Đang tải... (xem toàn văn)
PHẦN V KẾT QUẢ THỰC HIỆN DỰ ÁN 5 1 Hoàn thiện quy trình công nghệ sản suất bộ kit chẩn đoán đột biến gen AZF gây vô sinh nam giới ở quy mô phòng thí nghiệm (Nội dung 1) 5 1 1 Hoàn thiện bộ hỗn hợp (Ma[.]
PHẦN V KẾT QUẢ THỰC HIỆN DỰ ÁN 5.1 Hoàn thiện quy trình cơng nghệ sản suất kit chẩn đốn đột biến gen AZF gây vơ sinh nam giới quy mơ phịng thí nghiệm (Nội dung 1) 5.1.1 Hồn thiện hỗn hợp (Mastermix) chẩn đốn đoạn AZF (Công việc 1) 5.1.1.1 Thiết kế trình tự mồi (STS) chẩn đốn đoạn AZF gồm có STS (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) STS đối chứng SRY ZFX/Y Với mục đích để dễ dàng cho việc phân tách sản phẩm PCR trình tự điện agarose, thiết kế lại mồi cho trình tự AZF là: sY84 sY86 thuộc AZFa, sY127 thuộc AZFb dựa vào trình tự nucleotide NST Y cơng bố ngân hàng gen NCBI Nguyên tắc thiết kế lại cặp mồi phải bao trùm nằm gọn không xa so với trình tự tương ứng khuyến cáo EAA/EMQN Các trình tự sY84, sY86, sY127 thiết có kích thước là: 550bp, 640bp 231bp Ngoài ra, hai đối chứng SRY ZFX/Y có kích thước 472bp 495bp, khó để phân tách điện di agarose Do vậy, chúng tơi thiết kế mồi để tăng kích thước trình tự ZFX/Y thành 767bp (bảng 5.1) Bảng 5.1 Danh sách trình tự mồi khuếch đại đoạn AZF TT Tên mồi sY255 sY127 sY134 Kích thước (bp) F* R* F R F Ghi 123 231 301 26 ** TT Tên mồi sY254 SRY sY86 sY84 ZFX/Y Kích thước (bp) R F R F R F R F R F R Ghi 380 472 550 640 767 ** ** ** Ghi chú:* F trình tự mồi xi; R trình tự mồi ngược; ** Các trình tự mồi thiết kế Các mồi đặt mua từ hãng sản xuất (IDT, Sigma, Invitrogen,…) cung cấp dạng đông khô Các mồi pha nồng độ gốc 100 µM theo hướng dẫn chi tiết đơn giao hàng bảo quản - 20oC - Kiểm tra tính đặc hiệu mồi phản ứng PCR đơn mồi Tính đặc hiệu mồi nhân STS tham khảo theo khuyến cáo EAA/EQMN mồi sau thiết kế kiểm tra phản ứng PCR đơn với thành phần sau: - Kiểm tra có mặt STS phản ứng PCR đơn mồi Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5% (Hình 5.1) 27 Hình 5.1 Điện di đồ sản phẩm PCR với STS đơn (bộ AZF bản) DNA nam giới bình thường sử dụng làm khuôn cho sản phẩm PCR M: Marker 100 bp Kết cho thấy, tất sản phẩm thu với kích thước tính tốn lý thuyết Tuy nhiên, với cặp mồi nhân STS đơn sY86-1 sản phẩm PCR có sản phẩm phụ, cặp mồi nhân STS đơn sY86-2 cặp mồi nhân STS đơn khác cho sản phẩm đặc hiệu Do vậy, cặp mồi lựa chọn AZF bao gồm: sY255 (123 bp), sY127-2 (231 bp), sY134 (301 bp), sy254 (380 bp), SRY (472 bp), ZFXY-2 (767 bp), sY86-2 (550 bp), sY84 (640 bp) 28 Bảng 5.6 Các thị STS kích thước (bp) chúng xét nghiệm AZF Vùng AZFa AZFb AZFa Chứng nội STS EAA/EMQN (bp) 326 318 274 301 380 123 472 495 sY84 sY86 sY127 sY134 sY254 sY255 SRY ZFX/Y Dự án (bp) 642 550 231 301 380 123 472 767 - Tối ưu STS AZF phản ứng mPCR Bộ xét nghiệm AZF chạy thử với 04 mẫu DNA đối chứng nam giới, không bị đoạn, 01 đối chứng nữ Kết thể hình 5.2 Đối chứng nữ cho kết dương tính với thị ZFX, thị STS đặc hiệu cho NST Y âm tính Với mẫu DNA 04 nam giới bình thường cho băng DNA với kích thước dự tính STS Các băng phân tách dễ dàng nhận biết điện di agarose 3%, 100 V vịng 75 - 90 phút (Hình 5.2) 29 Hình 5.2 Điện di đồ sản phẩm mPCR AZF M: marker 100 bp, (-) đối chứng âm, nữ: DNA nữ giới, bình thường, TL19087, TL19094, TL9114, TL19117: DNA nam giới bình thường Như vậy, nghiên cứu thành công việc thiết kế xét nghiệm AZF Tuy nhiên, để có đánh giá đầy đủ AZF bản, cần thiết phải sản xuất số lượng lớn xét nghiệm AZF áp dụng mẫu bệnh nhân 5.1.1.2 Tách dịng tồn thị STS có mặt xét nghiệm AZF vào vector tách dịng Để phục vụ cho việc giải trình tự thị STS có mặt xét nghiệm AZF bản, sản phẩm PCR chứa thị tinh sạch, sau gắn vào vector pBT enzyme T4 ligase, tiếp đến sản phẩm ligate biến nạp vào E.coli DH5α Để chọn dòng tế bào E.coli DH5α tái tổ hợp, tiến hành phản ứng colonyPCR sử dụng cặp mồi PUC18_F (5’-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’) PUC18R (5’-GCGGATAACAATTTCACACA-3’) Kết điện di sản phẩm colony-PCR sử dụng cặp mồi PUC18_F/R sàng lọc dòng E coli DH5α mang đoạn DNA nhân dòng vector pBT thể hình 5.4 30 Hình 5.4 Kết colony-PCR sử dụng cặp mồi PUC18_F/R sàng lọc dòng E coli DH5α mang đoạn DNA nhân dòng vector pBT Kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu theo kích thước tính tốn lý thuyết (kích thước STS + 164 bp) Như tách dịng thành cơng thị STS có mặt xét nghiệm AZF Các plasmid pBT tái tổ hợp sau tách chiết, tinh sử dụng để giải trình tự STS AZF 5.1.1.3 Đọc trình tự nucleotide tồn thị có mặt xét nghiệm AZF Các vector pBT tái tổ hợp chứa STS xét nghiệm AZF sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự với M13-F (5´- GTAAAACGACGGCCAG-3´), sử dụng BigDye terminator cycler v3.1 đọc kết hệ thống ABI3500XL (Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự nucleotide thu 31 phân tích phần mềm Bioedit Trình tự ADN sau đọc hiệu chỉnh với trợ giúp phần mềm ChromasPro1.7.6 (Technelysium, 2013) để loại bỏ tín hiệu nhiễu Các trình tự STS có mặt xét nghiệm AZF trình bày bảng 5.12 Các trình tự phân tích phần mềm Bioedit phù hợp với ngân hàng gen AZF Ví dụ kết đọc trình tự với mồi M13 thị sY255 (Hình 5.5) Hình 5.5 Trình tự với mồi M13 thị sY255 5.1.1.4 Sản xuất thử kit AZF bản, kit tương ứng với 20 mẫu, 20 mẫu bệnh nhân, bao gồm mẫu chứng âm mẫu chứng dương Bộ kit AZF sử dụng để xác định đoạn AZFa, AZFb, AZFc 20 bệnh nhân nam cung cấp với Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Kết phân tích kit AZF thể hình 5.6 20/20 bệnh nhân nam cho kết khuếch đại tất thị có xét nghiệm AZF Các thị đối chứng SRY ZFXY 20 mẫu bệnh nhân cho kết dương tính Trong 32 đó, mẫu đối chứng nam nam giới không bị đoạn cho kết khuếch đại tất thị có xét nghiệm AZF Đối chứng trắng cho kết âm tính, đối chứng nữ cho kết khuếch đại với thị ZFX/Y, với yêu cầu xét nghiệm (Hình 5.6) Hình 5.6 Điện di đồ sản phẩm mPCR AZF với 20 mẫu bệnh nhân M: marker 100 pb plus, (-) đối chứng âm, nữ: ADN tách từ nữ giới Như vậy, với xét nghiệm AZF thiết kế cho 20 mẫu bệnh nhân 01 mẫu chứng dương 01 mẫu chứng âm cho phép chẩn đoán diện tất 08 STS có mặt xét nghiệm Cần tiến hành xét nghiệm AZF mở rộng E1 mở rộng E2 để có kết luận xác đột biến AZF Các nghiên cứu tập trung vào việc xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, tính lặp lại xét nghiệm AZF với số lượng bệnh nhân lớn (n=400) để đảm bảo kit AZF 33 có độ tin cậy cao chẩn đốn 5.1.1.5 So sánh với kit chẩn đốn có IVD, kit sử dụng Devyser v2 (Thụy Điển) chẩn đốn vị trí STS vùng AZF (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) trình tự chứng SRY, ZFX/Y Khi so sánh với kit chẩn đốn có IVD, kit sử dụng Devyser v2 (Thụy Điển) chẩn đốn vị trí STS vùng AZF (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) trình tự chứng SRY, ZFX/Y, nhận thấy: Kết 20 bệnh nhân, đối chứng nam, đối chứng nữ chạy AZF tự thiết kế hoàn toàn trùng khớp với kết chạy kit Devyser v2 5.1.2 Hồn thiện hỗn hợp (Mastermix) chẩn đốn đoạn AZF mở rộng (Công việc 2) 5.1.2.1 Thiết kế trình tự mồi (STS) chẩn đốn đoạn AZF mở rộng AZF mở rộng bao gồm 11 STS gồm có: sY88, sY121, sY1182, sY105, sY1191, sY1291, sY153, sY160, sY82, sY143, sY83, hai đối chứng SRY, ZFX/Y Bảng 5.15 Trình tự mồi kích thước AZF mở rộng E1 TT Kích thước sản phẩm PCR (bp) Tên mồi sY88 sY121 sY1182 sY105 sY1191 sY1291 SRY ZFXY-1 ZFXY-2 F* R* F R F R F R F R F R F R F R F R Ghi 123 190 247 301 385 527 472 767 767 34 ** ** Chú thích:* F trình tự mồi xi; R trình tự mồi ngược; ** Các trình tự mồi thiết kế Bảng 5.16 Trình tự mồi kích thước AZF mở rộng E2 Thứ tự Tên mồi sY153 sY160 sY82 sY143 sY83-1 sY83-2 SRY ZFXY-1 ZFXY2 Kích thước sản phẩm PCR (bp) F R F R F R F R F R F R F R F R F R Ghi 139 236 264 311 400 400 ** ** 472 767 767 ** ** Chú thích:* F trình tự mồi xi; R trình tự mồi ngược; ** Các trình tự mồi thiết kế - Kiểm tra tính đặc hiệu mồi nhân STS phản ứng PCR đơn Sản phẩm PCR STS đơn điện di kiểm tra gel agarose 1,5% (Hình 5.9) Hình 5.9 Điện di đồ sản phẩm PCR với STS đơn (bộ AZF mở rộng) 35