Luận văn khảo sát quy trình trích ly, phân đoạn fucoidan từ rong nâu và thử các hoạt tínhsinh học của oligofucan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GỊN ĐỖ DUY KHÁNH KHẢO SÁT QUY TRÌNH TRÍCH LY, PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN TỪ RONG NÂU VÀ THỬ CÁC HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA OLIGOFUCAN Luận văn Thạc sĩ chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số ngành: 8540101 Hướng dẫn khoa học: TS PHAN THẾ ĐỒNG Đồng hướng dẫn: TS NGUYỄN ĐẶNG HẢI ĐĂNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2018 LỜI CÁM ƠN Luận văn thực Trường Đại học Công nghệ Sài Gịn hướng dẫn thầy TS Phan Thế Đồng đồng hướng dẫn TS Nguyễn Đặng Hải Đăng Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến Thầy TS Phan Thế Đồng TS Nguyễn Đặng Hải Đăng người tạo điều kiện tốt nhất, bảo, giúp đỡ bước suốt trình thực luận văn Tôi xin bày tỏ long biết ơn tới thầy khoa Cơng nghệ thực phẩm, Phịng Sau Đại học – Trường Đại học Cơng nghệ Sài Gịn tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập, nghiện cứu hồn thành khó học Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Cha mẹ, người than gia đình, đồng nghiệp quan tạo điều kiện tốt nhất, động viên tơi suốt q trình học tập Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Học viên Đỗ Duy Khánh HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH i TĨM TẮT Đề tài “ Khảo sát q trình trích ly, phân đoạn fucoidan từ rong nâu thử hoạt tính sinh học oligofucan” thực phịng Thí nghiệm Hóa học Vi sinh, Trường Đại học Cơng nghệ Sài Gịn từ tháng tới tháng 10 năm 2018 Mục tiêu đề tài xây dựng phương pháp trích ly xử lý fucoidan để thu nhận chế phẩm có chuỗi ngắn bảo tồn đươc hoạt tính sinh học fucoidan Để đạt mục tiêu này, trước tiên, đề tài khảo sát thơng số kỹ thuật q trình trích ly thời gian trích ly, nồng độ CaCl2 để tinh fucoidan, đồng thời kết hợp với sóng siêu âm tăng hiệu suất trích ly Fucoidan sau trích ly mang phân đoạn sử dụng phương pháp chiếu xạ với tia Gamma-coban 60 mức khác (5kGy, 10 kGy, 15 kGy, 20 kGy) nhằm tăng hoạt tính sinh học fucoidan Các thử nghiệm hoạt tính sinh học oligofucan: khả chống oxi hóa, khả kháng enzyme αD-glucosidase khả chống vi sinh vật tiến hành Kết bước đầu tìm thơng số thích hợp cho q trình trích ly fucoidan từ rong nâu Sử dụng dung môi nước nhiệt độ 100oC, thời gian 60 phút cho hiệu suất cao đạt 7.47 ± 0.02 % Bên cạnh việc xử lý fucoidan với tia Gammacoban 60 cho thấy liều chiếu xạ 20 kGy khối lượng phân tử chế phẩm đạt 2000 Da nhỏ 1/2 so với khơng chiếu xạ Q trình khảo sát số hoạt tính sinh học chế phẩm cho thấy khả chống oxi hóa khả kháng enzyme αD-glucosidase tương đối cao Tuy nhiên chế phẩm fucoidan khả kháng khuẩn HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH .7 CHƯƠNG GIỚI THIỆU .9 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Tính cấp thiết đề tài 10 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 10 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .11 2.1 RONG BIỂN 12 2.1.1 Giới thiệu chung rong biển .12 2.1.2 Phân loại phân bố rong biển (Baweja ctv 2016) 13 2.1.3 Ứng dụng rong biển 16 2.2 FUCOIDAN 21 2.2.1 Giới thiệu fucoidan 21 2.2.2 Thành phần cấu tạo fucoidan rong nâu 22 2.2.3 Tính đa dạng cấu trúc fucoidan rong nâu 24 2.2.4 Hoạt tính sinh học fucoidan 28 2.3 TÁC DỤNG CHIẾU XẠ TIA GAMMA COBALT-60 .33 2.4 CHIẾT TÁCH FUCOIDAN TỪ RONG NÂU 33 2.5 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH FUCOIDAN .36 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1 Nguyên liệu nghiên cứu: 38 3.1.1 Nguyên liệu: 38 3.1.2 Vật liệu: 38 3.1.3 Dụng cụ thiết bị : .38 3.2 Nội dung nghiên cứu: 39 3.2.1 Các nội dung nghiên cứu: 39 3.2.2 Phương pháp luận phương pháp nghiên cứu: .40 3.2.3 Bố trí thí nghiệm chính: 41 3.2.4 Phương pháp trích ly fucoidan từ rong nâu .42 3.2.5 Phương pháp đo hàm lượng kim loại có fucoidan phương pháp Kjeldahl .45 3.2.6 Phương pháp đo hàm lượng kim loại có mẫu: .46 3.2.7 Phương pháp xác định KLPT trung bình fucoidan 46 3.2.8 Phương pháp chiếu xạ Cobalt-60 cắt mạch phân tử fucoidan 47 3.2.9 Xác định số liên kết fucoidan phương pháp phổ hồng ngoại IR xác định hàm lượng sulfate có fucoidan 47 3.2.10 Xác định thành phần monosaccharide fucoidan phương pháp tạo dẫn xuất ghi GC-MS [9] 49 3.3 Đánh giá hoạt tính fucoidan sau chiếu xạ 50 3.3.1 Xác định số chống oxy hóa: .50 3.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật fucoidan 51 3.3.3 Phương pháp xác định khả ức chế enzyme α-amylase α- glucosidase 52 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53 4.1 Kết k h ả o s t phương pháp tách chiết thu nhận fucoidan thô từ rong nâu 53 4.1.1 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trích ly .53 4.1.2 Khảo sát nồng độ CaCl2 để tinh dịch chiết fucoidan .54 4.2 Khảo sát ảnh hưởng sóng siêu âm đến hiệu suất trích ly .55 4.2.1 Ảnh hưởng cơng suất siêu âm đến hiệu suất trích ly 55 4.2.2 Ảnh hưởng thời gian xử lý sóng siêu âm đến hiệu suất 56 4.3 Đánh giá tạp chất fucoidan thu nhận 57 4.4 Kết cắt mạch fucoidan phương pháp chiếu xạ gamma Coban 60 .58 4.5 Kết xác định số liên kết fucoidan phương pháp phổ hồng ngoại trước sau chiếu xạ: 59 4.6 Xác định hàm lượng sulfate có fucoidan: 61 4.7 Phân tích thành phần đường đơn fucoidan: 62 4.8 Kết khảo sát số hoạt tính fucoidan: 63 4.8.1 Khả chống oxi hóa fucoidan: 63 4.8.2 Khả ức chế hoạt động enzyme α-D- glucosidase .64 4.8.3 Khả ức chế vi sinh vật fucoidan thu nhận từ rong nâu 69 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 5.1 Kết luận 74 5.2 Kiến nghị: .74 TÀI LIỆU THAM KHẢO .76 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 76 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 77 PHỤ LỤC 82 HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT - SPs Polysaccharide mang nhóm sulfate - KLPT Khối lượng phân tử - ICP_MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry): Phương pháp Quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ - IR (Infrared spectroscopy): phổ hồng ngoại - GPC - Gel peamenation chromatography): Phương pháp sắc kí gel thấm qua - GC-MS (Gas Chromatograph Mass Spectrometer Shimadzu): phương pháp tạo dẫn xuất ghi GC-MS - DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2-1 Thành phần hố học (%) số lồi rong biển 19 Bảng 2-2 Thành phần cấu tạo số fucoidan (Li ctv, 2008) 22 Bảng 2-3 Hàm lượng đường đơn loại rong 24 Bảng 4-1 Hàm lượng kim loại nặng (µg/g) có fucoidan sau trích ly 58 Bảng 4-2 Kết phân tích hàm lượng đường đơn có mẩu fucoidan sau chiếu xạ 62 Bảng 4-3 Hiệu suất ức chế (%) fucoidan không chiếu xạ enzyme α-Dglucosidase .64 Bảng 4-4 Hiệu suất ức chế (%) fucoidan chiếu xạ kGy enzyme α-Dglucosidase .65 Bảng 4-5 Hiệu suất ức chế (%) fucoidan chiếu xạ 10 kGy enzyme α-Dglucosidase .66 Bảng 4-6 Hiệu suất ức chế (%) fucoidan chiếu xạ 15 kGy enzyme α-Dglucosidase 67 Bảng 4-7 Hiệu suất ức chế (%) fucoidan chiếu xạ 20 kGy enzyme α-Dglucosidase 68 Bảng PL-0-1 Số liệu khảo sát 84 Bảng PL-2 Bảng anova (Phân tích biến lượng) .84 Bảng PL-3 Giá trị trung bình, Sd 85 Bảng PL-4 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 85 Bảng PL-5 Số liệu khảo sát 85 Bảng PL-6 Bảng anova (Phân tích biến lượng) .85 Bảng PL-7 Giá trị trung bình, Sd 86 Bảng PL-8 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 86 Bảng PL-9 Số liệu khảo sát 86 Bảng PL-10 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 86 Bảng PL-11 Giá trị trung bình, Sd .87 Bảng PL-12 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 87 Bảng PL-13 Số liệu khảo sát 87 Bảng PL-14 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 87 Bảng PL-15 Giá trị trung bình, Sd .88 HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH Bảng PL-16 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 88 Bảng PL-17 Số liệu khảo sát 88 Bảng PL-18 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 88 Bảng PL-19 Giá trị trung bình, Sd .89 Bảng PL-20 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 89 Bảng PL-21 Số liệu khảo sát 90 Bảng PL-22 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 90 Bảng PL-23 Giá trị trung bình, Sd .90 Bảng PL-24 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 91 Bảng PL-25 Số liệu khảo sát 91 Bảng PL-26 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 91 Bảng PL-27 Giá trị trung bình, d 92 Bảng PL-28 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 92 Bảng PL-29 Số liệu khảo sát 92 Bảng PL-30 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 92 Bảng PL-31 Giá trị trung bình, d 93 Bảng PL-32 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 93 Bảng PL-33 Số liệu khảo sát 93 Bảng PL-34 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 94 Bảng PL-35 Giá trị trung bình, d 94 Bảng PL-36 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 94 Bảng PL-37 Số liệu khảo sát 95 Bảng PL-38 Bảng anova (Phân tích biến lượng) 95 Bảng PL-39 Giá trị trung bình, sd 95 Bảng PL-40 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD 96 Bảng PL-41 Hàm lượng sulfate có fucoidan chiếu xạ liều lượng khác .97 HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2-1 Rong lục (Ulva) Rong nâu (Sargassum), Rong đỏ (Gracilaria) .15 Hình 2-2 Sơ đồ cấu trúc fucoidan từ F vesiculosus (Percival & Ross,1950) 25 Hình 2-3 Cấu trúc phân đoạn oligo-fucoidan phân lập từ A nodosum 26 Hình 2-4 Cấu trúc fucoidan với liên kết 1→3 sulfate C-4 E.kurone 26 Hình 2-5 Cấu trúc fucoidan phân lập từ Chorda filum 27 Hình 2-6 Cấu trúc phân đoạn fucoidan phân lập từ Fucus distichus L 28 Hình 3-1Tóm lược bước q trình nghiên cứu 40 Hình 3-2 Sơ đồ q trình trích ly fucoidan từ rong nâu .43 Hình 4-1 Biểu đồ khảo sát hiệu suất trích ly với thời gian trích ly khác .53 Hình 4-2 Biểu đồ khảo sát hiệu suất trích ly với nồng độ CaCl2 54 Hình 4-3 Biểu đồ khảo sát hiệu suất trích ly với cơng suất siêu âm khác nhau, thời gian trích ly 15 phút .55 Hình 4-4 Biểu đồ khảo sát hiệu suất trích ly với thời gian siêu âm khác 56 Hình 4-5 A: Kết tủa fucoidan với EtOH 90%(v/v), B: Fucoidan thu sau sấy đông khô 57 Hình 4-6 Kết phân tích GPC mẫu fucoidan trước chiếu xạ, (a); sau chiếu xạ liều xạ 5KGy, (b); 10KGy, (c); 15KGy, (d); 20KGy, (e) 59 Hình 4-7 Phổ hồng ngoại phân đoạn fucoidan tách chiết nước nóng trước chiếu xạ 60 Hình 4-8 Phổ hồng ngoại phân đoạn fucoidan tách chiết nước nóng sau chiếu xạ với mức chiếu xạ khác .61 Hình 4-9 Hàm lượng sulfate có mặt fucoidan qua liều chiếu xạ khác tia Gamma Coban 60 62 Hình 4-10 Khả chống oxi hóa fucoidan sau chiếu xạ với mức khác nồng độ khác nahu A: Fucoidan không chiếu xạ; B: Fucoidan chiếu xạ kGy; C: Fucoidan chiếu xạ 10 kGy; D: Fucoidan chiếu xạ 15 kGy; E: Fucoidan chiếu xạ 20kGy 63 Hình 4-11 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn mẫu fucoidan khơng chiếu xạ 69 Hình 4-12 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn mẫu fucoidan chiếu xạ kGy .70 Hình 4-13 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn mẫu fucoidan chiếu xạ 10 kGy 71 Hình PL-1 Rong nâu nguyên liệu thu mua tỉnh Khánh Hòa 82 HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Bảng PL-34 Bảng anova (Phân tích biến lượng) Bảng PL-35 Giá trị trung bình, d Bảng PL-36 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 94 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP - Chiếu xạ 20 kGy: Số lần đo quang phổ màu TB SD %I TB SD 0.10 0.567 0.61 0.572 0.583 0.023515952 48.45454545 44.54545455 48 47 2.137813821 Nồng độ fucoidan (mg/ml) 0.30 0.50 0.527 0.495 0.521 0.481 0.535 0.497 0.52766667 0.491 0.00702377 0.008717798 52.0909091 55 52.6363636 56.27272727 51.3636364 54.81818182 52.030303 55.36363636 0.63852447 0.792527081 Bảng PL-37 Số liệu khảo sát Bảng PL-38 Bảng anova (Phân tích biến lượng) Bảng PL-39 Giá trị trung bình, sd HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 95 0.80 0.449 0.435 0.447 0.443666667 0.007571878 59.18181818 60.45454545 59.36363636 59.66666667 0.688352527 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Bảng PL-40 So sánh khác biệt nghiệm thức trắc nghiệm LSD  Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt động enzyme α-D-Glucosidase fucoidan Đường chuẩn 4-nitro-phenol ĐƯỜNG CHUẨN 4-NITRO-PHENOL 2.5 y = 0.0191x + 0.0557 R² = 0.9962 1.974 1.5 1.563 1.174 0.869 0.5 0.492 0 20 40 60 80 100 120 HÀM LƯỢNG 4-NITRO-PHENOL (μg/μl) Thí nghiệm Xác định số liên kết fucoidan phương pháp phổ hồng ngoại IR xác định hàm lượng sulfate có fucoidan HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 96 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Đường chuẩn sulfate: ABS y = 0.0014x - 0.0587 R² = 0.9967 1.5 0.5 0 Lần TB kGy 7.299 7.887 7.418 7.535 200 400 kGy 10.347 10.323 10.410 10.360 600 800 1000 %sulfate Liều chiếu xạ 10 kGy 15 kGy 10.355 10.696 10.998 10.752 10.299 10.656 10.551 10.701 1200 20 kGy 11.125 11.140 11.172 11.146 Bảng PL-41 Hàm lượng sulfate có fucoidan chiếu xạ liều lượng khác HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 97 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Thí nghiệm xác định hoạt tính ức chế enzyme α-D-glucosidase fucoidan chiếu xạ kGy: *Số liệu xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV.I HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 98 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP B A D C Hình PL-6 Hình ức chế enzyme α-Glucosidase nồng độ 0.1mg/ml, 0.3mg/ml, 0.5mg/ml, 0.8mg/ml theo thứ tự hình A, B, C, D fucoidan chiếu xạ kGy HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 99 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Thí nghiệm xác định hoạt tính ức chế enzyme α-D-glucosidase fucoidan chiếu xạ kGy: *Số liệu xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV.I HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 100 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP A B C D Hình PL-7 Hình ức chế enzyme α-Glucosidase nồng độ 0.1mg/ml, 0.3mg/ml, 0.5mg/ml, 0.8mg/ml theo thứ tự hình A, B, C, D fucoidan chiếu xạ kGy HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 101 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Thí nghiệm xác định hoạt tính ức chế enzyme α-D-glucosidase fucoidan chiếu xạ 10 kGy: *Số liệu xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV.I HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 102 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP A B A C Hình PL-8 Hình ức chế enzyme α-Glucosidase nồng độ 0.1mg/ml, 0.3mg/ml, 0.5mg/ml, 0.8mg/ml theo thứ tự hình A, B, C, D fucoidan chiếu xạ 10 kGy HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 103 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Thí nghiệm xác định hoạt tính ức chế enzyme α-D-glucosidase fucoidan chiếu xạ 15 kGy *Số liệu xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV.I HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 104 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP B A C D Hình PL-9 Hình ức chế enzyme α-Glucosidase nồng độ 0.1mg/ml, 0.3mg/ml, 0.5mg/ml, 0.8mg/ml theo thứ tự hình A, B, C, D fucoidan chiếu xạ 15 kGy HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 105 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Thí nghiệm xác định hoạt tính ức chế enzyme α-D-glucosidase fucoidan chiếu xạ 20 kGg: *Số liệu xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV.I HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 106 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP A B C D Hình PL-10 Hình ức chế enzyme α-Glucosidase nồng độ 0.1mg/ml, 0.3mg/ml, 0.5mg/ml, 0.8mg/ml theo thứ tự hình A, B, C, D fucoidan chiếu xạ 15 kGy HỌC VIỆN: ĐỖ DUY KHÁNH 107 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP  Thiết bị sử dụng thí nghiệm Máy ly tâm Máy khuấy từ Bể ủ nhiệt Máy đo quang phổ Máy vortex Máy ly tâm Cân điện tử Hình PL-11 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 108