ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh là tình trạng vợ chồng sau một năm chung sống, quan hệ tình dục bình thường, không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào vào giai đoạn có thể mang thai trong chu kì kinh nguyệt mà[.]
ĐẶT VẤN ĐỀ Vơ sinh là tình trạng vợ chồng sau năm chung sống, quan hệ tình dục bình thường, không sử dụng biện pháp tránh thai vào giai đoạn mang thai chu kì kinh nguyệt mà người phụ nữ khơng thể có thai [1] Vô sinh trở thành mối quan tâm lớn ngành y tế nói riêng tồn xã hội nói chung Theo thống kê tổ chức y tế giới (WHO), tỷ lệ cặp vợ chồng vô sinh từ 6%-12%, coi vấn đề nguy hiểm đứng thứ sau bệnh ung thư tim mạch [1] Tỷ lệ Việt Nam 7,7% [2] Một nguyên nhân dẫn tới vô sinh tinh trùng không thụ tinh với trứng tắc vòi tử cung, tinh trùng trứng bất thường… Có nhiều phương pháp điều trị vô sinh tùy thuộc vào nguyên nhân gây vơ sinh, kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF) đời giúp cho tinh trùng trứng kết hợp bên thể trước đưa lại vào buồng tử cung người phụ nữ Thụ tinh ống nghiệm phương pháp điều trị hiệu cho cặp đôi muộn Tuy nhiên, phôi chuyển sàng lọc hình thái tốt, tỷ lệ có thai IVF thấp, từ 30-35% Nguyên nhân tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể cao trứng phôi [3, 4] Rối loạn nhiễm sắc thể (NST) nguyên nhân hàng đầu dẫn tới thai không làm tổ, sảy thai, thai lưu dị tật thai nhi [5] Tần suất rối loạn nhiễm sắc thể cao q trình chuyển phơi đặt yêu cầu phải sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể phôi trước chuyển vào tử cung người phụ nữ [6] Cùng với phát triển khoa học, kỹ thuật phân tích di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Testing - PGT) đời, q trình giúp nhà khoa học chọn tương đối xác phơi khơng có bất thường di truyền để cấy vào tử cung người mẹ nhằm nâng cao tỷ lệ thành công kỹ thuật IVF giúp cho đời em bé khỏe mạnh Phân tích rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi sàng lọc phôi, đánh giá rối loạn cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể phôi trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Testing Aneuploidy, PGT-A) Phương pháp áp dụng bệnh nhân có nguy cao rối loạn nhiễm sắc thể ứng dụng lâm sàng để cải thiện tỷ lệ thành công điều trị vô sinh, đặc biệt với cặp vợ chồng có tiên lượng xấu tuổi mẹ cao, chuyển phôi thất bại nhiều lần sảy thai liên tiếp Gần đây, tổng hợp kết nghiên cứu sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi cho thấy tỷ lệ chuyển phơi, có thai tăng lên đáng kể [7], [8], [9] Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (Fluorescence In Situ Hydridization – FISH) sử dụng probe đặc hiệu cho NST có tỷ lệ dị bội cao 21, 18, 13, X, Y Tuy nhiên, số nghiên cứu gần kỹ thuật FISH không làm tăng hiệu có thai kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm Hiện nay, có nhiều kỹ thuật giúp sàng lọc 24 NST tế bào aCGH, SNP, QF-PCR Kỹ thuật aCGH kỹ thuật sử dụng rộng rãi coi tiêu chuẩn vàng sàng lọc di truyền trước chuyển phôi giới [9] Gần đây, kỹ thuật giải trình tự hệ (Next Generation Sequencing NGS) đời tạo cách mạng công nghệ sinh học, ứng dụng nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng Sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi dựa kỹ thuật NGS khác nhiều so với kỹ thuật trước PGT-NGS có nhiều ưu điểm trội như: thực vài tế bào phôi, liệu xác, kỹ thuật phân tích đơn giản, thiết bị đáng tin cậy có giá thành hợp lý Sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể dựa kỹ thuật NGS tạo nhiều lợi ích aCGH giảm chi phí giải trình tự, có khả đánh giá tổn thương cấu trúc nhiễm sắc thể, khả tự động hóa cao giúp giảm thiểu sai sót trình thực [10] Ở Việt Nam, kỹ thuật FISH áp dụng Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Hùng Vương, Học viện Quân y Tuy nhiên hiệu việc sàng lọc thấp hạn chế số lượng nhiễm sắc thể sàng lọc Kỹ thuật NGS sàng lọc 24 nhiễm sắc thể phôi bước đầu thực chưa có nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu cụ thể Mặt khác, yêu cầu thực tiễn lâm sàng đặt nhu cầu cần đánh giá yếu tố liên quan tới rối loạn nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm nhằm tư vấn lựa chọn phương án điều trị phù hợp cho cặp vợ chồng điều trị vơ sinh Vì vậy, tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi” với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể tế bào phơi dư kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) Áp dụng quy trình xây dựng phôi thụ tinh ống nghiệm Đánh giá kết kỹ thuật giải trình tự hệ (NGS) sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 1.1.1 Định nghĩa vô sinh Theo Tổ chức Y tế giới (WHO): Vô sinh trạng thái thai sau năm chung sống vợ chồng mà không dùng biện pháp tránh thai Những trường hợp có ngun nhân vơ sinh tương đối rõ ràng việc tính thời gian khơng đặt nữa, cặp vợ chồng mà vợ 35 tuổi, sau tháng mong muốn có mà khơng có thai coi vơ sinh, cần khám điều trị sớm [11] [12] Vô sinh gồm: Vô sinh nguyên phát (VSI) vô sinh thứ phát (VSII) Vơ sinh ngun phát (VSI) chưa có thai lần nào, cịn vơ sinh thứ phát (VSII) tiền sử có thai lần [11] Việc xác định tỷ lệ vô sinh cách xác khó khăn tỷ lệ khơng nhỏ cặp vợ chồng cịn khám chữa bệnh cở sở y tế tư nhân thầy lang 1.1.2 Nguyên nhân vô sinh Theo nghiên cứu Giáo sư Nguyễn Khắc Liêu cộng Viện bảo vệ bà mẹ trẻ sơ sinh với đầy đủ phương pháp thăm dò độ thơng đường sinh dục nữ, phóng nỗn, tinh trùng… tỷ lệ vơ sinh nữ 55,4 %, vô sinh nam 35,6 % vô sinh không rõ nguyên nhân 10 % [11] 1.1.3 Điều trị vô sinh Tùy thuộc nguyên nhân gây vô sinh mà có biện pháp điều trị khác từ điều trị nội khoa đến cấy phôi thông qua kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Assisted Reproductive Technology-ART) Có phương pháp điều trị dành riêng cho nam giới phụ nữ số có liên quan đến hai đối tác Trong số đó, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ngày áp dụng rộng rãi giải triệt để hầu hết nguyên nhân vô sinh 1.1.3.1 Phương pháp bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI) 1.1.3.2 Một số phương pháp hỗ trợ sinh sản Hỗ trợ sinh sản phương pháp điều trị bao gồm thao tác noãn, tinh trùng phơi ngồi thể nhằm giúp cặp vợ chồng vô sinh mang thai - Phương pháp thụ tinh ống nghiệm Từ đứa trẻ Louis Brown đời phương pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF) vào năm 1978 Anh, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản hình thành khơng ngừng phát triển Thụ tinh ống nghiệm phương pháp cho tinh trùng thụ tinh với nỗn ống nghiệm thay vòi tử cung người phụ nữ Đây phương pháp điều trị chủ yếu cho cặp vợ chồng vô sinh can thiệp kỹ thuật hỗ trợ sinh sản khác mà không đạt kết Kỹ thuật thực thành công lần Việt Nam năm 1998 [13] Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) kỹ thuật đời nhằm khác phục tình trạng tỉ lệ thụ tinh thấp không thụ tinh thực TTTON bất thường trình thụ tinh chất lượng tinh trùng thấp Với kỹ thuật này, người ta tạo hợp tử hoàn chỉnh trứng tinh trùng với hỗ trợ hệ thống vi thao tác kính hiển vị đảo ngược có độ phóng đại 200 300 lần + Thăm khám cặp vợ chồng làm xét nghiệm cần thiết + Đánh giá dự trữ buồng trứng + Dùng thuốc để kích thích nhiều nỗn phát triển + Theo dõi kích thước nang nỗn, điều chỉnh lại thuốc cho thích hợp để tránh tác dụng phụ (siêu âm đầu dò âm đạo, thử estradiol máu) Tiêm thuốc giúp trưởng thành nang noãn đủ điều kiện + Chọc hút noãn qua đường âm đạo hướng dẫn siêu âm (sau tiêm hCG 32 - 36 giờ) + Bắt đầu hỗ trợ pha hồng thể chuyển phơi tươi + Lấy tinh trùng ngày với ngày chọc hút noãn + Cho tinh trùng thụ tinh với noãn theo phương pháp IVF cổ điển phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn (ICSI) + Chuyển phơi (2 - ngày sau) qua đường cổ tử cung vào buồng tử cung, thường chuyển phôi + Tiếp tục hỗ trợ pha hồng thể chuyển phơi tươi + Thử thai định lượng bhCG huyết theo dõi + Siêu âm đường âm đạo để xác nhận phát triển thai vị trí thai Trong kỹ thuật hỗ trợ sinh sản trên, kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm áp dụng ngày rộng rãi mang lại nhiều kết đáng ghi nhận IVF kỹ thuật hỗ trợ sinh sản bao trùm nhiều nguyên nhân gây vô sinh kỹ thuật hỗ trợ sinh sản triệt để Tuy nhiên, tỷ lệ thành công lần chuyển phơi thụ tinh ống nghiệm cịn thấp, từ 30-35% Nguyên nhân chủ yếu rối loạn NST gây phôi không làm tổ, sảy thai, thai lưu dị tật bẩm sinh trẻ Do vậy, cần thiết hiểu rõ rối loạn nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm, áp dụng kỹ thuật sàng lọc di truyền trước chuyển phôi nhằm nâng cao hiệu thụ tinh ống nghiệm 1.2 Rối loạn nhiễm sắc thể phôi IVF 1.2.1 Sự phát triển bình thường phơi trước làm tổ kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm Hình 1.4 Các giai đoạn phát triển phôi 1.2.2 Rối loạn nhiễm sắc thể nỗn phơi 1.2.2.1 Rối loạn nhiễm sắc thể Hiện tượng rối loạn nhiễm sắc thể tượng bất thường số lượng, cấu trúc nhiễm sắc thể Mất cân nhiễm sắc thể dẫn đến tình trạng phơi ngừng phát triển trước làm tổ, sẩy thai thai chết lưu Tuy nhiên, phơi bị rối loạn nhiễm sắc thể sống phát triển thành thai bất thường trường hợp hội chứng Down hội chứng Klinefelter Rối loạn nhiễm sắc thể yếu tố quan trọng làm cho tỷ lệ sinh sản người thấp 1.2.2.2 Phơi thể khảm Nhờ có kỹ thuật IVF mà rối loạn nhiễm sắc thể phôi người giai đoạn trước chuyển phôi phát Vào năm1993, Delhanty cộng lần công bố tượng phôi thể khảm giai đoạn trước chuyển phôi Phôi thể khảm phơi có hay nhiều dịng tế bào có số lượng NST khác có phơi [14] 1.2.2.3 Tỷ lệ lệch bội phơi nỗn * Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể noãn Tỷ lệ rối loạn NST noãn tương đối cao tăng dần phụ nữ lớn tuổi Munne cộng sử dụng phương pháp FISH cho cặp NST (13, 15, 16, 18, 21, 22, XY) để nghiên cứu cực cầu I 226 bệnh nhân (26-47 tuổi, trung bình 38,2 tuổi) thấy tỷ lệ rối loạn NST nhóm 35 tuổi 50%; 35-39 tuổi 60% 40 tuổi 66,7%) [15] * Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể phôi ngày Sau thụ tinh, phôi thường nuôi cấy thêm khoảng ngày (giai đoạn phân chia) đến 5-6 ngày (giai đoạn phôi nang) Trên 50% phôi tạo ống nghiệm giai đoạn phân chia có rối loạn NST, tỷ lệ tăng lên đến 80% phụ nữ lớn tuổi Năm 2012, Al-Asma cộng dùng phương pháp FISH đầu dò (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, XY) đánh giá 393 phôi ngày 70 bệnh nhân có tuổi trung bình 34,6 có tiền sử sẩy thai bị rối loạn NST (thai tự nhiên hay thai tạo IVF), tỷ lệ rối loạn NST 67,8% NST có tỷ lệ rối loạn NST cao 16 22 [16] * Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể phôi nang Mặc dù số phôi bất thường ngừng phát triển từ giai đoạn ngày phần lớn phát triển đến giai đoạn phôi nang Ở giai đoạn phôi nang, 40% phôi bị rối loạn NST, tỷ lệ tăng với tuổi mẹ Schoolcraft cộng năm 2010, sử dụng phương pháp lai so sánh (Comparative genomic hybridization - CGH) 269 phôi nang 45 bệnh nhân có tuổi trung bình 37 tuổi thấy tỷ lệ rối loạn NST 51,3% [17] Fragouli cộng năm 2010 sử dụng phương pháp CGH nhóm bệnh nhân tuổi trung bình 39,8 thấy tỷ lệ rối loạn NST phôi nang 45,2% [18] 1.2.3 Các yếu tố nguy rối loạn nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm 1.2.3.1.Tuổi người mẹ Độ tuổi trung bình để mang thai cặp vợ chồng tăng lên đáng kể thập kỷ gần với độ tuổi trung bình khoảng 30 nhiều nước Trong sinh sản tự nhiên, phụ nữ lớn tuổi khả sinh sản giảm Điều với thụ tinh ống nghiệm, tuổi người mẹ cao nguy gây bất thường cho phơi thụ tinh lớn [19] Một số nghiên cứu cho 20% noãn người bị lệch bội NST, tỷ lệ tăng lên đáng kể người phụ nữ 35 tuổi trung bình khoảng 70% [46], [18, 20] Tuy nhiên tác giả cho bất thường loại thể khảm thường không phụ thuộc vào tuổi, Munne lại cho thể khảm chế khơng phân ly tăng lên với tuổi mẹ tăng [21] 1.2.3.2 Yếu tố thể chất môi trường ảnh hưởng đến rối loạn nhiễm sắc thể Yếu tố môi trường bao gồm tác nhân tạo rối loạn NST đột biến gen tế bào có lệch bội NST Các tác nhân quan trọng bao gồm: - Hút thuốc lá: Nam giới hút thuốc có số lượng khả di động tinh trùng thấp Năm 2001, Shi cộng công bố chất thuốc làm tăng tổn thương DNA tinh trùng làm giảm chất lượng tinh trùng [22] Ở người mẹ hút thuốc khiến cho thoi phân bào bị tan rã bất hoạt chức năng, làm tăng nguy xuất giao tử lưỡng bội phôi tam bội; tế bào sinh dục gốc có xu hướng bị NST khơng phân ly dẫn đến hình thành phôi thể khảm lệch bội NST bào thai gây sẩy thai sớm - Cocain: Có mối liên quan thai phụ sử dụng cocain thai bị dị tật tim phổi thần kinh đột biến gen rối loạn NST - Phóng xạ; tia X; tia α, tia tử ngoại: liên quan đến dị tật bẩm sinh rối loạn NST 1.2.3.3 Các nguyên nhân gây vô sinh Fasolino 2007 quan sát thấy ngun nhân gây vơ sinh có liên quan đáng kể với rối loạn phân bào giảm phân dẫn đến lệch bội NST phôi [23] 1.2.3.4 Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm * Phương pháp sử dụng hormon kích thích * Nhiệt độ phịng thí nghiệm * Những yếu tố từ tinh trùng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn 1.2.3.5 Hormon kích thích đáp ứng buồng trứng Mặc dù lệch bội NST xuất phát từ trình tạo giao tử, nhiên q trình kích thích hormone đáp ứng bệnh nhân ảnh hưởng tới hình thành lệch bội NST 1.3 Các kỹ thuật sàng lọc di truyền trước chuyển phơi 1.3.1 Quy trình sinh thiết phôi để sàng lọc di truyền trước chuyển phôi Qui trình sinh thiết chung bao gồm việc sử dụng kính hiển vi đảo ngược gắn hệ thống vi thao tác để cố định mẫu vật, mở cửa sổ màng zona pellucida, dùng kim sinh thiết để lấy mẫu vật khỏi trứng hay phơi Sau trứng hay phôi tiếp tục nuôi cấy, mẫu vật cố định để sàng lọc phát rối loạn di truyền Sinh thiết phơi thực giai đoạn khác nhau: sinh thiết trước sau trứng thụ tinh (sinh thiết thể cực thứ thứ hai), sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt (ngày thứ sau thụ tinh) hay sinh thiết giai đoạn phôi nang (ngày thứ sau thụ tinh) Sinh thiết thể cực Sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt Sinh thiết phơi nang Hình 1.5 Ba giai đoạn thực sinh thiết phôi 1.3.2 Các kỹ thuật sàng lọc di truyền trước chuyển phôi Sự thành công kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm phụ thuộc vào có chọn phơi tốt hay khơng trước chuyển vào buồng tử cung người vợ Hiện tượng lệch bội NST phôi người trình điều trị thụ tinh ống nghiệm nêu lên từ lâu nhiều nghiên cứu công nhận tượng lệch bội NST xảy giai đoạn trước làm tổ Từ nhiều năm nay, việc lựa chọn phôi đa phần dựa tiêu chuẩn hình thái tiêu chuẩn phát triển phôi [24] Tuy nhiên, nhiều chu kỳ chuyển phôi thất bại dù phơi lựa chọn hình thái tốt Nhiều nghiên cứu thực nhằm tìm mối liên quan hình thái phơi rối loạn NST đưa kết luận rằng: hình thái phơi phát triển bình thường khơng thể khẳng định phơi khơng có rối loạn NST ngược lại Thực tế cho thấy, nhiều phôi bào có rối loạn NST rối loạn cho phép phơi phát triển để có hình thái tốt Ngược lại, nhiều phơi khơng có rối loạn NST lại có hình thái xấu dựa tiêu chuẩn lựa chọn hình thái [25], [26] Do vậy, phân tích hình thái khơng đủ để đưa định lựa chọn phơi có vật liệu di truyền bình thường trước chuyển phơi vào buồng tử cung người vợ Ở người, tế bào có 2n = 46 NST, gồm 23 cặp NST (22 cặp NST thường cặp NST giới tính) Ở nam giới, cặp NST giới tính XY; nữ giới cặp NST giới tính XX Do nữ giới có 23 loại NST, nam giới có 24 loại NST Sự tăng giảm số lượng số NST 46 NST bình thường gọi lệch bội NST PGT-A phương pháp nhằm kiểm tra rối loạn NST phôi trước phôi chuyển vào tử cung người vợ, định cho phôi tạo từ cặp vợ chồng tham gia IVF PGT-A (PGS) đặc biệt ưu tiên làm bệnh nhân có tiên lượng điều trị thụ tinh ống nghiệm như: mẹ lớn tuổi, nhiều lần IVF thất bại [27] 1.3.2.1 Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ FISH (Fluorescent in situ Hybridization) 1.3.2.2 Kỹ thuật KaryoLite BoBs (BACs - on - Beads) 1.3.2.3 Kỹ thuật lai so sánh gen CGH (Comparative Genomic Hybridization) 1.3.2.4 Kỹ thuật lai so sánh gen dùng chíp DNA (Array Comparative Genomic Hybridization-aCGH) 1.3.2.5 Kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing NGS) * Khái niệm nguyên lý Kỹ thuật a-CGH kỹ thuật phép sàng lọc 24 NST coi “tiêu chuẩn vàng” PGS thực hành Tuy nhiên, cơng nghệ giải trình tự gen hệ NGS gần giới thiệu cho để ứng dụng PGS với độ xác tỷ lệ thành cơng cao a-CGH Kỹ thuật giải trình tự gen hệ cách mạng cơng nghệ giải trình tự, cho phép giải từ 36 Gb đến 600Gb, có nghĩa cho phép giải trình tự ngun gen Cơng nghệ thực tế phương thức giải trình tự đồng thời lượng lớn đoạn ngắn nucleotide Do kỹ thuật giải trình tự hệ cịn gọi giải trình tự gen Kỹ thuật NGS kỳ vọng làm giảm giá thành cho PGT có độ xác cao Kỹ thuật bắt đầu áp dụng rộng rãi số nước châu Âu Mỹ từ năm 2014 để phân tích NST phôi nang Sàng lọc rối loạn NST trước chuyển phôi dựa kỹ thuật NGS khác nhiều so với kỹ thuật khác NGS thực vài tế bào phơi, liệu xác, kỹ thuật phân tích đơn giản, thiết bị đáng tin cậy có giá thành hợp lý Sàng lọc rối loạn NST dựa kỹ thuật NGS tạo nhiều lợi ích aCGH giảm chi phí giải trình tự, có khả đánh giá tổn thương cấu trúc NST, khả tự động hóa cao giúp giảm thiểu sai sót q trình thực Đánh giá số lượng NST dựa NGS mang lại nhiều lợi ích a-CGH bao gồm: (i) giảm chi phí trình tự DNA thực cơng nghệ phân tích thơng lượng cao số lượng mẫu giải trình tự đồng thời thử nghiệm; (ii) tăng cường phát rối loạn cấu trúc kết gia tăng tiềm độ phân giải phân tích NST đến vài megabases; (iii) tăng phạm vi động cho phép phát khả phát khảm 10