Đang tải... (xem toàn văn)
PHẦN I MỞ ĐẦU Đột biến mất đoạn vùng AZF là nguyên nhân di truyền phổ biến đứng thứ hai, gây vô sinh ở nam giới AZF (Azoospermia factor) nằm ở vùng đặc hiệu giới tính nam trên nhiễm sắc thể giới tính[.]
PHẦN I MỞ ĐẦU Đột biến đoạn vùng AZF nguyên nhân di truyền phổ biến đứng thứ hai, gây vô sinh nam giới AZF (Azoospermia factor) nằm vùng đặc hiệu giới tính nam nhiễm sắc thể giới tính Y (NST Y), gọi yếu tố vơ tinh hay yếu tố khơng có tinh trùng Trên vùng AZF có chứa gen quy định việc sản xuất, biệt hóa trưởng thành tế bào sinh dục nam tinh trùng Đột biến đoạn AZF hay gọi đột biến đoạn nhỏ nhiễm sắc thể (NST) Y bất thường cấu trúc hay gặp NST Y dẫn đến người nam bị hạn chế khơng có khả sinh tinh tinh trùng Tỉ lệ nam giới vô sinh đoạn AZF dao động từ ÷ 17%, gặp nhóm nam giới khơng có tinh trùng nhiều nhóm tinh trùng [1], [2] Vùng AZF chia thành phân vùng nhỏ AZFa, AZFb AZFc Trên vùng có trình tự nucleotid ngắn hệ gen, gọi trình tự đánh dấu STS (Sequence-Tagged Sites) Có nhiều STS STS đại diện cho vùng AZF Từ năm 1986, đồ vị trí đoạn nhỏ NST Y thiết lập dựa vào công nghệ PCR khuếch đại STS toàn NST Y [3], [4] Năm 1999, Viện Nam học Châu Âu (EAA - European Academy of Andrology) Mạng lưới chất lượng di truyền phân tử Châu Âu (EMQN European Molecular Genetics Quality Network) tham gia tích cực việc hỗ trợ cải thiện chất lượng xét nghiệm đoạn nhỏ NST việc xuất cẩm nang hướng dẫn phịng thí nghiệm cung cấp chương trình ngoại kiểm để đảm bảo chất lượng kết xét nghiệm [5], [6] Theo EAA EMQN, quy trình chẩn đốn đoạn nhỏ NST Y thực phản ứng multiplex PCR (mPCR, PCR đa mồi), khuếch đại vùng đặc hiệu NST Y áp dụng cho bệnh nhân nam có số mật độ tinh trùng thấp 5x10 6/mL tinh dịch Có khoảng 300 STS đặc hiệu cho vùng AZF sử dụng cho chẩn đốn đoạn nhỏ, nhiên sử dụng tất STS cho chẩn đoán thời gian tốn Về mặt nguyên tắc, cần phân tích STS vùng AZF đủ để xác định đoạn vùng AZFa, AZFb, AZFc Tuy nhiên phân tích hai STS vùng làm tăng độ xác chẩn đốn Do đó, EAA khuyến cáo cần sử dụng STS cho phát đoạn nhỏ phân vùng (độ xác xét nghiệm lên tới 95%) Các STS khuyến cáo để sử dụng phát đoạn vùng AZF gồm: vùng AZFa: sY84 sY86; vùng AZFb: sY127 sY134; vùng AZFc: sY245 sY255 Năm 2013, EAA EMQN tiếp tục đưa hướng dẫn chẩn đốn vị trí đột biến gen AZF, gọi AZF mở rộng, ngồi vị trí cần xác định đoạn nhỏ AZFa,b,c (6 vị trí sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) cần mở rộng thêm vị trí STS khác bị đoạn AZFa,b,c khơng bỏ sót tình trạng đoạn nhỏ gen NST Y gây vô sinh nam (thêm vị trí AZFa, vị trí AZFb, vị trí AZFc) Mất đoạn vùng AZF khác xuất với tỉ lệ khác nhau, đoạn AZFc chiếm tỉ lệ cao (∼80%), sau AZFa (0,5% đến 4%), AZFb (1% đến 5%) đoạn AZFbc (1% đến 3%) [1] Các nghiên cứu gần phát thêm vị trí đại diện cho vùng AZF abc, vị trí đại diện cho vùng AZFa, AZFb AZFc, cịn có thêm 11 đến 13 STS thuộc vùng AZF mở rộng, nhằm phát đột biến đoạn hoàn toàn cho AZFabc Năm 2018, Lương Thị Lan Anh cộng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hoàn chỉnh đoạn AZF mở rộng với 19 trình tự STS kỹ thuật QF-PCR phát tỉ lệ đoạn tăng lên cao rà soát STS thuộc vùng AZFabc 13 STS thuộc vùng AZF mở rộng, tỉ lệ đoạn nam giới vơ sinh khơng có tinh trùng 40%, vùng AZF 16,7%, vùng AZF mở rộng 83,3% (Lương Thị Lan Anh cộng sự, 2018) Khi phân đoạn khác kiểu đoạn khác cho biểu lâm sàng khác nhau, việc liên quan chặt chẽ đến trình tư vấn sinh sản hỗ trợ sinh sản Vì việc nghiên cứu phân đoạn bị kiểu đoạn quan trọng đến vấn đề điều trị tư vấn bệnh nhân Với tỉ lệ đoạn AZF chiếm đa số nguyên nhân gây vô sinh nam giới, phân tích đoạn nhỏ NST Y vùng AZF xét nghiệm đầu tay nhà nam khoa, sản phụ khoa di truyền chẩn đốn vơ sinh nam giới Lợi ích chẩn đốn mang lại: xác định nguyên nhân vô sinh nam, định hướng cho điều trị tiên lượng, Hiện nước chưa có kit chẩn đốn đoạn AZF, phòng xét nghiệm chủ yếu thực phương pháp thủ công, tốn nhiều thời gian chất lượng ln phải kiểm sốt Các kit chẩn đốn AZF có nguồn gốc ngoại nhập Phương pháp Real-time PCR QF-PCR kit ngoại nhập tối ưu 1-2 phản ứng, kỹ thuật phức tạp giá thành cao Các công ty kinh doanh thương phẩm y tế chủ yếu chào bán kit Devyser (v2 Extension) cho 17 STS - phát đoạn AZF vùng mở rộng, nhiên giá thành cao Với giá thành 30 triệu/ bộ/ 25 test, chi phí cho bệnh nhân bao gồm tiền công, tiêu hao chiết tách DNA từ mẫu khoảng triệu đến triệu đồng cho lần xét nghiệm Tính chung phịng xét nghiệm nước (600 - 1.000 bệnh nhân/1 phòng xét nghiệm cần làm xét nghiệm năm) để thực xét nghiệm với kit ngoại nhập, theo ước tính, Việt Nam cần phải bỏ vài chục đến vài trăm tỷ đồng năm Nhóm nghiên cứu Trường Đại học Y Hà Nội phối hợp với Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á thực dự án cấp Nhà nước: “Hoàn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất kit chẩn đốn đột biến gen AZF gây vô sinh nam giới” với mục đích tạo kit chẩn đốn đoạn AZF đạt tiêu chí chất lượng đảm bảo giá thành hợp lý, số lượng STS đặc trưng cho đột biến liên quan đến bệnh vô sinh nam giới, đại diện cho quần thể người Châu Á nói chung người Việt Nam nói riêng, đồng thời STS cần phải phù hợp với công bố khuyến cáo EAA/EMQN kỹ thuật thực tiện dụng cho người làm xét nghiệm Công nghệ mà dự án thực ứng dụng kỹ thuật mPCR để xác định 17 STS, bao gồm STS thuộc vùng AZF 11 STS thuộc vùng AZF mở rộng Các trình tự đại diện cho vùng AZFa là: sY82, sY83, sY84, sY86, sY88, sY1182, trình tự sY84, sY86 xác định đại diện chính, gọi vùng AZFa bản, trình tự cịn lại gọi AZFa mở rộng Các trình tự đại diện cho vùng AZFb: sY105, sY121, sY127, sY134, sY143, trình tự sY127 sY134 xác định đại diện chính, gọi vùng AZFb bản, trình tự cịn lại gọi AZFb mở rộng Các trình tự đại diện cho vùng AZFc: sY254, sY255, sY1191, sY1192, sY160, sY153, trình tự sY254 sY255 xác định đại diện chính, gọi vùng AZFc bản, trình tự cịn lại gọi AZFc mở rộng Dự kiến mẫu xét nghiệm thực phản ứng mPCR Kỹ thuật mPCR kỹ thuật di truyền phân tử ứng dụng trongphát hiệnđột biến gen có có độ nhạy độ đặc hiệu cao, thực đơn giản, chi phí xét nghiệm hợp lý khơng địi hỏi trang thiết bị đắt tiền Do có nhiều vị trí STS vùng AZF cần phát hiện, kit chẩn đoán đoạn AZF hay nghiên cứu tối ưu ứng dụng kỹ thuật mPCR thường giới hạn phản ứng mPCR phát đồng thời STS Do đó, phải phát đồng thời 17 STS cần tới đến phản ứng lần thực hiện, tốn nhiều thời gian Vì vậy, dự án hồn thiện cơng nghệ để xây dựng quy trình kỹ thuật mPCR cho phát 17 STS với phản ứng lần thực hiện, đồng thời phát triển thành kit chẩn đoán đột biến AZF Nếu dự án thành cơng, sản phẩm dự án có khả cạnh tranh cao với sản phẩm loại thị trường, lý sau: Chúng ta chủ động sản xuất nước, phục vụ nhu cầu chỗ nên nhiều thời gian bảo quản sản phẩm Không trả phí vận chuyển hàng hóa từ nước ngồi Việt Nam Không trả thuế nhập Đây yếu tố cấu thành nên việc kết dự án ứng dụng vào sản xuất kinh doanh hay khơng? Vì khơng trả nhiều loại phí nên giá thành giảm sản phẩm nhập ngoại Và thời gian bảo quản vận chuyển ngắn nên thời gian hiệu lực thực tế sản phẩm dài sản phẩm nhập ngoại Hiện nay, nhu cầu thị trường kit chẩn đoán đoạn AZF cho bệnh nhân nam giới bị vô sinh (nam giới vô sinh khơng có tinh trùng, nam giới vơ sinh tinh trùng, rối loạn giới tính, ) có nhu cầu lớn tiềm năng, đặc biệt chẩn đoán đoạn vùng AZF mở rộng, nhu cầu ứng dụng sản phẩm dự án lớn Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á công ty chuyên sản xuất kit sinh học phân tử với bề dày hoạt động năm, nên việc sản xuất sinh phẩm chẩn đốn Việt Á quy mơ công nghiệp Mặt khác, Việt Á chiếm thị phần lớn kit sinh học phân tử Đa số bệnh viện trung tâm y tế nước khách hàng Việt Á, thuận tiện việc phát triển thị trường sản phẩm dự án Bên cạnh đó, với hệ thống văn phịng đại diện chi nhánh tồn quốc, việc phân phối hỗ trợ kỹ thuật cho sản phẩm dự án đến sở y tế dễ dàng Hơn nữa, việc sản xuất kit sinh học phân tử Việt Á mức độ chuyên nghiệp, việc sản xuất số lượng test lớn mẻ điều khơng khó Mặt khác, gần 50 sở y tế nước có trang bị hệ thống xét nghiệm PCR real-time PCR khách hàng Việt Á, 10 sở có số lượng tiêu thụ hàng tháng lớn Nếu tính riêng 10 sở này, với số lượng kit đề xuất (trong 24 tháng) tính trung bình sơ sở tiêu thụ 200 test/tháng, số hoàn tồn khả thi Mơ hình kết hợp dự án Trường - Doanh nghiệp có đủ lực nghiên cứu - sản xuất - kinh doanh sau dự án có sản phẩm hồn chỉnh với đầy đủ chứng nhận chất lượng dây chuyền sản xuất sản phẩm chuyên nghiệp, hy vọng dự án đạt mục tiêu đề PHẦN II MỤC TIÊU CỦA DỰ ÁN Có quy trình cơng nghệ sản xuất kit chẩn đoán đột biến gen AZF* gây vô sinh nam giới Xây dựng tiêu chuẩn sở kit chẩn đoán đột biến gen AZF* gây vô sinh nam giới Sản xuất 300 kit đạt tiêu chuẩn sở (mỗi kit bao gồm 20 test thực cho 20 mẫu) Chú thích thuật ngữ: * Gen AZF: Vùng AZF nhiễm sắc thể giới tính Y chứa gen quy định việc sinh tinh trùng, trưởng thành biệt hóa tinh trùng PHẦN III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 AZF vô sinh nam giới 3.1.1 AZF 3.1.1.1 Khái niệm Trên nhiễm sắc thể giới tính Y có vùng đặc hiệu nam giới, không tương đồng với nhiễm sắc thể giới tính X (MSY: male specific region of the chromosome Y) Tại vùng có chứa nhiều gen kiểm sốt hình thành giới sinh tinh trùng, vùng có chứa nhóm gen sinh tinh trùng gọi tiểu vùng AZF thuộc MSY, đột biến đoạn gen vùng AZF dẫn đến vô sinh nam Hầu hết gen đặc trưng nhiễm sắc thể Y nằm vùng AZF AZF (Azoospermia factor) gọi yếu tố vơ tinh yếu tố khơng có tinh trùng, vùng gồm tập hợp gen nằm nhánh dài NST Y, vị trí q11.23 (Yq11.23) có chức tạo tinh trùng AZF vùng chủ yếu sàng lọc đoạn nhỏ NST Y mức độ thường gặp Vùng chia làm đoạn AZFa, AZFb, AZFc 3.1.1.2 Cấu trúc vùng AZF nhiễm sắc thể giới tính Y Đoạn AZFa nằm gần tâm NST Y, vùng Yq11.21 (D3-D6), đoạn 5, phân đoạn 5C Đoạn AZFa kéo dài 1,1Mb [7], mã hóa gen quan trọng chức sinh tinh trùng, gen USP9Y (Ubiquitin specific peptidase 9, Y-linked), DBY (Dead box on Y) UTY (Ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene, Y-linked) Các gen liên quan đến sinh tinh trùng Đoạn AZFb nằm phân đoạn 5M đến 6B, AZFa AZFc, kích thước lớn 6,2Mb đến 7,7Mb, có đoạn trùng lặp với vùng AZFc 1,5Mb Các gen bao gồm KDM5D (lysine K-specific demethylase 5D), EIF1AY (eukaryotic translation initiation factor 1A, Y-linked), RPS4Y2 (Ribosomal protein S4 Y isoform 2), CYORF15 (chromosome Y open reading frame 15A and 15B), XKRY (XK, Kell blood group complex subunit-related, Y-linked), HSFY (heat shock transcription factor, Y-linked) Gen KDM5D có vai trị sinh tinh trùng tái cấu trúc tế bào sinh tinh (trong kì đầu I giảm phân) Gen EIF1AY có vai trị khởi đầu q trình dịch mã Gen RPS4Y2 điều hịa sau phiên mã q trình tạo tinh trùng Gen CYORF15 liên quan đến điều hòa phiên mã tổng hợp nguyên bào xương, vai trò sinh tinh chưa biết rõ Hình 3.4 Các gen vùng AZF A Sơ đồ cấu trúc nhiễm sắc thể Y: PAR1, PAR2 (pseudo autosomal regions): vùng giả nhiễm sắc thể thường; Yp: nhánh ngắn nhiễm sắc thể Y; Yq: nhánh dài nhiễm sắc thể Y; MSY (male specific region): vùng đặc hiệu nam giới B Sơ đồ vị trí vùng AZF C Các gen thuộc vùng AZFa, AZFb, AZFc D Các trình tự DNA đặc hiệu cho gen vùng AZF (các STS) Đoạn AZFc thuộc đầu xa nhánh dài nhiễm sắc thể Y, hay phân đoạn 6C đến 6E, kích thước 3,5Mb Đoạn AZFc gồm có nhiều trình tự mã hóa lặp lại gần giống xếp thành trình tự lặp trực tiếp, gián tiếp cụm trình tự [16], [17] Đoạn AZFc đoạn gồm nhiều họ gen, mã hóa 21 họ gen Các gen liên quan đến yếu tố biểu nhân tinh nguyên bào, tinh tử tiền tinh trùng có vai trị quan trọng điều hịa trình chết theo chương trình, trình cần thiết để loại bỏ tinh trùng bất thường 3.1.2 Cơ chế đoạn nhỏ AZF nhiễm sắc thể giới tính Y gây vơ sinh nam giới Mất đoạn nhỏ AZF xuất lỗi tái tổ hợp không tương đồng NST Y Các đoạn nhỏ vùng AZF NST Y xảy vị trí q11.23 thường phân chia theo vị trí AZFa, AZFb, AZFc AZFd Có kiểu đoạn nhỏ sau: đoạn hoàn toàn AZFa thường tương ứng với 0,8Mb (792kb) chứa gen; đoạn hồn tồn AZFb tương ứng với 6,23Mb chứa 32 gen họ gen đặc trưng cho tinh hoàn; đoạn hoàn toàn AZFc tương ứng 3,5Mb chứa họ gen; đoạn nhỏ phối hợp: AZFab, AZFac, AZFabc, AZFbc 3.1.3 Vô sinh nam giới đoạn nhỏ AZF 3.1.3.1 Vô sinh nam giới Theo tổ chức y tế giới (WHO), vô sinh định nghĩa cặp vợ chồng sau năm (nếu người vợ 35 tuổi) tháng (người vợ 35 tuổi) chung sống quan hệ tình dục đặn ÷ lần / tuần không sử dụng biện pháp tránh thai mà người vợ thai Bất kỳ trường hợp rơi vào định nghĩa nên khám sức khỏe sinh sản cho hai vợ chồng 3.1.3.2 Lịch sử nghiên cứu đoạn nhỏ AZF liên quan đến vô sinh nam giới 3.1.3.3 Chẩn đốn đoạn nhỏ AZF gây vơ sinh nam giới * Chẩn đoán đoạn AZF Theo hướng dẫn EAA/EMQN, xét nghiệm chẩn đoán đoạn nhỏ NST Y thực cách khuếch đại vùng chọn NST Y kỹ thuật PCR, vùng chọn trình tự đặc hiệu có kích thước ngắn, từ 200bp đến 500bp, trình tự nhất, cịn gọi STS (Sequencetagged site/ STS) [14] Về nguyên tắc, việc phân tích locus STS khơng đa hình đoạn AZF đủ để xác định xem có STS bị có AZFa, AZFb AZFc hay không Tuy nhiên, việc phân tích hai STS đoạn củng cố độ xác chẩn đốn, đoạn đoạn xác định rõ bao gồm nhiều locus STS Những mồi bao gồm: với AZFa là: sY84, sY86, với AZFb là: sY127, sY134, với AZFc là: sY254, sY255 (cả hai nằm gen DAZ) * Chẩn đoán đoạn nhỏ AZF mở rộng Mở rộng AZFa Việc mở rộng xác định đoạn (hồn tồn/ khơng hoàn toàn) nên thực cách sử dụng đoạn mồi khuếch đại STS sY82 (không đoạn), sY83 (mất đoạn có mặt tùy thuộc vào điểm ngắt) sY1064 (mất đoạn) cho đường biên gần sY1065 sY1182 (mất đoạn), sY88 (không đoạn) cho đường biên xa Marker sY87 không khuyến nghị nằm hai gen AZFa Nếu hai locus STS AZFa (chỉ sY84 sY86) bị đoạn loại trừ lỗi kĩ thuật, đoạn AZFa cần kiểm tra chi tiết việc không đoạn / đoạn hai gen AZFa (DDX3Y USP9Y) biên giới theo đồ cung cấp Kamp cộng (2001) [52] Tuy nhiên, việc xảy Mở rộng AZFb (P5/đầu gần P1) Thực phân tích bổ sung với marker sau: sY105 (không đoạn) sY121 sY1224 (mất đoạn) cho đường biên gần sY143 sY1192 (mất đoạn) sY153 (không đoạn) cho đường biên xa Các marker sY114 sY52 khơng khuyến nghị chúng có nhiều vùng gen Mở rộng AZFc (b2/b4) Hai marker sY254 sY255 đặc trưng cho gen DAZ Sự vắng mặt hai marker cho thấy việc toàn đoạn AZFc, loại bỏ tất DAZ Theo hiểu biết tại, việc hai marker xảy nên coi lỗi kĩ thuật Các mồi khuyến nghị KurodaKawaguchi cộng (2001) việc phân tích sY160 (marker dị nhiễm sắc) cho phép phịng thí nghiệm xác định xem việc đoạn có tương ứng với dạng b2/b4 khơng [24] Mất đoạn gr/gr Đoạn gr/gr thuộc AZFc Việc sàng lọc đoạn gr/gr dựa phương pháp PCR phát có mặt hai marker sY1291 sY1191 [55] chẩn đoán dựa vắng mặt sY1291 diện sY1191 10 PHẦN IV NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 4.1 Đối tượng địa điểm thực dự án 4.1.1 Đối tượng 4.1.1.1 Các mẫu DNA nam giới bị vô sinh I - Tiêu chuẩn lựa chọn: + Nam giới bị vô sinh I (người nam giới chưa làm người phụ nữ có thai dù không sử dụng biện pháp tránh thai nào) + Xét nghiệm tinh dịch đồ có kết thiểu tinh nặng (≤5 triệu tinh trùng/ mL) hay vơ tinh (khơng có tinh trùng tinh dịch) - Tiêu chuẩn loại trừ: + Những bệnh nhân không đầy đủ thông tin bệnh án + Những bệnh nhân có tiền sử bị quai bị, mắc bệnh lý nhiễm trùng, chấn thương tinh hoàn + Nam giới vơ sinh II (đã có mình, sau thời gian năm không làm vợ phụ nữ có thai dù khơng sử dụng biện pháp tránh thai) + Những bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu 4.1.1.2 Các mẫu DNA người nam giới nữ giới không vô sinh làm chứng - Tiêu chuẩn lựa chọn: + Nam giới có tinh tinh dịch đồ bình thường có Khơng bị đoạn nhỏ AZF, SRY ZFY + Nữ giới không bị đoạn ZFX - Tiêu chuẩn loại trừ: + Những bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu 4.1.2 Địa điểm - Trường Đại học Y Hà Nội - Công Ty Cổ phần Công nghệ Việt Á 4.2 Nội dung thực 17 4.2.1 Nội dung 1: Hồn thiện quy trình cơng nghệ sản suất kit chẩn đốn đột biến gen AZF gây vơ sinh nam giới quy mơ phịng thí nghiệm 4.2.1.1 Cơng việc 1: Hồn thiện hỗn hợp (Mastermix) chẩn đốn đoạn AZF a Phương pháp a1 Thiết kế trình trình tự mồi (STS) chẩn đốn đoạn AZF bản: AZF gồm có STS (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) 02 marker đối chứng SRY ZFX/Y a2 Tách dịng tồn thị STS có mặt xét nghiệm AZF vào vector tách dịng a3 Đọc trình tự nucleotid tồn thị có mặt xét nghiệm AZF a4 Sản xuất thử kit AZF bản, kit tương ứng với 20 mẫu, 20 mẫu bệnh nhân, bao gồm mẫu chứng âm mẫu chứng dương a5 So sánh với kit chẩn đốn có IVD, kit sử dụng Devyser v2 (Thụy Điển) phát STS vùng AZF (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) trình tự chứng SRY, ZFX/Y a6 Sử dụng phản ứng PCR đơn mồi để chẩn đoán xác định kit Các trình tự đơn mồi STS (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) 18 STS chứng (SRY, ZFX/Y) tham khảo từ trình tự chuẩn EAA/EMQN Khi có khác biệt kit xác định STS, phản ứng đơn mồi thực với STS b Đối tượng 20 mẫu DNA nam giới vô sinh khơng có tinh trùng (Azoospermia) thiểu tinh nặng (Oligospermia) chẩn đoán đoạn AZF kit Devyser v2 c Phương tiện, dụng cụ, hóa chất: - Phương tiện: Tủ nuôi cấy vô trùng cấp II, máy đo nồng độ DNA Nanodrop, máy PCR, hệ thống điện di agarose bản, máy chụp ảnh agarose gel, hệ thống điện di mao quản tự động Qsep 100 Hệ thống điện di mao quản đặc biệt phù hợp kit AZF xây dựng nội dung đề tài thời gian phân tích nhanh, hoàn toàn tự động, kết trực quan, số lượng mẫuphân tích lớn phát lượng mẫu DNA nhỏ (< 0,1ng/µL) - Dụng cụ: Pipette với thể hút 10, 20, 100, 1000µL; cốc đong với thể tích 10mL, 50 mL, 100 mL, 500 mL, 1000 mL, 2000 mL, 5000 mL; bình đựng hóa chất 100 mL, 200 mL, 500 mL, 1000 mL; bình ni khuẩn; - Hóa chất (bảng 4.1) 19 4.2.1.2 Cơng việc 2: Hồn thiện hỗn hợp (Mastermix) chẩn đốn đoạn AZF mở rộng a Phương pháp a.1 Thiết kế trình tự mồi (STS) chẩn đốn đoạn AZF mở rộng AZF mở rộng bao gồm 11 STS gồm có: sY88, sY121, sY1182, sY105, sY1191, sY1291, sY153, sY160, sY82, sY143, sY83, hai đối chứng SRY, ZFX/Y a.2 Tách dịng tồn 13 thị STS (11 STS mở rộng STS chứng) có mặt xét nghiệm AZF mở rộng vào vector tách dòng a.3 Đọc trình tự nucleotid tồn 13 thị có mặt xét nghiệm AZF mở rộng a.4 Sản xuất thử kit AZF mở rộng, kit tương ứng với 20 mẫu, 20 mẫu bệnh nhân, bao gồm mẫu chứng âm mẫu chứng dương a.5 So sánh với kit chẩn đốn có IVD, kit sử dụng Devyser Extension (Thụy Điển) chẩn đoán 11 vị trí STS vùng AZF mở rộng (sY160, gr/gr (sY1191, sY1192), sY1291, sY88, sY1065, sY82, sY83, sY153, sY121, sY105) trình tự chứng SRY, ZFX/Y a6 Sử dụng phản ứng PCR đơn mồi để chẩn đoán xác định kit Các trình tự đơn mồi bao gồm 11 STS mở rộng kit AZPA (sY88, sY121, 20