Khảo sát nguồn gen giống lúa màu kháng bệnh đạo ôn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT NGUỒN GEN GIỐNG LÚA MÀU KHÁNG BỆNH ĐẠO ÔN Người thực : Ngơ Chí Đức Khố : 62 Ngành : Công nghệ sinh học Người hướng dẫn : GS.TS.PHAN HỮU TƠN Hà Nội, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn tất nghiệm đề tài tơi thực Tồn số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu trước Tơi xin cam đoan tồn thơng tin trích dẫn sử dụng luận văn trích dẫn rõ nguồn gốc, theo quy định giúp đỡ cho luận văn cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Ngơ Chí Đức i     LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành cách thành công, để đạt điều này, ngồi cố gắng nỗ lực cịn có đồng hành, quan tâm, bảo tận tình thầy giáo, cán bộ, bạn bè, anh chị trước phịng thí nghiệm mơn Sinh học phân tử Công nghệ sinh học ứng dụng – Khoa Công nghệ sinh học Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành t ới ban quản lý Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện hết mức cho tơi thực khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tới ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học thầy cô môn hỗ trợ, hướng dẫn chia sẻ kiến thức vơ q báu suốt q trình làm khóa luận phịng thí nghiệm mơn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng thành kính, biết ơn sâu sắc đến GS TS Phan Hữu Tôn trực tiếp hướng dẫn, dành thời gian kinh nghiệm quý báu chia sẻ cho từ ngày khóa luận hồn thiện Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể phịng ban Khoa Cơng nghệ sinh học giúp đỡ nhiệt tình anh chị bạn phịng thí nghiệm, tạo ều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóaa luận Và cuối cùng, với tất kính trọng, biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời biết ơn vơ hạn tới gia đình người thân bạn bè sát cánh, động viên tơi để vượt qua giai đoạn khó khăn áp lực q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày… tháng… năm 2021 Sinh viên thực Ngơ Chí Đức ii     MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan lúa tình hình sản xuất 2.1.1 Nguồn gốc lúa 2.1.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học lúa 2.1.3 Tình hình sản xuất lúa gạo giới 2.1.4 Tình hình sản xuất lúa gạo Việt Nam 10 2.2 Tổng quan bệnh đạo ôn 14 2.2.1 Tác nhân gây bệnh 14 2.2.2 Sự lây lan xâm nhiễm bệnh 14 2.2.3 Phân loại triệu chứng 14 2.2.4 Tác hại bệnh đạo ôn 17 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh 18 2.2.6 Phòng bệnh 19 2.2.7 Phương pháp nghiên cứu : 19 Phần VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu 21 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu : 21 3.3.1 Bố trí thí nghiệm ruộng 21 3.3.2 Phương pháp đánh giá số đặc điểm tính trạng nơng sinh học 22 iii     3.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo đánh giá khả kháng bệnh Đạo ôn 23 3.4.1 Phương pháp nuôi cấy nấm 23 3.4.2 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 23 3.5 Sử dụng thị phân tử đánh giá khả mang gen kháng bệnh đạo ôn pita pika2 24 3.5.1 Chiết tách DNA tổng số 24 3.6 Phương pháp PCR 25 3.6.1 Kiểm tra sản phẩm PCR 26 3.6.2 Phương pháp xử lí số liệu 27 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1 Kết đánh giá số đặc điểm nông sinh học 28 4.1.1 Thời gian sinh trưởng 28 4.1.2 Chiều cao cây,chiều dài cổ chiều dài 29 4.1.3 Số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu 31 4.1.4 Năng suất yếu tố cấu thành suất 32 4.2 Kết lây nhiễm nhân tạo 34 4.3 Kết PCR xác định gen kháng bệnh đạo ôn 36 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iv     DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNSH: Công nghệ sinh học DNA: Deoxyribo Nucleic Acid EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid IRRI: The International Rice Institute – Viện Nghiên cứu lúa quốc tế NST: Nhiễm sắc thể NSLT: Năng suất lý thuyết SDS: Sodium dodecyl sulphate PCR: Polymerase Chain Reaction – phản ứng khuếch đại gen RELP: Restriction Fragment Length Polymorphisms – đa hình chiều dài đoạn DNA dựa điểm cắt enzyme giới hạn TE: Tris – EDTA KHKT: Khoa học kĩ thuật v     DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần dung dịch tách chiết DNA 24 Bảng 2: Thành phần dung dịch TE 25 Bảng 3: Trình tự primer: 25 Bảng 4: Thành phần cocktaik sử dụng cho phản ứng 25 Bảng 5: Chiều cao cây, chiều dài cổ chiều dài 30 Bảng 6: Số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu mẫu giống lúa 31 Bảng 7: Năng suất yếu tố cấu thành nên suất 33 Bảng 8: Kết phản ứng chủng vi khuẩn với mẫu giống lúa thí nghiệm 35 vi     DANH MỤC HÌNH   Hình 1: Vết bệnh đạo ơn điển hình   16 Hình 2: Vết bệnh hình chấm kim   16 Hình 3: Đạo ơn cổ   . 17 Hình 4: Đạo ơn cổ gié/cổ   . 17 Hình 5: Đạo ơn cuống hạt   17  vii     TÓM TẮT Tên đề tài: KHẢO SÁT NGUỒN GEN GIỐNG LÚA MÀU KHÁNG BỆNH ĐẠO ÔN Bệnh đạo ôn bệnh hại lúa phân bố rộng tác hai nghiêm trọng Bệnh đạo ôn nấm Pyricularia oryzae gây ra, gây hại nghiêm cổ bông, mức độ tác hại bệnh liên quan đến nhiều yếu tố phân bón, thời tiết, thời vụ, Bệnh gây hại làm cho bị cháy, trổ héo, nấm xâm nhập vào cổ làm cho gãy hạt bị lép, lửng làm giảm nghiêm trọng đến xuất, chí khơng cho thu hoạch Để phịng trừ bệnh đạo ôn người ta sử dụng nhiều biện pháp khác áp dụng biện pháp kỹ thuật canh tác, sử dụng phân bón, sử dụng thuốc hóa học, nhiên biện pháp chưa thực triệt để cịn gây ảnh hưởng khơng tốt tới mơi trường Các nghiên cứu cho thấy biện pháp chọn tạo giống kháng bệnh phương pháp phòng trừ bệnh đạo ơn có hiệu cao Nhưng giống chứa gen kháng cịn chứa số gen khác gây ảnh hưởng đến khả kháng bệnh đạo ôn giống chứa gen khác Trong có phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng thị phân tử để xác định gen kháng mang lại hiệu cao lại không gây ô nhiễm mơi trường Do chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Khảo sát nguồn gen giống lúa màu kháng bệnh đạo ơn “ Mục đích nghiên cứu: Khảo sát khả kháng bệnh đạo ôn số dòng lúa màu Phương pháp nghiên cứu:  Phương pháp bố trí thí nghiệm ngồi ruộng  Phương pháp đánh giá số đặc điểm nông sinh học  Phương pháp lây nhiễm nhân tạo đánh giá khả kháng bệnh đạo ôn  Phương pháp PCR Bố cục khóa luận: Ngồi phần mở đầu kết luận, mục lục, phụ lục danh mục tài liệu tham khảo, nội dung luận văn chia thành phần: viii     o Phần 1: Mở đầu o Phần 2: Tổng quan tài liệu o Phần 3: Vật liệu phương pháp nghiên cứu o Phần 4: Kêt nghiên cứu o Phần 5: Kết luận kiến nghị Kết nghiên cứu:  Qua khảo sát nông sinh học giống lúa mẫu giống có vỏ lụa tím Trong giống có suất tốt điển hình là: KT, 11487-1, 11487-2, HC11…  Kết lây nhiễm giống sử dụng cho thấy tất giống điều nhiễm có số giống kháng vừa như: 94F13, 98F16, 94F15, HC1-1, HC1-2, TC1…  Sau sử dụng thị phân tử AND xác định gen có 10 giống chứa gen Pita, 10 giống chứa gen Pita giống chứa gen Pita Pita HC1-1 TC Kết luận:  Qua khảo sát nông sinh học giống lúa mẫu giống có vỏ lụa tím Trong giống có suất tốt điển hình là: KT, 11487-1, 11487-2, HC11…  Kết lây nhiễm giống sử dụng cho thấy tất giống điều nhiễm có số giống kháng vừa như: 94F13, 98F16, 94F15, HC1-1, HC1-2, TC1…  Sau sử dụng thị phân tử AND xác định gen có 10 giống chứa gen Pita, 10 giống chứa gen Pita giống chứa gen Pita Pita HC1-1 TC ix     Pita Phản ứng PCR tiến hành với tổng thể tích 25 ml gồm thành phần sau: ml ADN genome (25 - 50 ng); 0,2 mM mồi xuôi; 0,2 mM mồi ngược; 100 mM dNTP; 10 mM Tris-Cl (pH 8,3); 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2 ; 0,1% Triton X100; đơn vị enzyme Taq polymerase Chu kì nhiệt phản ứng: 95°C - phút, 29 chu kì, với chu kì có bước: 95°C - 30 giây, 50°C - 30 giây, 72°C - 30 giây, sau giữ 72°C phút Pita Thể tích phản ứng PCR 25 ll chứa 50 ng mẫu, 0,2 lM mồi, 1,5 mM MgCl2, 0,02 lM dNTP U Taq polymerase Các Hồ sơ chu kỳ PCR bao gồm biến tính ban đầu 94 C phút, sau 35 chu kỳ 94 C 60 giây, 55 C 30 giây 72 C 60 giây, với gia hạn cuối 72 C phút Cùng DNA ladder 100bp Kết điện di gel agarose % 3.6.1 Kiểm tra sản phẩm PCR Sau tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gel chạy điện di để xác định gen kháng bệnh đạo ôn - Chuẩn bị dung dịch TAE: pha loãng dung dịch TAE 50X thành dung dịch TAE 1X cách pha 10ml TAE 490ml nước cất - Chuẩn bị gel 1,5% để điện di sản phẩm PCR: cân 1,5g agarose 100ml TAE, sau đun nóng dung dịch lị vi sóng dung dịch trở lên suốt, lấy gel nguội đổ khuôn đặt sẵn để gel cứng lại rút lược - Nhỏ 10µl sản phẩm PCR vào lỗ giếng Đặt gel thiết bị điện di có môi trường TAE 1X chạy chế độ 60V khoảng từ 30 đến 45 phút - Quan sát chụp ảnh gel tia UV để đánh giá có hay khơng có gen kháng 26     3.6.2 Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu sử lý theo tiêu chuẩn 558 10TCN- 2002 BNNVPTNT, phần mềm excel 2016 giáo trình “ Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng” Phạm Chí Thành (1988): - Giá trị trung bình: X= - Độ lệch chuẩn so với giá trị trung bình: (nếu n>=25) S= S= (nếu n 160 ngày Thời gian sinh trưởng tiêu quan trọng có ý nghĩa việc bố trí thời vụ gieo cấy, kỹ thuật canh tác phát huy nguồn lực đất canh tác.Những năm rét đậm lúa vụ Xuân kéo dài thời gian sinh trưởng năm ấm trời.Cùng vụ Xuân gieo sớm thời gian sinh trưởng kéo dài gieo muộn.Trong vụ mùa nhiệt độ biến động nên thời gian sinh trưởng giống tương đối ổn định Nhìn chung thời gian sinh trưởng dài hay q ngắn khơng cho suất cao Vì thời gian sinh trưởng dài khó tránh khỏi ảnh hưởng xấu thiên tai gây ra, thời gian sinh trưởng ngắn làm giảm tỷ lệ chất khơ tích lũy Ngồi thời gian sinh trưởng giống khác phương thức gieo cấy: lúa cấy có thời gian sinh trưởng dài lúa gieo thẳng - 10 ngày có thời gian bén rễ hồi xanh Như nắm quy luật sinh trưởng phát triển lúa chủ động áp dụng biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi cho trình sinh trưởng phát triển nhằm tạo suất cao như: bố trí thời vụ gieo cấy, tranh thủ gieo cấy sớm thời vụ cho phép để kéo dài thời gian sinh trưởng sinh dưỡng tạo điều kiện thuận lợi cho q trình tích lũy chất khơ, cung cấp chất dự trữ cho trình sinh trưởng tạo suất cao 28     4.1.2 Chiều cao cây, chiều dài cổ chiều dài Bông lúa yếu tố quan trọng định đến suất lúa Bông lúa định 74% suất ruộng lúa nghiên cứu bơng có ý nghĩa lớn chọn giống Các đặc trưng bơng bao gồm: chiều dài bơng chính, chiều dài cổ Chiều dài đặc điểm di truyền giống, mẫu giống khác chiều dài khác Tuy nhiên chiều dài khác chế độ canh tác, chế độ chăm sóc, mật độ cấy Chiều dài bơng tiêu liên quan đến suất, biểu khả chứa hạt Chiều dài bơng cao có số lượng hạt lớn, tiềm năng suất cao Chiều dài cổ lớn dễ bị gẫy cổ dễ bị đạo ôn cổ bông, dẫn đến làm giảm suất giống Chiều cao tính trạng quan trọng liên quan đến khả chống đổ chịu thâm canh lúa Chiều cao chịu ảnh hưởng đặc điểm giống phụ thuộc vào đặc điểm mơi trường thời vụ, bón phân mật độ cấy Trong điều kiện thời vụ, mật độ, phân bón, chiều cao gen quy định Lựa chọn chiều cao để chọn phương thức canh tác thích hợp Chiều cao chia làm nhóm: bán lùn (125cm) 29     Bảng 5: Chiều cao cây, chiều dài cổ chiều dài STT Giống Chiều cao Kiểu Chiều dài Chiều dài cổ H2CT 127.1 Cao 35.94 4.34 TC2 120.3 Trung bình 30.3 3.42 45F16 118.5 Trung bình 38.04 5.56 94F13 129.6 Cao 28.486 4.1 98F16 127.7 Cao 33.66 94F15 124.8 Trung bình 37.08 3.5 HC1-1 122.3 Trung bình 33.28 3.21 HC1-2 127.5 Cao 31.4 2.65 TC1 121.6 Trung bình 33.52 7.11 10 74613 125.6 Cao 40.36 4.6 11 11487-1 113.3 Trung bình 32.36 3.12 12 11487-2 114.6 Trung bình 30.6 3.23 13 63F13 123.7 Trung bình 31.36 3.56 14 KT 140.5 Cao 27.8 2.12 15 11279 124.6 Trung bình 30.04 4.45 16 44F14 123.3 Trung bình 33.66 3.31 17 63BC2F16 122.2 Trung bình 37 3.45 18 11053 125.7 Cao 37.3 3.12 19 11300 126.4 Cao 43.3 4.46 20 11079 127.6 Cao 41.1 3.11 21 11413 134.0 Cao 44 3.35 22 KT 111.2 Trung bình 27.18 12.12 23 KĐ 123.6 Trung bình 33.5 7.52 24 TC 122.7 Trung bình 36 4.1 25 10132 129.3 Cao 27.3 3.33 Kết theo dõi chiều cao mẫu giống cho thấy: - Giống cao (>125 cm) : 11 giống - Giống trung bình (90 – 125cm) :14 giống - Giống thấp (