 99 Bảng 3.23 So sánh tần số alen/kiểu gen phân tích đa hình gen NPY/3139135 số giống gà giới 99 Bảng 3.24 Mối liên quan đa hình gen NPY/3139135 với tính trạng sản xuất Bảng 3.25 Bảng 3.26 Bảng 3.27 Bảng 3.28 trứng giống gà Liên Minh 100 Mối liên quan đa hình gen NPY/31394761 với tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 101 Mối liên quan đa hình gen NPY/3139135 NPY/31394761 với tính trạng sản xuất trứng gà Liên Minh 102 Tần số alen/kiểu gen đa hình gen mã hóa GH, GHR gà Liên Minh 106 Mối liên quan đa hình gen GHRi5 tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh 107 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 1.8 Hình 1.9 Hình 1.10 Hình 1.11 Hình 1.12 Hình 1.13 Hình 1.14 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Sơ đồ cấu trúc gen ty thể gà Cây phả hệ di truyền gà địa (dựa trình tự nucleotide vùng D-loop kích thước 455 bp) 10 Cây phả hệ di truyền gà địa (dựa trình tự nucleotide vùng Dloop kích thước 1231 bp) 11 Cây phân loại di truyền gà địa giới (dựa trình tự nucleotide toàn mtDNA) 12 Phân bố haplotypes giống gà địa Việt Nam hai giống gà nuôi Việt Nam (dựa trình tự nucleotide vùng D-loop kích thước 455 bp) 17 Bản đồ QTL: vùng gen NST liên quan đến tính trạng suất trứng gà 22 Bản đồ QTL: Các vùng gen NST liên quan đến tính trạng khối lượng trứng gà 23 Bản đồ QTL NST gà, NST giới tính ♂ (ZZ), ♀ (WZ) 24 Vị trí gen PRL nhiễm sắc thể số gà 28 Vị trí gen VIP nhiễm sắc thể số gà 30 Vị trí gen VIPR1 nhiễm sắc thể số gà 31 Vị trí gen NPY nhiễm sắc thể số gà 32 Vị trí gen GHR nhiễm sắc thể số Z gà 34 Gà trống, gà mái Liên Minh trưởng thành (24 tuần tuổi) 36 Thu mẫu máu gà Liên Minh từ tĩnh mạch cánh (A) bảo quản EDTA-K (B) 42 Máy đo áp lực vỏ trứng 45 Hình đại diện sản phẩm điện di ADN hệ gen gà Liên Minh 47 Ảnh đại diện sản phẩm PCR vùng D-loop gel agarose 1% 48 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide gà Liên Minh với giống gà GenBank 49 So sánh tương đồng trình tự nucleotide vùng D-loop (455 nucleotide) gà Liên Minh giống gà địa Việt Nam 55 So sánh tương đồng trình tự nucleotide đoạn D-loop (1050 bp) gà Liên Minh số gà nhà GenBank 57 Kết phân tích hệ số tương đồng nucleotide vùng D-loop (455 nucleotide) gà Liên Minh phân nhóm giống gà địa Việt Nam 59 Kết phân tích hệ số tương đồng nucleotide vùng D-loop (1050 vi Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Hình 3.22 Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 Hình 3.27 Hình 3.28 nucleotide) gà Liên Minh gà nhà giới 61 So sánh đa hình nucleotide (1050 nucleotide) vùng D-loop haplotype gà Liên Minh 63 So sánh đa hình nucleotide (455 nucleotide) vùng D-loop haplotype gà Liên Minh 64 Cây phân loại di truyền gà Liên Minh giống gà địa Việt Nam 66 Cây phân loại di truyền gà Liên Minh, gà Đơng Tảo, gà Nhiều Ngón gà nhà giới 68 Hình đại diện kết điện di sản phẩm PCR-RFLP đa hình gen PRL gel agarose (điện di sản phẩm PCR gel 1%, sản phẩm cắt gel 2%, 2,5%), M: Thang chuẩn ADN 100 bp (Thermo) 74 Giải trình tự gen vị trí đa hình PRL24 76 Giải trình tự gen vị trí đa hình PRL/2402 76 Giải trình tự gen vị trí đa hình PRL/2161 77 Hình đại diện kết PCR-RFLP đa hình gen VIP, M: Thang chuẩn ADN 100 bp (Thermo) 86 Giải trình tự gen vị trí đa hình VIP/5138982 87 Giải trình tự gen vị trí đa hình VIP/338 87 Hình đại diện kết PCR-RFLP đa hình gen VIPR1, M: Thang chuẩn ADN 100 bp (Thermo) 91 Giải trình tự gen vị trí đa hình VIPR1/1715301 91 Giải trình tự gen vị trí đa hình VIPR1/1704887 92 Hình đại diện kết PCR-RFLP đa hình gen NPY, M: Thang chuẩn ADN 100 bp (Thermo) 97 Giải trình tự gen vị trí đa hình NPY/3139135 98 Giải trình tự gen vị trí đa hình NPY/31394761 98 Hình đại diện kết PCR-RFLP gen GH, GHR, M: Thang chuẩn ADN 100 bp (Thermo) 103 Giải trình tự gen vị trí đa hình GH/2983 105 Giải trình tự gen vị trí đa hình GHRi5 105 Giải trình tự gen vị trí đa hình GHRi2 106 vii S = 4.146 Level DD ID II N 18 68 R-Sq = 3.61% Mean 42.493 46.611 45.673 StDev 2.836 2.863 4.459 R-Sq(adj) = 1.40% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( -* ) ( * -) + -+ -+ -+ 39.0 42.0 45.0 48.0 Pooled StDev = 4.146 One-way ANOVA: MEW 3644 versus NPY/3135935 Source NPY1 Error Total DF 87 89 S = 4.435 SS 73.6 1711.5 1785.1 Level DD ID II MS 36.8 19.7 N 18 68 R-Sq = 4.13% Mean 43.918 48.502 47.129 StDev 2.904 3.250 4.742 F 1.87 P 0.160 R-Sq(adj) = 1.92% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+( -* ) ( * ) ( * -) + -+ -+ -+42.0 45.0 48.0 51.0 Pooled StDev = 4.435 One-way ANOVA: ESI versus NPY/3135935 Source NPY1 Error Total DF 87 89 S = 0.02944 SS 0.000961 0.075404 0.076366 Level DD ID II N 18 68 MS 0.000481 0.000867 R-Sq = 1.26% Mean 1.2700 1.2861 1.2806 StDev 0.0183 0.0335 0.0287 F 0.55 P 0.576 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* ) ( * -) ( * -) -+ -+ -+ -+ -1.245 1.260 1.275 1.290 Pooled StDev = 0.0294 One-way ANOVA: AFE versus NPY/31394761 Source NPY2 Error Total DF 87 89 S = 7.712 Level CC TC TT N 68 15 SS 856.3 5174.3 6030.6 MS 428.2 59.5 R-Sq = 14.20% Mean 179.29 188.35 182.33 StDev 4.86 8.14 6.49 F 7.20 P 0.001 R-Sq(adj) = 12.23% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* ) ( -* ) ( -* -) -+ -+ -+ -+ -175.0 180.0 185.0 190.0 Pooled StDev = 7.71 One-way ANOVA: EN versus NPY/31394761 Source NPY2 Error Total DF 87 89 S = 4.927 Level CC TC TT N 68 15 SS 190.2 2112.3 2302.5 MS 95.1 24.3 R-Sq = 8.26% Mean 47.571 43.838 41.333 StDev 6.852 4.749 4.776 F 3.92 P 0.023 R-Sq(adj) = 6.15% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * -) ( * -) ( * ) -+ -+ -+ -+ 42.0 45.5 49.0 52.5 Pooled StDev = 4.927 One-way ANOVA: MEW versus NPY/31394761 Source NPY2 Error Total DF 87 89 S = 4.181 Level CC TC TT N 68 15 SS 30.8 1521.1 1551.9 MS 15.4 17.5 R-Sq = 1.98% Mean 45.477 46.024 44.452 StDev 4.932 4.174 3.853 Pooled StDev = 4.181 F 0.88 P 0.418 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * -) ( * -) ( -* ) + -+ -+ -+ 43.2 44.8 46.4 48.0 One-way ANOVA: MEW 3644 versus NPY/31394761 Source NPY2 Error Total DF 87 89 S = 4.495 SS 26.9 1758.2 1785.1 Level CC TC TT MS 13.5 20.2 N 68 15 R-Sq = 1.51% Mean 46.307 47.572 46.295 StDev 4.839 4.493 4.351 F 0.67 P 0.516 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( -* ) ( * -) -+ -+ -+ -+ -44.0 46.0 48.0 50.0 Pooled StDev = 4.495 One-way ANOVA: FEW versus NPY/31394761 Source NPY2 Error Total DF 87 89 S = 4.917 SS 74.5 2103.6 2178.1 Level CC TC TT MS 37.3 24.2 N 68 15 R-Sq = 3.42% Mean 40.439 40.998 38.537 StDev 1.714 4.973 5.537 F 1.54 P 0.220 R-Sq(adj) = 1.20% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * ) ( * ) ( -* -) + -+ -+ -+ 37.5 40.0 42.5 45.0 Pooled StDev = 4.917 One-way ANOVA: ESI versus NPY/31394761 Source NPY2 Error Total DF 87 89 S = 0.02951 SS 0.000603 0.075763 0.076366 Level CC TC TT N 68 15 MS 0.000301 0.000871 R-Sq = 0.79% Mean 1.2771 1.2804 1.2867 StDev 0.0325 0.0300 0.0255 F 0.35 P 0.708 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( -* -) ( -* ) + -+ -+ -+ 1.260 1.272 1.284 1.296 Pooled StDev = 0.0295 One-way ANOVA: AFE versus GHR/571 Source GHR/571 Error Total DF 88 89 S = 8.115 SS 235.3 5795.4 6030.6 Level CC TT MS 235.3 65.9 R-Sq = 3.90% N 73 17 Mean 187.42 183.29 StDev 8.35 6.94 F 3.57 P 0.062 R-Sq(adj) = 2.81% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( * -) + -+ -+ -+ 180.0 182.5 185.0 187.5 Pooled StDev = 8.12 One-way ANOVA: MEW versus GHR/571 Source GHR/571 Error Total DF 88 89 S = 4.164 SS 26.2 1525.7 1551.9 Level CC TT MS 26.2 17.3 R-Sq = 1.69% N 73 17 Mean 45.979 44.602 StDev 4.173 4.121 F 1.51 P 0.223 R-Sq(adj) = 0.57% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* -) ( * -) -+ -+ -+ -+ -43.2 44.4 45.6 46.8 Pooled StDev = 4.164 One-way ANOVA: MEW 3644 versus GHR/571 Source GHR/571 Error Total DF 88 89 S = 4.448 Level CC N 73 SS 44.1 1741.0 1785.1 MS 44.1 19.8 R-Sq = 2.47% Mean 47.599 StDev 4.533 F 2.23 P 0.139 R-Sq(adj) = 1.36% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * ) TT 17 45.809 4.045 ( -* ) -+ -+ -+ -+ 45.0 46.5 48.0 49.5 Pooled StDev = 4.448 One-way ANOVA: FEW versus GHR/571 Source GHR/571 Error Total DF 88 89 S = 4.938 SS 32.5 2145.6 2178.1 Level CC TT MS 32.5 24.4 R-Sq = 1.49% N 73 17 Mean 40.834 39.299 StDev 4.912 5.051 F 1.33 P 0.252 R-Sq(adj) = 0.37% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * -) ( -* -) + -+ -+ -+ 37.5 39.0 40.5 42.0 Pooled StDev = 4.938 One-way ANOVA: ESI versus GHR/571 Source GHR/571 Error Total DF 88 89 SS 0.000069 0.076297 0.076366 S = 0.02945 Level CC TT N 73 17 MS 0.000069 0.000867 R-Sq = 0.09% Mean 1.2816 1.2794 StDev 0.0294 0.0295 F 0.08 P 0.779 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+( * ) ( * -) + -+ -+ -+1.2720 1.2800 1.2880 1.2960 Pooled StDev = 0.0294 One-way ANOVA: AFE versus PRL24/PRL2402 Source PRL242402 Error Total S = 8.103 Level DDCT N 22 DF 86 89 SS 383.3 5647.3 6030.6 MS 127.8 65.7 R-Sq = 6.36% Mean 188.05 StDev 7.64 F 1.95 P 0.128 R-Sq(adj) = 3.09% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * ) DDTT IDCT IDTT 44 15 186.66 182.60 189.89 8.59 7.61 7.42 ( * ) ( -* ) ( * ) -+ -+ -+ -+ -180.0 185.0 190.0 195.0 Pooled StDev = 8.10 One-way ANOVA: EN versus PRL24/PRL2402 Source PRL242402 Error Total S = 4.995 Level DDCT DDTT IDCT IDTT N 22 44 15 DF 86 89 SS 156.5 2146.0 2302.5 MS 52.2 25.0 R-Sq = 6.80% Mean 44.636 42.386 45.400 45.111 StDev 4.962 4.484 6.642 4.285 F 2.09 P 0.107 R-Sq(adj) = 3.54% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( -* ) ( * ) ( * -) + -+ -+ -+ 42.0 44.0 46.0 48.0 Pooled StDev = 4.995 One-way ANOVA: MEW versus PRL24/PRL2402 Source PRL242402 Error Total S = 3.952 Level DDCT DDTT IDCT IDTT N 22 44 15 DF 86 89 SS 208.5 1343.4 1551.9 MS 69.5 15.6 R-Sq = 13.43% Mean 46.714 44.215 47.202 48.171 StDev 4.726 3.911 3.682 1.834 F 4.45 P 0.006 R-Sq(adj) = 10.41% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( -* -) ( -* -) ( * ) -+ -+ -+ -+ -44.0 46.0 48.0 50.0 Pooled StDev = 3.952 One-way ANOVA: MEW 3644 versus PRL24/PRL2402 Source PRL242402 Error Total DF 86 89 SS 187.3 1597.9 1785.1 MS 62.4 18.6 F 3.36 P 0.022 S = 4.310 Level DDCT DDTT IDCT IDTT N 22 44 15 R-Sq = 10.49% Mean 47.993 45.878 48.679 49.867 StDev 5.084 4.359 3.660 2.511 R-Sq(adj) = 7.37% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * ) ( -* ) ( * ) ( * -) + -+ -+ -+ 45.0 47.5 50.0 52.5 Pooled StDev = 4.310 One-way ANOVA: FEW versus PRL24/PRL2402 Source PRL242402 Error Total S = 4.909 Level DDCT DDTT IDCT IDTT N 22 44 15 DF 86 89 SS 105.9 2072.2 2178.1 MS 35.3 24.1 R-Sq = 4.86% Mean 40.685 39.593 41.881 42.621 StDev 4.761 5.102 3.958 5.673 F 1.46 P 0.230 R-Sq(adj) = 1.54% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( -* ) ( * ) ( -* ) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 40.0 42.0 44.0 46.0 Pooled StDev = 4.909 One-way ANOVA: AFE versus PRL24/PRL2161 Source PRL242161 Error Total S = 8.219 Level DDCC DDCG DDGG IDCC IDCG IDGG N 16 47 10 13 DF 84 89 SS 356.4 5674.2 6030.6 MS 71.3 67.5 R-Sq = 5.91% Mean 187.33 185.00 187.83 186.00 188.70 182.69 Pooled StDev = 8.22 StDev 3.51 8.81 8.26 * 8.03 7.99 F 1.06 P 0.391 R-Sq(adj) = 0.31% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * -) ( -* -) ( *-) ( -* -) ( * ) ( * -) + -+ -+ -+ 170 180 190 200 One-way ANOVA: EN versus PRL24/PRL2161 Source PRL242161 Error Total S = 5.002 Level DDCC DDCG DDGG IDCC IDCG IDGG N 16 47 10 13 DF 84 89 SS 201.2 2101.3 2302.5 MS 40.2 25.0 R-Sq = 8.74% Mean 47.667 42.688 43.000 51.000 46.100 44.231 StDev 4.041 3.979 4.934 * 5.877 5.776 F 1.61 P 0.167 R-Sq(adj) = 3.31% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( -* -) ( *-) ( * ) ( * ) ( * -) -+ -+ -+ -+ -42.0 48.0 54.0 60.0 Pooled StDev = 5.002 One-way ANOVA: MEW versus PRL24/PRL2161 Source PRL242161 Error Total S = 4.017 Level DDCC DDCG DDGG IDCC IDCG IDGG N 16 47 10 13 DF 84 89 SS 196.3 1355.6 1551.9 MS 39.3 16.1 R-Sq = 12.65% Mean 49.407 43.831 45.184 47.750 47.138 47.880 StDev 3.850 3.772 4.408 * 2.094 3.866 F 2.43 P 0.041 R-Sq(adj) = 7.45% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* ) ( * ) ( * ) ( -* -) ( -* -) ( -* ) -+ -+ -+ -+ -40.0 44.0 48.0 52.0 Pooled StDev = 4.017 One-way ANOVA: MEW 3644 versus PRL24/PRL2161 Source PRL242161 Error Total S = 4.303 DF 84 89 SS 229.8 1555.3 1785.1 MS 46.0 18.5 R-Sq = 12.88% F 2.48 P 0.038 R-Sq(adj) = 7.69% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level DDCC DDCG DDGG IDCC IDCG IDGG N 16 47 10 13 Mean 52.340 45.702 46.515 47.520 48.913 49.411 StDev 2.885 3.958 4.805 * 2.395 3.981 + -+ -+ -+ ( -* -) ( -* ) (-* ) ( * ) ( -* ) ( * ) + -+ -+ -+ 40.0 45.0 50.0 55.0 Pooled StDev = 4.303 One-way ANOVA: ESI versus PRL24/PRL2161 Source PRL242161 Error Total S = 0.02922 DF 84 89 Level DDCC DDCG DDGG IDCC IDCG IDGG SS 0.004650 0.071715 0.076366 MS 0.000930 0.000854 N 16 47 10 13 R-Sq = 6.09% Mean 1.2667 1.2750 1.2855 1.2900 1.2670 1.2869 F 1.09 P 0.372 R-Sq(adj) = 0.50% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * ) ( * ) ( *-) ( * ) ( -* -) ( * ) -+ -+ -+ -+ 1.260 1.290 1.320 1.350 StDev 0.0208 0.0171 0.0315 * 0.0189 0.0382 Pooled StDev = 0.0292 One-way ANOVA: AFE versus PRL2402/PRL2161 Source PRL24022161 Error Total S = 8.425 Level CTCC CTCG CTGG TTCC TTCG TTGG N 10 24 16 36 DF 84 89 SS 68.8 5961.8 6030.6 R-Sq = 1.14% Mean 188.00 185.30 185.79 184.00 187.13 187.33 Pooled StDev = 8.42 StDev 2.65 9.42 8.00 * 8.20 8.73 MS 13.8 71.0 F 0.19 P 0.964 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* -) ( * -) ( -* ) ( * ) ( -* -) (-* ) -+ -+ -+ -+ -170 180 190 200 One-way ANOVA: EN versus PRL2402/PRL2161 Source PRL24022161 Error Total S = 4.946 DF 84 89 Level CTCC CTCG CTGG TTCC TTCG TTGG N 10 24 16 36 SS 247.7 2054.7 2302.5 R-Sq = 10.76% Mean 50.000 46.600 43.625 44.000 42.375 43.028 StDev 2.646 5.461 5.562 * 4.015 4.837 MS 49.5 24.5 F 2.03 P 0.083 R-Sq(adj) = 5.45% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( -* -) ( *-) -+ -+ -+ -+ -36.0 42.0 48.0 54.0 Pooled StDev = 4.946 One-way ANOVA: MEW versus PRL2402/PRL2161 Source PRL24022161 Error Total S = 4.067 DF 84 89 Level CTCC CTCG CTGG TTCC TTCG TTGG SS 162.4 1389.5 1551.9 N 10 24 16 36 R-Sq = 10.46% Mean 50.187 45.029 47.287 45.410 45.149 44.755 StDev 2.700 2.783 4.689 * 4.085 3.962 MS 32.5 16.5 F 1.96 P 0.092 R-Sq(adj) = 5.13% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( * ) ( -* ) ( -* -) ( -* -) ( *-) -+ -+ -+ -+ -40.0 45.0 50.0 55.0 Pooled StDev = 4.067 One-way ANOVA: MEW 3644 versus PRL2402/PRL2161 Source PRL24022161 Error Total S = 4.417 DF 84 89 SS 146.1 1639.0 1785.1 R-Sq = 8.18% MS 29.2 19.5 F 1.50 P 0.199 R-Sq(adj) = 2.72% Level CTCC CTCG CTGG TTCC TTCG TTGG N 10 24 16 36 Mean 51.843 46.625 48.511 49.010 47.132 46.230 StDev 3.745 3.069 4.912 * 4.193 4.496 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* -) ( * -) ( -* -) ( -* -) ( -* ) (-* ) + -+ -+ -+ 40.0 45.0 50.0 55.0 Pooled StDev = 4.417 One-way ANOVA: ESI versus PRL2402/PRL2161 Source PRL24022161 Error Total S = 0.02919 DF 84 89 Level CTCC CTCG CTGG TTCC TTCG TTGG N 10 24 16 36 SS 0.004801 0.071564 0.076366 R-Sq = 6.29% Mean 1.2767 1.2740 1.2817 1.2600 1.2706 1.2886 StDev 0.0231 0.0171 0.0343 * 0.0188 0.0318 MS 0.000960 0.000852 F 1.13 P 0.352 R-Sq(adj) = 0.71% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( -* ) ( -* -) ( -* -) ( * ) ( * -) ( -* ) -+ -+ -+ -+ 1.230 1.260 1.290 1.320 Pooled StDev = 0.0292 ————— 6/11/2019 2:24:15 PM ———————————————————— One-way ANOVA: AFE versus VIPR1/1715301-VIPR1/1704887 Source VIPR1 Error Total DF 83 88 S = 7.643 Level CCCC CCCT CTCC N 29 15 SS 1178.9 4849.0 6027.9 MS 235.8 58.4 R-Sq = 19.56% Mean 193.83 188.93 187.53 StDev 5.27 7.24 7.71 F 4.04 P 0.003 R-Sq(adj) = 14.71% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+( -* -) ( * ) ( -* ) CTCT TTCC TTCT 32 184.69 172.50 180.60 8.64 3.54 4.62 ( *-) ( * -) ( * -) + -+ -+ -+170 180 190 200 Pooled StDev = 7.64 One-way ANOVA: EN versus VIPR1/1715301-VIPR1/1704887 Source VIPR1 Error Total DF 83 88 S = 4.677 Level CCCC CCCT CTCC CTCT TTCC TTCT N 29 15 32 SS 399.9 1815.3 2215.2 MS 80.0 21.9 R-Sq = 18.05% Mean 44.500 41.414 44.533 43.844 53.000 47.200 StDev 5.857 3.621 5.643 4.712 5.657 5.263 F 3.66 P 0.005 R-Sq(adj) = 13.12% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* -) ( -* ) ( * ) ( -* ) ( * ) ( -* ) -+ -+ -+ -+ -40.0 45.0 50.0 55.0 Pooled StDev = 4.677 One-way ANOVA: MEW versus VIPR1/1715301-VIPR1/1704887 Source VIPR1 Error Total DF 83 88 S = 4.266 Level CCCC CCCT CTCC CTCT TTCC TTCT N 29 15 32 SS 34.2 1510.6 1544.9 MS 6.8 18.2 R-Sq = 2.22% Mean 46.697 45.677 46.179 45.346 42.715 46.474 StDev 4.360 4.284 4.063 4.297 3.981 4.539 F 0.38 P 0.864 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( * -) ( -* -) ( * -) ( * ) ( * ) -+ -+ -+ -+ -38.5 42.0 45.5 49.0 Pooled StDev = 4.266 One-way ANOVA: MEW 3644 versus VIPR1/1715301-VIPR1/1704887 Source VIPR1 Error Total DF 83 88 SS 30.7 1746.8 1777.5 S = 4.588 Level CCCC CCCT CTCC CTCT TTCC TTCT N 29 15 32 MS 6.1 21.0 F 0.29 R-Sq = 1.73% Mean 48.117 47.399 47.698 46.685 45.160 48.100 StDev 4.721 4.472 4.317 4.752 3.564 5.045 P 0.916 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( -* -) ( * -) -+ -+ -+ -+ 42.0 45.5 49.0 52.5 Pooled StDev = 4.588 One-way ANOVA: ESI versus VIPR1/1715301-VIPR1/1704887 Source VIPR1 Error Total DF 83 88 S = 0.02854 SS 0.008739 0.067625 0.076364 Level CCCC CCCT CTCC CTCT TTCC TTCT N 29 15 32 MS 0.001748 0.000815 R-Sq = 11.44% Mean 1.2700 1.2852 1.2627 1.2869 1.2700 1.2960 StDev 0.0179 0.0241 0.0266 0.0329 0.0000 0.0397 F 2.15 P 0.068 R-Sq(adj) = 6.11% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+( * ) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* ) + -+ -+ -+1.250 1.275 1.300 1.325 Pooled StDev = 0.0285 One-way ANOVA: AFE versus NPY3139135/NPY31394761 Source NPY Error Total DF 83 88 S = 7.651 Level N SS 1057.2 4858.9 5916.0 MS 211.4 58.5 R-Sq = 17.87% Mean StDev F 3.61 P 0.005 R-Sq(adj) = 12.92% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+- DDTC IDTC IDTT IICC IITC IITT 15 50 11 197.33 187.33 181.00 179.29 188.12 183.27 4.16 7.52 7.21 4.86 8.28 6.56 ( -* ) ( -* -) ( * ) ( * -) (-*-) ( -* ) + -+ -+ -+180 190 200 210 Pooled StDev = 7.65 One-way ANOVA: MEW versus NPY3139135/NPY31394761 Source NPY Error Total DF 83 88 S = 4.196 Level DDTC IDTC IDTT IICC IITC IITT N 15 50 11 SS 61.6 1461.2 1522.8 MS 12.3 17.6 R-Sq = 4.04% Mean 43.207 46.617 46.577 45.477 46.014 44.245 StDev 3.001 3.113 1.356 4.932 4.483 4.163 F 0.70 P 0.625 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * -) ( -* -) ( -* -) ( * ) ( * -) ( * -) + -+ -+ -+ 38.5 42.0 45.5 49.0 Pooled StDev = 4.196 One-way ANOVA: MEW 3644 versus NPY3139135/NPY31394761 Source NPY Error Total DF 83 88 S = 4.500 Level DDTC IDTC IDTT IICC IITC IITT N 15 50 11 SS 63.1 1680.9 1744.1 MS 12.6 20.3 R-Sq = 3.62% Mean 44.927 48.545 48.287 46.307 47.439 46.243 StDev 2.558 3.209 4.198 4.839 4.864 4.343 Pooled StDev = 4.500 F 0.62 P 0.682 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( * -) ( * ) ( * -) ( -* ) ( -* -) + -+ -+ -+ 42.0 45.5 49.0 52.5 One-way ANOVA: ESI versus NPY3139135/NPY31394761 Source NPY Error Total DF 83 88 S = 0.02975 SS 0.001938 0.073442 0.075380 Level DDTC IDTC IDTT IICC IITC IITT N 15 50 11 MS 0.000388 0.000885 R-Sq = 2.57% Mean 1.2767 1.2827 1.3033 1.2771 1.2800 1.2855 StDev 0.0153 0.0349 0.0208 0.0325 0.0295 0.0246 Pooled StDev = 0.0297 F 0.44 P 0.821 R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* ) ( -* -) ( * -) ( * ) ( * ) ( * ) -+ -+ -+ -+ -1.250 1.275 1.300 1.325