Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu việt nam

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU... HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- BÙI VĂ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

BÙI VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

BÙI VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng

dẫn của PGS.TS Bùi Minh Lý và PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo

thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu, kết quả trong luận

án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận án này

Tác giả luận án

Bùi Văn Nguyên

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS Bùi Minh Lý và PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến, những người thầy bằng cả tâm

huyết của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu và chia sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi làm luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS TS Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa

học các Hợp chất thiên nhiên, cùng ban lãnh đạo Viện, bộ phận đào tạo của Viện đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi hoàn thành luận án của mình

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị phụ trách của Học Viện Khoa học Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án của mình

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới UBND tỉnh Khánh Hòa, ban giám hiệu trường Đại học Khánh Hòa, Khoa KHTN và Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để

tôi hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo viện, các nhà khoa học, anh chị em và bạn

bè đang công tác tại Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi

làm thực nghiệm và luôn động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các nhà khoa học trong nhóm nghiên cứu

PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, PGS.TS Thành Thị Thu Thủy, GS.TSKH Anatolii I Usov và PGS.TS Yoshiaki Yuguchi đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn các đề tài hợp tác quốc tế với Liên Bang Nga mã

số VAST.HTQT.Nga.02.15-16 và VAST.HTQT.Nga.06.13-14, với Nhật Bản mã

số VAST.HTQT.NHATBAN.02.13-15 đã tài trợ kinh phí giúp hoàn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Như Hậu, Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang đã giúp đở tôi trong quá trình thu thập mẫu rong nâu và giám định tên khoa học

Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên tôi hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Bùi Văn Nguyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ xi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về rong nâu 4

1.1.1 Giới thiệu về rong biển 4

1.1.2 Giới thiệu về Rong Nâu 7

1.1.2.1 Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới 7

1.1.2.2 Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam 9

1.1.3 Thành phần hóa học của rong Nâu 14

1.1.3.1 Polysaccharide 14

1.1.3.2 Hợp chất phenolic 19

1.1.3.3 Hợp chất carotenoid 21

1.1.3.4 Hợp chất Terpenoid 22

1.1.3.5 Các hợp chát khác 25

1.2 Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan) 26

1.2.1 Giới thiệu chung về Fucoidan 26

1.2.2 Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu 26

1.2.3 Cấu trúc hóa học của fucoidan 28

1.2.4 Tính chất hóa lý của fucoidan 29

1.2.5 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan 30

1.2.5.1 Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối 30

1.2.5.2 Hoạt tính chống virus 32

1.2.5.3 Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch 33

1.2.5.4 Hoạt tính chống oxy hóa 35

1.2.5.5 Giảm lipid máu 36

1.2.5.6 Kháng viêm 36

1.2.5.7 Chống lại các bệnh về gan 37

1.2.5.8 Hoạt tính kháng khuẩn 37

1.2.5.9 Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu 37

1.2.5.10 Các ứng dụng của fucoidan 38

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án 39

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 39

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 44

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.1 Đối tượng nghiên cứu 49

2.2 Phương pháp nghiên cứu 50

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan 51

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết fucoidan 51

2.2.1.2 Phương pháp phân đoạn fucoidan 51

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan 51

2.2.2.1 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa 51

2.2.2.2 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 53

2.2.2.3 Phương pháp phổ IR 53

2.2.2.4 Phương pháp phổ NMR 54

2.2.2.5 Phương pháp phổ MS 59

2.2.2.6 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 64

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 66

2.2.3.1 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro 66

2.2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế bào ung thư trên thạch mềm 68

2.2.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu 68

Chương 3 THỰC NGHIỆM 70

3.1 Thu thập và xử lý rong 70

3.2 Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu 71

3.3 Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan 77

3.3.1 Xác định hàm lượng tổng carbohydrate 77

3.3.2 Xác định thành phần monosaccharide 77

3.3.3 Xác định hàm lượng sulfate 78

3.3.4 Phương pháp khử sulfate 78

3.3.5 Xác định hàm lượng axít uronic 78

3.3.6 Phân tích liên kết bằng methyl hóa 79

3.3.7 Thủy phân tạo oligosaccharide 79

3.3.8 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 79

3.3.9 Phổ IR 80

3.3.10 Phổ NMR 80

3.3.11 Phổ ESI-MS/MS 80

3.3.12 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 80

3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học 81

3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào 81

3.4.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm 82

3.4.3 Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu 83

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 85

4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan 85

4.2 Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các fucoidan thu được 86

4.3 Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S binderi và S duplicatum 90

4.3.1 Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi 90

4.3.2 Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum 92

4.4 Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium 96

4.4.1 Chiết xuất và làm sạch fucoidan 96

4.4.2 Xác định cấu trúc của fucoidan 100

4.4.2.1 Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation) 100

4.4.2.2 Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA 101

4.4.2.3 Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis) 104

4.4.2.4 Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion 106

4.4.2.5 Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3 107

4.4.2.6 Các đặc điểm cấu trúc của deS-4 111

4.4.2.7 Các đặc điểm cấu trúc của deS-6 115

4.4.2.8 Các đặc điểm cấu trúc của deS-5 117

4.4.2.9 Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS 117

4.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 124

4.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 124

4.4.3.2 Hoạt tính chống khối u in vitro 124

4.4.3.3 Hoạt tính chống đông tụ máu 126

4.5 Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens 131

4.5.1 Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 131

4.5.2 Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens 135

4.5.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M 142

4.6 Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào 144

4.6.1 Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ 144

4.6.2 Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt tính gây đốc tế bào 151

KẾT LUẬN 156

KIẾN NGHỊ 159

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 160

TÀI LIỆU THAM KHẢO 162

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

GC - FID Gas Chromatography – Flame

Ionization Detector

Sắc ký khí – Đầu dò ion hóa ngọn lửa

13C-NMR Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN carbon 13

COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều 1

ESI-MS Electron Spray Ionization - Mass

Spectroscopy

Phổ NOESY

kính quay SAXS Small-angle X-ray Scattering Tán xạ tia X góc nhỏ TOCSY Total correlation spectroscopy Phổ tương tác toàn phần

Hoạt tính sinh học

Monosaccharide

Hóa chất

APTT Activated Partial Thromboplastin Time Xét nghiệm APTT đánh

giá chức năng đông máu

CS Cell Survival, Cell Viability Tế bào sống sót

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người

dịch ở người

IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tăng

trưởng của đối tượng thử

Cetavlon Hexadecyltrimethylammonium

bromide, Cetrimonium bromide

Hexadecyl trimethyl ammonium bromid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần loài và phân bố rong nâu Khánh Hòa 12

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số fucoidan 27

Bảng 1.3 Sự phân bố trọng lượng phân tử của fucoidan 30

Bảng 1.4 Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu 39

Bảng 2.1 Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại 54

Bảng 2.2 Độ dịch chuyển hóa học của C và H trong một số gốc đường 56

Bảng 2.3: Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate 61

ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm 61

Bảng 2.4 Fucoidan phân đoạn SmF3 của rong S mcclurei 62

Bảng 2.5 Thông số  đối với một số dạng cấu trúc polymer 65

Bảng 4.1 Thành phần polysaccharid tan trong nước từ một số loài rong nâu (% trên trọng lượng rong khô) 87

Bảng 4.2 Thành phần hóa học của các fucoidan phân lập được từ 06 loài rong nâu thu ở Nha Trang 88

Bảng 4.3 Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ Sargassum binderi 91 Bảng 4.4 Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ S duplicatum 93

Bảng 4.5 Hiệu suất và thành phần (%) của FSA và các phân đoạn fucoidan thu được sau sắc ký trao đổi anion 98

Bảng 4.6 Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-deS so sánh với fucoidan mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M) 101

Bảng 4.7 Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa 104

Bảng 4.8 Hiệu suất và thành phần (%) của các phân đoạn tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ của chúng 107

Bảng 4.9 Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-2 ( = ppm, ký hiệu của các gốc đường xem Hình 4.16) 109

Bảng 4.10 Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-4 114

Bảng 4.11 Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-6 116

Bảng 4.12 Kết quả phân tích methyl hóa FSA-1,5M và 1,5M-deS 118

Bảng 4.13 Tỉ lệ sống sót của các tế bào ung thư khi có mặt các phân đoạn fucoidan

từ FSA 124Bảng 4.14 Tác dụng của chất thử tới kích thước trung bình và mật độ của các quần thể tế bào 125Bảng 4.15: Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong

Turbinaria decurrens 135

Bảng 4.16 Kết quả thử nghiệm tác dụng chống khối u của FTD-2,0N trên tế bào ung thư gan Hep-G2 142Bảng 4.17 Hiệu suất, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu

fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam 146Bảng 4.18 Bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc ước lượng từ đồ thị Guinier của các mẫu fucoidan đo trong NaCl 0,5M 149Bảng 4.19 Hoạt tính độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD 152Bảng 4.20 Liên hệ giữa hoạt tính với KLPT trung bình của các mẫu fucoidan 153Bảng 4.21 Liên hệ giữa hoạt tính với hàm lượng sulfat và tỉ lệ sulfat/đường của các mẫu fucoidan 153Bảng 4.22 Liên hệ giữa hoạt tính với bán kính hồi chuyển Rgc của các mẫu

fucoidan 154

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh

Hòa 11

Hình.1.2 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan đặc trưng tách và phân lập từ rong nâu 46

Hình 2.1 Hình dạng rong Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens 50

Hình 2.2 Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysaccharide 52 Hình 2.3 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ion hóa ESI-MS 59

Hình 2.4 Cơ chế phân mảnh của carbohydrate 60

Hình 2.5 Cơ chế phân mảnh của carbohydrate 61

Hình 2.6 Cơ chế phân mảnh oligosacaride với sự có mặt của ion kim loại 62

Hình 2.7 Phổ MS và cơ chế phân mảnh của fucoidan 62

Hình 3.1 Vị trí địa lý nơi thu thập mẫu rong nâu và ảnh rong Sargassum aquifolium 70

Hình 3.2 Rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens 71

Hình 3.3 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium 73

Hình 3.4 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens 74

Hình 3.5 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto) 75

Hình 3.6 Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) 76

Hình 4.1 Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium 86

Hình 4.2 Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 86

Hình 4.3 Tách các phân đoạn của fucoidan từ S.binderi trên cột DEAE-Cellulose 90 Hình 4.4 Phổ 13C-NMR của fucoidan phân đoạn F2 từ rong Sargassum binderi 92

Hình 4.5 Phân đoạn của fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum 93

Hình 4.6 Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum 94

Hình 4.7 Phổ 1H-NMR của fucoidan FSDu chiết từ rong nâu S duplicatum 94

Hình 4.8 Sơ đồ chiết xuất, phân lập và chuyển hóa các fucoidan của S aquifolium 97

Hình 4.9 Sắc ký đồ GPC của fucoidan FSA từ rong nâu Sargassum aquifolium 99

Hình 4.10 Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium 99

Hình 4.11 Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-2,0M 102

Hình 4.12 Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,5M 103

Hình 4.13 Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,0M 103

Hình 4.14 Sắc ký đồ của 1.0M-deS trên cột trao đổi anion DEAE-Sephacel 106

Hình 4.15 Một phần của phổ HSQC của deS-2 108

Hình 4.16 Các mảnh cấu trúc của fucoidan desulfat hóa deS-2 (các gốc đường đều ở dạng pyranose) 108

Hình 4.17 Một phần của phổ HMBC của deS-2 110

Hình 4.18 Phổ HSQC của deS-4 112

Hình 4.19 Một phần của phổ HMBC của deS-4 112

Hình 4.20 Mảnh cấu trúc của deS-4 114

Hình 4.21 Phổ HSQC của deS-6 115

Hình 4.22 Một phần của phổ HMBC của deS-6 115

Hình 4.23 Mảnh cấu trúc của deS-6 116

Hình 4.24 Phổ ESI-MS của FSA-1,5M trong vùng m/z 320 đến m/z 610 120

Hình 4.25 Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]- với m/z 243 121

Hình 4.26 Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- với m/z 389 122

Hình 4.27 Phổ ESIMS/MS thức âm của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) 123

Hình 4.28 Hình ảnh dưới kính hiển vi ngược của các quần thể tế bào Hep-G2 nuôi cấy trên thạch mềm dưới tác dụng của cácchất thử 126

Hình 4.29 Hoạt tính chống đông máu của các fucoidan từ S aliqualium đo được bằng phương pháp APTT 127

Hình 4.30 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 132

Hình 4.31 Sắc ký đồ của GPC của fucoidan FTD từ rong nâu Turbinaria decurrens 133

Hình 4.32 Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 134

Hình 4.33 Phổ IR của FTD-2,0N 135

Hình 4.34 Các đoạn trích từ phổ 1H-NMR của FTD-2,0N 136

Hình 4.35 Các đoạn trích từ phổ 13C-NMR của FTD-2,0N 137

Hình 4.36 Một đoạn trích từ phổ HSQC của FTD-2,0N 138

Hình 4.37 Một đoạn trích từ phổ HMBC của FTD-2,0N 138

Hình 4.38 Phổ ESI-MS/MS của ion [FucSO3]- (m/z 243) 139

Hình 4.39 : Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) 140

Hình 4.40 Sơ đồ phân mảnh của Fucoidan FTD-2,0N 141

Hình 4.41 Hình ảnh hiển vi của các khối u dưới tác dụng của chất thử 142

Hình 4.42 Vùng tán xạ góc nhỏ so sánh với vùng góc lớn thường được dùng trong các phương pháp phân tích nhiễu xạ (diffraction analysis) 144

Hình 4.43 Sơ đồ nguyên lý của một máy đo tán xạ tia X góc nhỏ 145

Hình 4.44 Đồ thị Kratky cho các kết quả đo SAXS của 6 mẫu fucoidan trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M 147

Hình 4.45 Đồ thị Kratky cho tất cả các kết quả đo tán xạ tia X góc nhỏ của 6 mẫu fucoidan trong nước 148

Hình 4.46 Đồ thị Guinier của mặt cắt ngang cho các kết quả đo tán xạ tia X góc nhỏ của 6 mẫu fucoidan trong dung dịch NaCl 0,5M trong nước 149

Hình 4.47: Cấu trúc dựa trên các dữ kiện hóa học và phổ được đề xuất cho Fto bởi Thành Thị Thu Thủy và Yuguchi 150

Hình 4.48 Mô hình cấu trúc cho các mạch nhánh của Fto [92] 150

Hình 4.49 Đồ thị Kratky của Fto so sánh với các đồ thị lý thuyết ước lượng được từ 4 mô hình cấu trúc trên Hình 4.48 151

MỞ ĐẦU

Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260

km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong biển đa dạng và phong phú Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục

(Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes) Rong biển có vai

trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển, càng ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong

biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là nhóm rong có kích

thước cá thể rất lớn và dài cùng với sinh lượng lớn Do vậy, rong nâu được coi là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm Trong các

ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng làm nguồn nguyên

liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,… với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1,2,3,4,5,6]

Trong số các polysaccharide từ rong nâu, fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng khuẩn, chống virus kể cả HIV, chống ung thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, các đặc tính chống

bổ thể, chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật,… [6] Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với nhau và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate cũng như các nhánh khác được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường là

bao gồm chủ yếu fucose và sulfate cùng một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose , đôi khi còn có uronic acid [6,7]

Nhờ vào sự đa dạng cấu trúc hóa học và sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú

vị, sulfated polysaccharide (fucoidan) đã được nghiên cứu mạnh và sâu Việc giải thích làm sáng rõ chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là hết sức phức tạp, fucoidan được tách ra từ rong nâu thường là hỗn hợp của nhiều cấu trúc sulfated polysaccharide khác nhau Fucoidan thông thường là có cấu trúc phân nhánh và chứa nhiều monosaccharide khác nhau cũng như có nhóm sulfate và axtate [7,8]

Fucoidan từ rong nâu thuộc chi Sargassum, Hormophysa và Turbinaria có cấu trúc

hóa học phức tạp [9,10] nhưng lại rất hấp dẫn về hoạt tính cũng như ứng dụng của chúng và sẵn có trong tự nhiên Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan [10,11,12] như liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh, vị trí các gốc sulfate, các phân tử đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học được tiến hành trên các sản phẩm fucoidan thô Vì vậy, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng

tỏ [12,13,14] Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu thì việc xác định chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là điều quyết định đầu tiên và đang thu hút

sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới Chính vì vậy tôi chọn tên đề tài luận

án là “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một

số loài rong nâu Việt Nam”

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là:

Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển của Việt Nam

và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu trên của luận án, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan

Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết xuất từ một số loài rong nâu chọn lọc

Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một

số fucoidan chọn lọc

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong nâu

1.1.1 Giới thiệu về rong biển

Rong biển hay còn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh

và tạo ra sinh khối lớn [1,4] Tổng số loài rong biển trên thế giới được báo cáo chủ

yếu thuộc 3 ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ

sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới

Tổng số loài rong biển ở Việt Nam ước tính khoảng 1.000 loài, trong đó có

khoảng 639 loài: 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [1] Trong tất cả các loài này, 310 loài

phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 hiện diện ở các tỉnh phía Nam,

156 loài phân bố ở cả hai vùng [15]

Đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm Các nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển

đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật

đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trước Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu Rong biển cũng được

sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan ), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định),

thức ăn gia súc, nông nghiệp Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến

Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được

sử dụng rộng rãi trên thế giới Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật [16]

Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao Hàm lượng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trưởng và phát triển của rong Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã được nghiên cứu, thành phần trong rong gồm có : nước chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lượng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino acid thiết yếu, hàm lượng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu (fucoxanhthin), các sắc tố xanthophyll khác là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lượng (

K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…) Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng được chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide Nhóm monosaccharide gồm các đường đơn như : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913 Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc Hàm lượng mannitol trong rong biển thường cao vào các tháng mùa hè và có

xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong Quy trình chiết tách mannitol ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên nguyên tắc : làm lạnh dung dịch mannitol sau khi đã được chiết bằng cồn nóng để thu được các tinh thể mannitol Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên

liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có

độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [1,2,3,4,5,6] Nhóm polysaccharides gồm có : fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan Fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các tính chất sinh học

đa dạng và đặc thù của nó như khả năng tăng cường miễn dịch, chống đông tụ máu, chống viêm nhiễm, kháng virus, điều trị rối loạn đường huyết và hỗ trợ trong điều trị ung thư Laminaran đóng vai trò như chất dự trữ trong rong nâu Laminaran là chất tạo hệ miễn dịch ở động vật có vú, laminaran sulfate hóa đã được chứng minh

là có đặc tính giống heparin Laminaran bị hòa tan, nhưng mức độ hòa tan phụ thuộc vào mức độ phân nhánh, độ phân nhánh càng cao thì mức độ hòa tan càng cao, do đó nếu độ phân nhánh nhỏ thì chỉ có thể hòa tan trong nước ấm ( 60 –

800C) Laminaran có hoạt tính chống đông tụ máu và chống ung thư Agar và alginate được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm : được sử dụng làm chất ổn định trong bánh kẹo, kem, nước ngọt hay làm chất làm đông đặc và tạo gel trong sản xuất thịt đông lạnh; trong công nghệ sinh học được dùng làm môi trường nuôi cấy, trong y học dùng làm vải băng bó vết thương truyền thống, lấy dấu răng, pha thuốc, pha huyết thanh, trong một số công thức chống chảy máu dạ dày, trong việc cấy ghép tế bào, tác động vào các tế bào sản xuất insulin để điều trị bệnh tiểu đường loại 1 Vỏ nang bằng alginate không bị dịch tiêu hóa phân hủy và chỉ tan trong ruột Màng được tạo thành từ alginate và gelatin kết hợp với một số chất như tinh dầu tràm, rau má, nghệ, dầu mù u có tác dụng trong điều trị vết thương như vết bỏng, làm giảm sự nhiễm khuẩn, làm nhanh lành vết thương; trong công nghiệp giấy : alginate được trộn lẫn với bột giấy rồi xử lý sẽ cho bề mặt giấy nhẵn, mịn không xù xì; trong công nghiệp dệt và tơ nhân tạo : alginate cho nhũ tương mịn và bền nên được dùng trong kỹ nghệ sơn, xà phòng, cao su, phim ảnh, vải lợp nhuộm vecni và sơn để tăng độ bền của màu Màu vẽ có alginate dễ tan đều trong nước Carrageenan là một ionic polysaccharide, mạch thẳng được sulfate hóa, chúng mang đầy đủ tính chất đặc trưng của polysaccharide Carrageenan là polysaccharide có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch, chúng tồn tại trong một số loài rong đỏ thuộc họ Rhodophyceae Hiện nay, carrageenan thường được chiết từ một số loài

rong như Gigartina, Chondrus, Iridea, Eucheuma Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc cũng như khả năng tạo gel khác nhau Tính chất và khả năng tạo gel của carrageenan phụ thuộc vào độ lặp lại của các mắt xích, vị trí và số lượng nhóm sulfate và đặc biệt là sự có mặt của vòng 3,6 anhyđro D – galactose Cầu 3,6 anhyđro D – galactose cho phép tạo nên cấu trúc xoắn, là điều kiện chủ yếu để tạo gel của carrageenan Rong biển còn được

sử dụng để làm thức ăn cho nuôi tôm, thức ăn gia súc, được dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn điện, lọc và hấp thụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh Rong biển cũng là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp nước giải khát, đồ hộp, socola, mỹ phẩm cao cấp Rong biển cũng được sử dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác Polyphenol trong rong nâu cũng được dùng làm trà chống lão hóa Năm

2007, tại Mỹ đã có quy trình sản xuất biodiesel từ rong biển Thực tế còn cho thấy rong biển có tiềm năng sử dụng trong xử lý nước thải Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng như : Zn và Cd từ nước bị ô nhiễm Do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lượng có trong rong khá cao nên rong được dùng làm thức

ăn bổ sung để phòng bệnh thiếu một số chất như sắt, iod, [1,2,3,4,5,6,17,18,19,20] 1.1.2 Giới thiệu về Rong Nâu

Rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4 chi

Sargassum, chi Turbinaria, chi Dictyota, chi Padina, sản lượng tự nhiên cao nhất so

với các nhóm rong biển khác Đặc biệt chi rong Sargassum, chúng hình thành các

thảm rong biển rộng từ vài hecta cho đến cả vài chục hecta, các chi còn lại mật độ vừa phải, chúng mọc trên các bãi triều và rạn ngầm có nền đáy đá hoặc san hô Chúng phân bố rộng, chiếm ưu thế trong các bãi triều ven biển ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới Rong nâu nơi sâu phát triển muộn hơn nơi cạn; sinh lượng cao vào tháng 3 và kéo dài đến tháng 6 Sự phát triển ở những vùng có nền đáy cứng, nước trong, sóng mạnh, những bãi triều có độ đốc 5-25% ở đó rong phát triển tốt nhất [1,2,3,4,5,6]

1.1.2.1 Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới

Việc phân loại tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học người ta chia rong thành một số

ngành riêng biệt Con số các ngành rong hiện nay vẫn chưa thống nhất tùy theo các tác giả khác nhau

Một trong những tác giả có các công trình nghiên cứu quan trọng về bộ rong nâu này là J Agardh Năm 1820, ông đã lập ra một hệ thống phân loại về chi rong

Mơ và đã mô tả 62 loài Ông chia chi này thành 7 nhóm và sắp xếp vào một bộ Fucoideae Năm 1824, ông bổ sung thêm số lượng lên 67 loài Sau đó một số tác giả khác như Greville, Gaudichaud, Montagne… có mô tả thêm loài nhưng vẫn sắp xếp vào hệ thống J Agardh Năm 1889, ông đã bổ sung thêm vào hệ thống phân loại với nhiều chi, nhóm… trong đó có 180 loài Hệ thống phân loại của J Agardh đưa ra năm 1889 đã được nhiều tác giả đồng tình và sử dụng Quan trọng nhất là Grunow (1915-1916), đã triển khai và sử dụng hệ thống phân loại của J Agardh, mô tả 230 loài với nhiều thứ và dạng trên cơ sở thu mẫu ở nhiều nước trên thế giới Một số tác giả khác đã góp phần vào việc nghiên cứu họ này như ở Nhật Bản đã mô tả 41 loài,

45 loài ở vùng biển Ấn Độ

Đến năm 1931-1936, Setchell nghiên cứu rong biển ở Hồng Kông, Trung Quốc đã đặc biệt chú ý đến họ Sargassaceae, ông đã mô tả thêm 32 loài Từ đó đến nay, nhiều tác giả ở Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Philippin, Úc, Ấn Độ, Mỹ…

đã có nhiều nghiên cứu bổ sung, đã có nhiều hội nghị quốc tế về rong biển kinh tế, trong đó các loài rong nâu mới cũng được bổ sung, nâng tổng số loài được biết hiện nay trên thế giới khoảng 1500 loài Các loài được mô tả và cập nhật bổ sung một cách đầy đủ trên trang web www.algaebase.org

Như vậy đến thời điểm này rong nâu được phân chia thành 9 bộ, 265 chi và hơn 1500 loài trong đó số lượng thành phần loài một số chi rong nâu trên thế giới như:

Chi Sargassum C.Agardh, 1820 thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng

873 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhưng trong đó 562 loài được

chấp nhận sự phân loại Chi Turbinaria J.V.Lamouroux, 1825 thuộc họ

Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng 53 tên loài trong cơ sở dữ liệu

Chi Dictyota J.V.Lamouroux, 1809 thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales có

khoảng 316 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhưng trong đó 76 loài được chấp nhận sự phân loại

Chi Padina Adanson, 1763 thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales Hiện nay

số lượng loài chi Padina có khoảng 62 tên loài trong cơ sở dữ liệu

Isao et al, 2005)

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada,

Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ai-len, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chi lê, Argentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ

Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận

nhiệt đới

Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng

27.000 tấn

1.1.2.2 Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam

Riêng việc kiểm tra danh mục cập nhật ngành rong biển Việt Nam đang tiến hành bởi các nhà phân loại, con số thành phần loài hiện có thể dự báo khoảng 800 loài So với các nước trong khu vực thành phần loài rong biển Việt Nam đa dạng phong phú giữa tự nhiên và nuôi trồng, có nhiều tiềm năng, góp phần về sản lượng khai thác nguồn lợi rong biển khu vực Đông Nam Á

Đối với rong nâu Việt Nam, các tác giả trong nước và ngoài nước đã nghiên cứu tương đối đầy đủ về mặt phân loại Việc phân loại được thực hiện theo phương pháp hình thái so sánh, trong đó các tiêu chí phân loại là đặc điểm của cơ quan sinh sản, là cơ quan ít biến đổi theo các điều kiện sinh thái, là phương pháp sử dụng từ lâu nhưng vẫn còn phổ biến và vẫn đảm bảo được mức độ tin cậy trong điều kiện Việt Nam và trên thế giới Đến thời điểm này một số chi rong nâu thống kê được:

Chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài (4 loài 1 thứ), chi

Sargassum 68 loài trong đó ở Khánh Hòa có 39 loài [1,2,3,4,21]

Năm 2013, theo công bố của Nguyen Van Tu, Le Nhu Hau và đồng sự đã có

tổng số 827 loài được công bố, trong đó chi rong nâu Chlorophyta (180 loài) So

với các nước Philippin, Đài Loan, Thái Lan hay Malaysia, rong biển Việt Nam rất

+ Khu vực 2: ven biển xã Ninh Thuỷ, xã Ninh Phước, xã Ninh Vân, Đầm Nha Phu (Bãi Đá lát, Mỹ Giang, Hòn khô, Bãi Đá nọc, Bãi Cây Tra, Bãi Cỏ, Bãi Cây Bàn, Bãi Vũng Tàu, Hòn Thị, Đảo Khỉ và vài bãi cạn ngầm Bãi cỏ - Thị xã Ninh Hòa)

+ Khu vực 3: Vịnh Nha Trang (Mũi Kê Gà, Bãi tiên Đường Đệ, Hòn Chồng, khu vực Hòn Đỏ, Hòn Rùa, Đảo Hòn Tre - Mũi Nam Bãi Trủ, Bãi Rạn, Bãi Ngéo, Hòn Một, Hòn Mun, Bãi rạn ngầm Lớn, Mũi Cá sấu Trí Nguyên, Sông Lô, Mũi Cầu Hinh)

+ Khu vực 4: Đảo Bình Ba, xã Cam Lập ( dọc theo bờ Đông bán đảo Cam Lập, từ mũi Sốp đến mũi Cà Tiên) – Thành phố Cam Ranh

Từ những chuyến khảo sát thực địa ven biển Khánh Hòa, đã xác định số lượng thành phần loài riêng một số chi rong nâu có tần suất xuất hiện tại 4 khu vực: chi

Dictyota 9 loài, chi Padina 3 loài, chi Turbinaria 4 loài, chi Sargassum 21 loài

(Bảng 1.1)

Hình 1.1 Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh

Hòa [21]

Bảng 1.1 Thành phần loài và phân bố rong nâu Khánh Hòa [21]

T

Vùng 1 - Vịnh Vân Phong Vạn Ninh

Vùng 2- Ninh Thuỷ, Ninh Phước

Vùng 3- Vịnh Nha Trang

Vùng 4- Vịnh Cam Ranh

rong nâu [22,23,24] Ascophyllan (6) đã được tách chiết từ rong nâu Ascophyllum

nodosum ức chế sự phát triển và tiêu diệt tế bào ung thư [24]

Alginate (1) là anionic polysaccharide, là co-polymer mạch thẳng được tạo

thành từ liên kết (14) glycosid của axít β-D-mannuronic (M) và axít

α-L-guluronic acid (G) Sodium alginate (8) tách từ rong nâu Sargassum fulvellum có

khả năng ức chế sự phát triển của khối u

Theo công thức cổ điển của Haworth, hai monomer này chỉ khác nhau ở nhóm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranose, còn theo quan niệm hiện đại, hai gốc uronic này có cấu tạo dạng ghế, có cấu hình khác nhau: axít

mannuronic có cấu hình 4C1 còn axít guluronic là 1C4 Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [19]

Các chuỗi axít polyguluronic có dạng nếp gấp, còn axít polymannuronic có dạng phẳng Khoảng cách giữa 2 uronic acid trong chuỗi axít polyguluronic là 8,7 Å; axít polymannuronic là 10,35 Å và khoảng cách giữa hai uronic acid trong chuỗi luân phiên axít polyguluronic và polymannuronic là 9,5 Å [19]

Trong phân tử alginate, tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer

M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block: Block homopolymeric guluronic (Poly-G) gồm các gốc axít guluronic nối tiếp nhau (GGGG); Block homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc axít mannuronic nối tiếp nhau (MMMM) ; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai gốc axít guluronic và axít mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (MGMGMGMG)[19]

Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng trong mạch phân tử thay đổi tùy theo nguồn gốc của alginate Do cấu trúc của các gốc G và M khác nhau nên hình dạng của các khối cũng khác nhau: Poly – M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên

sự mềm mại của mạch phân tử, trong khi poly - G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền chặt hơn Cấu trúc hóa học của alginate có tính chất quyết định đến các tính chất vật

lý, hóa học và sinh học của nó [19]

Alginate có ảnh hưởng khác nhau đến hệ sinh học, phụ thuộc rất lớn vào thành phần hóa học và khối lượng phân tử của alginate Hoạt tính sinh học của alginate cho thấy sự tăng trưởng quá nhanh các thực bào và nguyên bào sợi, tương

tự như một phản ứng viêm với dị vật Các thí nghiệm cho thấy mức độ cảm ứng các yếu tố gây ra hoại tử khối u và interleukin 1 phụ thuộc hàm lượng acid mannuronic trong mẫu alginate Kết quả này giải thích các phân đoạn giàu mannuronat không tham gia vào việc tạo gel sẽ thoát ra ngoài các viên nang và khởi động một phần phản ứng miễn dịch này có thể có liên quan một phần với các liên kết (1 → 4) glycoside, vì các polyuronat hormopolymer diequartorial khác như axít D–glucuronic cũng thể hiện tính chất này Khả năng miễn dịch của các polymannuronat đến nay đã được chứng minh trong các thử nghiệm lâm sàng để ngăn ngừa các bệnh nhiễm khuẩn, để làm tăng khả năng miễn dịch không đặc hiệu

Ngoài ra, alginate có tính tẩy xạ, khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng con đường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đưa chất phóng xạ này ra khỏi cơ thể Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó ngăn ngừa được sự hấp thu strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được thải theo phân ra ngoài Việc dùng alginate làm chất tẩy xạ không ảnh hưởng đến quá trình trao đổi ion Ca2+ và khả năng phát triển bình thường của cơ thể Ngoài ra một số nghiên cứu cũng cho thấy alginate còn có khả năng chống oxy hóa, tác dụng chống đông tụ máu, phòng

xơ vữa động mạch ở trẻ em [19]

Alginate còn có rất nhiều ứng dụng khác trong cuộc sống Các ứng dụng của alginate đều dựa trên ba đặc điểm đó là khả năng tạo dung dịch có độ nhớt cao; khả năng tạo gel khi thêm muối canxi vào dung dịch natri alginate trong nước; khả năng tạo màng natri hay calci alginate và sợi calci alginate Ngày nay các alginate đang được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, các ngành công nghiệp dệt may và các lĩnh vực bao gồm cả giấy mạ, dược phẩm và hàn…Ví dụ kỹ nghệ thức ăn, người ta dùng rất nhiều alginate để làm kem, socola, bánh, món tráng miệng Trong công nghiệp, alginate được sử dụng rất nhiều trong kỹ nghệ giấy, dệt, vải hồ, kỹ nghệ cao su Nhu cầu alginate dùng trong in vải sợi chiếm khoảng 50% tổng lượng alginate sản xuất trên toàn thế giới Trong công nghệ dược phẩm, alginate thường dùng làm chất nhũ hóa và chất gây thấm trong các dạng thuốc có cấu trúc nhũ tương và hỗn dịch, dùng trong tá dược bao của viên nén hay tham gia vào thành phần của vỏ nang Alginate có thể được sử dụng để kết hợp để làm màng bao của viên tan trong ruột, điều này rất có lợi cho việc bào chế các thuốc ảnh hưởng đến đường tiêu hóa, tương

kỵ với dịch vị…Alginate dùng để sản xuất lớp màng chống chất phóng xạ, nó thường dùng để chỉ thị độ ô nhiễm phóng xạ của vùng biển Màng được tạo thành từ gelatin và alginate được ứng dụng trong điều trị tổn thương bỏng Màng này có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm, giảm viêm đẩy mạnh quá trình lành hóa vết thương, đặc biệt có hiệu quả ở dạng bỏng khô [19]

Laminaran (2) là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thường

gọi là laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là : 1,3 – β – D – glucan Laminaran là một polysaccharide dự trữ của rong nâu, hàm lượng từ 1 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh

sống của từng loại rong Thường vào mùa hè hàm lượng laminaran giảm vì phải tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong Laminaran được hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết β-(1→3) và một ít liên kết β-(1→6), gốc đường cuối mạch của một số phân tử có thể có các gốc mannitol hay vẫn là glucose Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của các liên kết β-(1→3) và liên kết β-(1→6) cũng như cách thức nối của các liên kết này trong chuỗi glucan [19,22]

Hoạt tính sinh học của Laminaran là thực phẩm chức năng có giá trị dược lý

được FDA chấp thuận trong việc chống đông máu, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu và kích thích miễn dịch bẩm sinh Hợp chất laminaran có trong rong biển

có thể hỗ trợ không để tế bào miễn dịch “tử vong”, từ đó có tác dụng bảo vệ hệ thống miễn dịch không bị tổn thương dưới tác động của tia bức xạ Khả năng chống tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên nhiên này đem lại niềm hy vọng cho những người đang dùng tia phóng xạ chữa trị các khối u gây ung thư trong cơ thể Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng sức đề kháng với nhiễm trùng và thúc đẩy

sự lành của vết thương Laminaran với những đặc tính của một alpha – amylase gây

ra kích hoạt các enzyme có mặt trong quá trình tăng trưởng ở thực vật và sự kích thích của hoạt động phân giải protein của các tế bào được xử lý Hiện nay, laminaran được nghiên cứu để sử dụng như là một chất thúc đẩy hạt giống nảy mầm

và tăng tốc độ tăng trưởng cây trồng [19]

Fucoidan (3) là một anion polysaccharide sulfate hóa nằm trong thành tế bào

của rong nâu, hợp chất này được Kylin mô tả đầu tiên vào năm 1913 từ loài rong

nâu Laminaria digitata Thành phần cấu tạo rất phức tạp, trong đó fucose chiếm

từ 18,6% đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7% đến 32,9%, ngoài ra còn có mặt

các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose,

rhamnose , và acid uronic [23]

1.1.3.2 Hợp chất phenolic

Hợp chất phenolic là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của thành phần hóa học rong nâu, là hợp chất chứa các nhóm OH gắn trực tiếp vào nhân bezen, bao gồm các hợp chất flavonoid, lignnin, tannin và phlorotannin Các hợp chất này có

nhiều hoạt tính khác nhau Phlorotannin (7) có trọng lượng phân tử từ

400-400.000Da, chiếm 0.5 đến 20% trong rong nâu Hàm lượng phenolic được phân tích định lượng và nghiên cứu so sánh từ nhiều loài thuộc ngành rong nâu (Fucaceae), được báo cáo ở các họ như Sargassaceae, Cystoseiraceae và Laminariaceae Các

hợp chất Phlorotannin như dieckol (9), eckol (10), 8,8’- bieckol (11), 6,6’- bieckol

(12) và 6,8’- bieckol (13) đã được tách chiết từ một số loài rong nâu Sargassum

fulvellum, Sargassum thunbergii, Ecklonia cava, Hijikia fusiformis, Ishige

okamurae, Eisenia arborea Phloroglucinol (14) tách từ Ecklonia cava Một hợp

chất Phlorotannin là dioxinodehydroeckol (15) Sáu hợp chất bromophenol và dẫn

xuất của nó (16-21) tách tử rong nâu Leathesia nana [24]

7

9

8

bao gồm lutein, zeaxanthin (22) và fucoxanthin (23) Rong nâu được coi là giàu có

hợp chất chuyển hóa thứ cấp đặc biệt như carotenoid có nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thư, chống viêm và chống virus Các hợp

chất a-carotene (24), b-carotene (25), chlorophyll a và phaeophytin a (26) đều có

những hoạt tính sinh học quý giá [24]

22

25

26

1.1.3.4 Hợp chất Terpenoid

Một số terpenoid được tách từ rong nâu Sargassum fallax, sargaquinone (27),

axít sargaquinoic (28), axít sargahydroquinoic (29), axít fallachromonoic (30), fallahydroquinone (31), fallaquinone (32), sargachromenol (33) Các hợp chất này

có họat tính chống oxi hóa và ngăn ngừa ung thư Các hợp chất atomarianone A

(34), và atomarianone B (35) đã được tách từ Taonia atomania có hoạt tính gây độc

tế bào ung thư [24]

Hợp chất diterpenoid tách từ rong nâu Cystoseira mediterranea như taondiol

(36), isoepitaondiol (37), stypodiol (38), stypoldione (39) và sargaol (40), các hợp

chất này có hoạt tính chống oxi hóa và chống ung thư Hợp chất 2β,3α-epitaondiol

(41), flabellinol (42) đã được tách từ rong nâu Styporodium flabelliforme hoạt tính

gây độc tế bào ung thư [24]

27

1.1.3.5 Các hợp chát khác

Cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein đã được nghiên cứu tách chiết từ rong nâu Các aminoaxit đã được nghiên cứu nhiều Deoxylapachol a 1,4 -

Naphthoquinone (43) và dẫn xuất đã được tách từ rong nâu Landsburgia

quercifolia Sargachromanol E (44) tách từ rong Sargassum siliquastrum các hợp

chất này có khả năng gây độc tế bào ung thư Hợp chất ergosterol (45) tách từ rong

nâu Lyengaria stellata Fucosterol (46) tách từ rong nâu Pelvetia siliquosa,

Cystoseira foeniculacea và Sargassum angustifolium các hợp chất axít α-linolenic

(47), axít γ-linolenic (48) và axít docosahexaenoic (49) ngăn chặn sự phát triển của

tế bào ung thư [24]