NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA GLYCEROL THÀNH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) NHỜ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN HUYỆN YÊN HƯNG, TỈNH QUẢNG NINH

Trong một số trường hợp, thực vật tích lũy hàm lượng PHAcao từ 10-40% khối lượng tế bào khô nhưng điều này lại gây ảnh hưởng xấu tới sựsinh trưởng và phát triển của chúng và hiện tại các

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến TS Đoàn Văn Thược – giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội – người đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học,Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới chị Dung, chị Bình, các anh chị cao học, bạn Vóc, bạn Ninh, các bạn, các em sinh viên đang làm thí nghiệm tại bộ môn và người thân, những người

đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều trong thời gian vừa qua.

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Người viết

Vũ Hồng Vân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Polyhydroxyalkanoate (PHA) 3

1.1.1 Sinh tổng hợp PHA trong tế bào vi khuẩn 3

1.1.2 Phân loại và tích chất của PHA 5

1.2 Tình hình sản xuất, ứng dụng PHA trên thế giới và ở Việt Nam 8

1.3 Glycerol - một nguồn carbon có nhiều triển vọng cho ngành công nghệ vi sinh 10

1.3.1 Tình hình sản xuất glycerol trên thế giới và ở Việt Nam 10

1.3.2 Ứng dụng của glycerol 11

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng 16

2.1.2 Hóa chất 16

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 17

2.2.2 Phương pháp phân lập 17

2.2.3 Phương pháp giữ giống vi khuẩn 17

2.2.4 Phương pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn 18

2.2.5 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng thuốc nhuộm Nile blue A để phát hiện các hạt dự trữ 18

2.2.6 Phương pháp lên men thu sinh khối khô của tế bào 18

2.2.7 Phương pháp sắc ký khí, phân tích hàm lượng PHA trong tế bào vi khuẩn 18

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển

chọn 19

2.2.9 Phương pháp lên men trong nồi lên men 20

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn 21

3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào 23

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối tới sự sinh trưởng, phát triển của các chủng được tuyển chọn 24

3.4 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng tuyển chọn 25

3.5 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ tới sự sinh trưởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng tuyển chọn 26

3.6 Động thái sinh trưởng và hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào của chủng 75 28

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

CDW (cell dry weight) : Khối lượng tế bào khô

mcl (medium-chain-length) : Mạch trung bình

OD (Optical Density) : Mật độ quang

PHB (hay P(3HB)) : Poly(3-hydroxybutyrate)

MỞ ĐẦU

Dầu mỏ là một trong những nguồn nguyên liệu quan trọng nhất của xã hộihiện đại, là nhiên liệu của đa số các phương tiện giao thông vận tải Hơn nữa, dầu

cũng được sử dụng để sản xuất các chất dẻo (plastic) và nhiều sản phẩm khác.Tuy

nhiên, dầu mỏ là nguồn nguyên liệu không có khả năng tái tạo nên chắc chắn sẽ cạnkiệt trong tương lai, không những vậy những sản phẩm từ dầu mỏ sau khi sử dụngcũng gây ra ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Ví dụ các chất dẻo có nguồn gốc từdầu mỏ đang là mối nguy hại tiềm ẩn tới sức khỏe con người cũng như môi trườngsinh thái vì chỉ có những tác động về cơ học và nhiệt mới có thể phá hủy nó nhưng lạitạo ra nhiều chất độc hại hơn và đòi hỏi những chi phí rất lớn, vượt qua cả giá thành tạo

ra chúng Phát triển và sử dụng các polymer có khả năng phân hủy sinh học thay thếcho polymer hóa dầu là một hướng đi có nhiều triển vọng mà thế giới nói chung vàViệt Nam nói riêng đang cố gắng từng bước thực hiện

Trong số các polymer sinh học hiện biết thì polyhydroxyalkanoate (PHA) là loạipolymer đang được quan tâm nghiên cứu và sản xuất nhiều nhất PHA được tích lũytrong các tế bào vi sinh vật đóng vai trò là nguồn tích lũy cacbon và năng lượng Sựtích lũy PHA xảy ra khi môi trường sống của vi sinh vật dư thừa nguồn cacbon vàthiếu một nguyên tố dinh dưỡng nào đó như O, N, P, S hay Mg [28, 29] Có khoảnghơn 150 loại PHA khác nhau, mỗi loại có những tính chất đặc trưng riêng phù hợpvới các hướng ứng dụng khác nhau trong nông nghiệp, công nghiệp và y tế, Trong

đó có 2 loại PHA là poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) và poly hydroxyvalerate) (PHBV) đang được sản xuất và ứng dụng trên quy mô công nghiệp[28, 29]

Điểm hạn chế ảnh hưởng đến tiềm năng ứng dụng của PHA là giá thành củaPHA đắt hơn so với các loại plastic có nguồn gốc từ mỏ đang sử dụng hiện nay Rấtnhiều yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến giá cả của PHA, ví dụ như: hiệu suất sảnxuất PHA, hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào, hiệu suất chuyển hóa nguồncacbon thành PHA, giá của các nguyên liệu dùng trong lên men, và giá của quytrình tách chiết, tinh sạch PHA [14] Chính vì vậy việc lựa chọn chủng dùng chosản xuất PHA trên qui mô công nghiệp cần phải chú ý đến nhiều yếu tố Ví dụ như

khả năng sử dụng các nguồn cacbon rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng và tốc độ tổng hợpPHA, hàm lượng PHA có khả năng tích lũy trong tế bào [14]

Sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học trong đó có diesel sinh học nhằm thay thếdầu mỏ trong lĩnh vực nhiên liệu đang là một định hướng phát triển của các nướctrên thế giới Quá trình sản xuất diesel sinh học sẽ tạo ra một lượng glycerol khá lớn(khoảng 10% (w/w)) [15] Cùng với sự phát triển của ngành sản xuất diesel sinhhọc thì lượng glycerol tạo ra ngày càng nhiều Làm thế nào để sử dụng hiệu quảnguồn glycerol này là một câu hỏi mà nhiều nhà khoa học đang đi tìm câu trả lời.Một trong những hướng nghiên cứu hiện nay là chuyển hóa glycerol thànhpolyhydroxyalkanoate

Với những lý do trên,chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển hóa glycerol thành polyhydroxyalkanoate (PHA) nhờ một số chủng vi khuẩn phân lập từ đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh”

Mục tiêu

Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa hiệu quảglycerol thành PHA

Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHA trên môitrường có nguồn carbon là glycerol

2 Nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn, xácđịnh loại PHA tích lũy trong chủng được tuyển chọn

3 Nghiên cứu khả năng chuyển hóa glycerol thành PHA ở các điều kiệnnuôi cấy và thành phần dinh dưỡng khác nhau

CHƯƠNG I TỔNG QUAN1.1 Polyhydroxyalkanoate (PHA)

Polyhydroxyalkanoate (PHA) là polyester của các hydroxyalkanoate (HA)(hình 1.1) tích lũy trong tế bào của nhiều vi sinh vật trong điều kiện môi trườngsống dư thừa nguồn cacbon và thiếu hụt một vài nguyên tố dinh dưỡng thiết yếunhư là O, N, P, S, Mg,… PHA là polymer của khoảng 103 đến 104 monomer, chúngtồn tại dưới dạng các hạt riêng biệt trong tế bào, có khoảng từ 5 đến 13 hạt trong một

tế bào, mỗi hạt có kích thước khoảng từ 0.2 đến 0.5 µm [18, 19, 26]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của polyhydroxyalkanoates R có thể là H hoặc các gốc alkyl có số lượng C dao động từ 1-13, x = 1-4, và n = 100-30000 phân tử [28] Bảng 1.1 Một số loại PHA thường được vi khuẩn tổng hợp [30]

1.1.1 Sinh tổng hợp PHA trong tế bào vi khuẩn

PHA được tổng hợp bởi rất nhiều cơ thể sống, trong đó vi khuẩn và thực vật làhai đối tượng đáng quan tâm nhất Tế bào thực vật có thể tổng hợp PHA từ nguồncarbon là CO2 tuy nhiên hàm lượng PHA tích lũy được là rất thấp (nhỏ hơn 10%khối lượng tế bào khô) Trong một số trường hợp, thực vật tích lũy hàm lượng PHAcao (từ 10-40% khối lượng tế bào khô) nhưng điều này lại gây ảnh hưởng xấu tới sựsinh trưởng và phát triển của chúng và hiện tại các nhà khoa học vẫn chưa tìm ra

biện pháp nào để khắc phục nhược điểm này Trong tế bào vi khuẩn thì PHA có thểtích lũy tới 90% khối lượng khô của tế bào [30].

Tích lũy PHA là cách thức tự nhiên mà vi khuẩn sử dụng để dự trữ carbon vànăng lượng khi hàm lượng các nguyên tố dinh dưỡng trong môi trường sống mấtcân bằng Việc polymer hóa các phân tử chất tan thành các hạt PHA không tankhông làm thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào, ngược lại điều này giúp ngăn cản

sự thất thoát của các hợp chất có giá trị Chúng sẽ được dự trữ để duy trì sự tồn tạicủa tế bào [30]

Loại PHA đầu tiên được các nhà khoa học phát hiện và cũng là loại PHA đượcnghiên cứu chi tiết nhất cho đến thời điểm hiện tại chính là poly(3-hydroxybutyrate)(PHB) [30] Những nghiên cứu trên chủng Cupriavidus necator cho thấy quá trình

sinh tổng hợp PHB chịu sự chi phối của 3 gen, được điều hòa hoạt động bởi cùng

một operon có tên là operon phbCAB 3 gen này mã hóa cho 3 enzyme thực hiện 3

phản ứng tổng hợp kế tiếp nhau (hình 1.3) Phản ứng đầu tiên là biến đổi hai phân

tử acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) thành phân tử acetoacetyl-CoA nhờ sự xúc tác

của β-ketoacyl-CoA thiolase (mã hóa bởi gen phbA) Tiếp theo là phản ứng khử

acetoacetyl-CoA thành (R)-3-hydroxybutyryl-CoA nhờ sự xúc tác của enzyme

NADP-dependent acetoacetyl-CoA reductase (mã hóa bởi gen phbB) Cuối cùng các phân tử

(R)-3-hydroxybutyryl - CoA được polymer hóa thành poly(3hydroxybutyrate) (PHB)

nhờ sự xác tác của PHB polymerase (mã hóa bởi gen phbC) [28] Trong quá trình sinhtrưởng của vi khuẩn, enzyme β-ketothiolase bị ức chế bởi hàm lượng Coenzyme A tự

do giải phóng từ chu trình Krebs, nhưng khi sự tiếp nhận acetyl-CoA vào chu trìnhKrebs bị giới hạn (xảy ra khi môi trường sống bị hạn chế một vài nguyên tố dinhdưỡng thiết yếu, nguồn carbon vẫn dồi dào) thì lượng acetyl-CoA dư thừa sẽ đượcchuyển vào con đường sinh tổng hợp PHB [30]

Hình 1.3: Ba bước của con đường sinh tổng hợp PHB Một promoter nằm trước

gen phbC đóng vai trò khởi động quá trình sinh tổng hợp [28]

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc hạt PHA [28]

Trong tế bào, PHA tích lũy dưới dạng các thể ẩn nhập (hạt dự trữ) hình cầu,không tan trong nước, chứa các chuỗi polyester, thường được gọi là hạt PHA HạtPHA được bao ngoài bởi một lớp màng có bản chất là phospholipid và được

“khảm” bởi các protein bám màng và xuyên màng trong đó bao gồm enzyme PHAsynthease (PhaC), protein phasing (PhaP), enzyme PHA depolymerase (PhaZ),protein điều hòa (PhaR) và một số protein khác chưa rõ chức năng [28] (hình 1.4).Kích thước của hạt PHA tăng lên khi enzyme PHA synthase không ngừng tiếp xúc

để liên kết các monomer có trong tế bào chất, làm mạch polyester dài ra Khi tíchlũy PHA đạt đến cực đại, các hạt PHA sẽ choán hết thể tích bên trong tế bào [28]

Ngoài con đường tổng hợp trong các cơ thể sống, PHA cũng có thể đượctổng hợp bằng con đường hóa học Con đường sinh tổng hợp tạo ra các polymer cókhối lượng phân tử lớn hơn so với polymer tạo ra từ con đường tổng hợp hóa học,tuy nhiên trong con đường tổng hợp sinh học chúng ta khó có thể điều khiển cácmonomer cấu trúc tham gia kiến tạo PHA vì điều này được quy định bởi loại PHAsynthase đặc trưng của tế bào [13]

1.1.2 Phân loại và tích chất của PHA

PHA có thể là polymer của một loại monomer hoặc của hai hoặc nhiều loạimonomer PHA được chia thành hai nhóm phụ thuộc vào số lượng các phân tửcarbon có trong các đơn phân monomer: những PHA dạng mạch ngắn (scl-PHAs)

có khoảng 3-5 phân tử carbon trong một monomer, những PHA dạng mạch trung

bình (mcl-PHAs) có khoảng 6-16 phân tử các bon trong một monomer PHA mạchngắn có tính chất giống với các loại plastic thông thường (giòn và cứng), trong khi

đó các PHA có mạch trung bình mềm dẻo, có nhiệt độ sôi và hàm lượng tinh thểthấp, có khả năng đàn hồi [22] Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp PHA cóchứa cả hai loại mạch ngắn và mạch trung bình [22]

PHA có thể được trùng hợp từ một loại monomer hoặc được đồng trùng hợp

từ hai hay nhiều loại monomer Dựa theo cách trùng hợp có hai loại polymer làhomopolymer (đồng polymer) và heteropolymer (dị polymer) hay polymer hỗn hợp(co-polymer) Homopolymer điển hình là polyhydroxybutyrate (PHB) được tổng hợp

từ một loại monomer duy nhất là hydroxybutyrate Trong điều kiện môi trường thiếuhụt các yếu tố dinh dưỡng và dư thừa carbon, tế bào vi khuẩn thường chuyển hóanguồn carbon thành monomer 3-hydroxybutyrate (3HB) và tổng hợp nên PHB [15]

PHA được trùng hợp ngẫu nhiên từ hai hay nhiều loại monomer khác nhauđược gọi là co-polymer (polymer đồng trùng hợp) hay heteropolymer (dị polymer).Mặc dù homopolymer PHB là loại được tổng hợp phổ biến bởi nhiều chủng vikhuẩn nhưng những hạn chế trong tính chất vật lý của nó khiến các nhà khoa họcquan tâm tới nhóm các co-polymer hơn PHB trở nên cứng và giòn sau khi táchchiết từ tế bào vi khuẩn và bảo quản trong điều kiện thường chỉ sau một vài ngày,hơn nữa nhiệt độ nóng chảy của PHB rất gần với nhiệt độ phân hủy (xấp xỉ 185oC)nên quá trình chế tạo sản phẩm từ PHB gặp nhiều khó khăn Co-polymer có thểkhắc phục triệt để những nhược điểm này Khả năng chịu nhiệt cũng như những tínhchất vật lý đa dạng của các loại co-polymer khiến chúng là đối tượng được các nhàkhoa học quan tâm nghiên cứu và sản xuất

Sau khi được tách chiết và tinh sạch, các PHA thể hiện một số tính chất đặctrưng như bền nhiệt, không dẫn điện, cứng hoặc mềm dẻo (tùy loại PHA), khôngthấm nước, không cho không khí đi qua…[13] Khối lượng phân tử của PHA dao

động trong khoảng từ 2x105 đến 3x106 Dalton Các polymer sinh học này có tínhchất cơ bản giống với polymer thông thường như polyethylene (PE) haypolypropylene (PP) (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Bảng so sánh các đặc tính vật lý của nhiều loại PHA và polypropylene [28]

lỏng ( oC ) (1)

Tinh thể hóa (%) (2)

Độ đàn hồi (MPa) (3)

Bên cạnh các tính chất nêu trên, một tính chất đặc trưng của PHA là khả năngphân hủy sinh học Các vi sinh vật trong tự nhiên có thể phân hủy PHA bằng cách sửdụng các enzyme PHA hydrolase và PHA depolymerase Hoạt động của các enzymenày có thể rất khác nhau, phụ thuộc vào thành phần cấu tạo của polymer và điều kiệnmôi trường Một mẫu PHB có thể phân hủy hoàn toàn sau vài tháng trong điều kiệnyếm khí của bể chứa nước thải hoặc sau vài năm trong mồi trường nước biển Tácđộng của tia UV trong ánh sáng mặt trời cũng có tác dụng đẩy nhanh quá trình phânhủy Một điều đặc biệt nữa là PHA có tính tương thích sinh học, nghĩa là chúngkhông gây tác động xấu nào khi được đưa vào cơ thể sống Trong mô động vật có vú,PHA phân hủy rất chậm, sau 6 tháng cấy ghép vào cơ thể chuột thí nghiệm, lượngPHA hao mòn do phân hủy là rất nhỏ (nhỏ hơn 1.6% khối lượng) [30]

1.2 Tình hình sản xuất, ứng dụng PHA trên thế giới và ở Việt Nam

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều công ty tham gia sản xuất các sản phẩm

có nguồn gốc PHA, thân thiện với môi trường Ví dụ một số công ty lớn như:Metabolic (Mỹ) sản xuất khoảng 50 000 tấn/năm, Meredian (Mỹ) sản xuất 10 000tấn/năm, như Bio-On (Ý) sản xuất 10 000 tấn/năm, [12] Các sản phẩm từ PHA

rất đa dạng, từ những sản phẩm thông thường như túi đựng hàng, cốc nhựa, bao bì,chậu cây, tã lót trẻ em đến các sản phẩm có độ bền cao như vỏ máy tính, vỏ đựnglốp ô tô dự trữ, Đặc biệt hơn, do có tính tương thích sinh học cao nên không gâyphản ứng loại thải khi được cấy ghép vào cơ thể, PHA có những ứng dụng quantrọng trong ngành y tế, ví dụ các sản phẩm như chỉ phẫu thuật, đĩa xương, ống ghépmạch, van tim đều có thể làm từ PHA [6] Một trong những ứng dụng đặc biệt củaPHBHV trong ngành nông nghiệp là sự giải phóng một cách có kiểm soát của thuốcdiệt côn trùng Thuốc diệt côn trùng được tổ hợp với các hạt PHBHV và được gieocùng với hạt cây trồng Thuốc diệt côn trùng có thể được giải phóng với một tỷ lệnhất định phụ thuộc vào mức độ hoạt động của dịch hại tính từ khi vi khuẩn phá vỡchuỗi polymer bị tác động bởi điều kiện môi trường tương tự như điều kiện môitrường đã tác động lên các dịch hại sống trong đất [22],[30]

Những ưu điểm của polymer sinh học so với các loại nhựa thông thườngtrong việc hạn chế ô nhiễm môi trường là không thể phủ nhận, tuy nhiên do giáthành hiện tại của PHA đắt hơn khá nhiều so với giá của plastic có nguồn gốc từdầu mỏ đang sử dụng hiện nay nên việc ứng dụng rộng rãi sản phẩm từ PHA vàođời sống vấp phải nhiều khó khăn Các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu nhằmgiảm giá thành của PHA, trong đó các hướng nghiên cứu chủ yếu là: tìm ra cácchủng vi sinh vật mới có khả năng tích lũy PHA mạnh, tạo ra sản lượng PHA lớnkhi lên men trên các nguồn cơ chất rẻ tiền hoặc tái sử dụng các nguồn phế, phụphẩm công nghiệp và nông nghiệp, tối ưu hóa quy trình sản xuất và quy trình táchchiết, tinh sạch để đạt được hiệu suất cao hay tạo ra các dòng sinh vật chuyển gen

có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt và tích lũy PHA với hàm lượng cao [Error: Reference source not found]

Việt Nam cũng là một trong số các quốc gia trên thế giới đang phải đối mặtvới vấn nạn ô nhiễm môi trường do việc sử dụng tràn lan các sản phẩm nhựa khôngphân hủy, đặc biệt là túi nilon và các sản phẩm đồ gia dụng Theo kết quả điều tra

khảo sát của Cục kiểm soát ô nhiễm năm 2010 đối với 263 người tại 5 tỉnh/thànhphố đại diện cho 3 vùng miền của Việt Nam cho thấy: gần 50% số hộ sử dụng 8 bao

bì nilon trở lên trong một ngày, trong đó 35,1% số hộ sử dụng trên 10 bao bì/ngày.Trung bình mỗi hộ sử dụng 223 bao bì/tháng (khoảng 7,5 bao bì/hộ/ngày), tươngđương 1kg bao bì nilon/hộ/tháng, trong đó 98,7% là bao bì nilon không tự phân hủy[Error: Reference source not found] Ở Việt Nam hiện nay polymer sinh học vẫnđang là hướng nghiên cứu còn khá mới mẻ, bước đầu đã có một số công trìnhnghiên cứu sản xuất và ứng dụng bao bì tự phân hủy vào trong sản xuất nôngnghiệp và đời sống hàng ngày

Viện hóa học Công nghiệp trực thuộc viện Khoa học và Công nghệ ViệtNam đã đưa ra thị trường sản phẩm polymer có khả năng tự phân hủy Đây là sảnphẩm có sự kết hợp của nhựa polyetylen tỉ trọng thấp với một số loại tinh bột và hóachất Sản phẩm gồm ba dạng: Màng phủ nông nghiệp, bao bì bọc bầu ươm cây vàtúi nilon phục vụ nhu cầu người tiêu dùng Viện hóa học Việt Nam hiện nay cũngđang tiến hành một số nghiên cứu sản xuất polymer sinh học có nguồn gốc từ tinh bột vàmột số polymer khác như polylactic acid, polycaprolacton, polyethylenglycol,polyglycolic acid Bộ môn Công nghệ hóa, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ ChíMinh đã nghiên cứu sản xuất polymer sinh học từ sự phối trộn tinh bột sắn và glycerol

Bộ môn Công nghệ sinh học - vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

đã tiến hành đề tài “ phân lập và nghiên cứu vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate từ rừngngập mặn miền Bắc Việt Nam” do Qũy Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia(Nafosted) tài trợ trong giai đoạn 2010-2012, hàng trăm chủng vi khuẩn có khả năngtích lũy PHA đã được phân lập và tuyển chọn Phần lớn các chủng vi khuẩn này có khảnăng tích lũy poly(3-hydroxyalkanoate) (PHB), một số chủng vi khuẩn này có khả năngtổng hợp co-polymer poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) [7] Haidạng polymer PHB và PHBV chính là 2 dạng PHA được sản xuất và sử dụng phổ biếnnhất trên thế giới hiện nay

1.3 Glycerol - một nguồn carbon có nhiều triển vọng cho ngành công nghệ vi sinh

Glycerol thường được gọi là glycerine, là một loại rượu trihydric [C3H5

(OH3)], là một chất không màu, không mùi, nhớt Glycerol có ba nhóm hydroxyl

nên có khả năng hòa tan trong nước và hút ẩm tự nhiên Glycerol có vị ngọt vàthường được coi là không độc hại Glycerol là một sản phẩm phụ của quá trình sảnxuất dầu diesel sinh học

so với mục tiêu đề ra và tăng với tốc độ chậm hơn Lý do chính là chi phí sản xuấtdầu diesel tương đối cao, tái sử dụng các sản phẩm phụ như glycerol trong quá trìnhnày đang là một trong những lựa chọn đầy hứa hẹn cho việc giảm chi phí sản xuất.Sản xuất dầu diesel sinh học sẽ tạo ra khoảng 10% (w/w) glycerol Nói cách khác,mỗi gallon (tương đương ~ 4,4L) dầu diesel sinh học sản xuất tạo ra khoảng 1,05pound (~0,476 kg) glycerol Điều này cho thấy mỗi năm nhà máy sẽ tạo ra 30 triệugallon (~ 132 triệu L) dầu diesel sinh học khoảng 11.500 tấn glycerol tinh khiết99,9% [15]

Hiện nay, ở nước ta có rất nhiều cơ sở sản xuất sử dụng dầu mỡ động thựcvật làm nhiên liệu sinh học (biodiesel), ước tính lên tới 60.000 tấn/năm trong vàinăm tới Trong đó, sản phẩm phụ của quá trình này là glycerol thô, trong vài nămtới sản lượng glycerol thô ở nước ta đạt khoảng 6.000 tấn Nhưng các cơ sở sản xuấtnhiên liệu sinh học lại chưa có phương án sử dụng nguồn sản phẩm phụ này ngoàiviệc làm chất đốt hoặc bán với giá 4.000đ/lít Điều này sẽ rất lãng phí bởi hiện tại,giá glycerol tinh chế 98% dao động trong khoảng 35.000-40.000đ/lít và nước ta

phải nhập khẩu hoàn toàn từ Malaysia Việc thu hồi và tinh chế glycerol thu được từquá trình sản xuất biodiesel mang lại hiệu quả kinh tế rất cao cho các nhà máy sảnxuất biodiesel Ngoài ra, việc tận thu và tinh chế glycerol còn góp phần giảm ônhiễm môi trường do việc thải glycerol thô hoặc do khói thải của quá trình sử dụngglycerol thô làm chất đốt gây ra Sản phẩm glycerol sau tinh chế sẽ được sử dụngcho các quá trình chế biến tiếp theo để cho ra các sản phẩm có giá trị cao hơn nữa.Chẳng hạn, glycerol có thể chuyển hóa thành các sản phẩm ứng dụng như chất bôitrơn, dầu nhờn, chất nhũ hóa, chất hoạt động bề mặt Glycerol có thể chuyển hóathành methanol - là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các quá trình tổng hợp hóadầu [34].

Sự tăng trưởng nhanh chóng của nền công nghiệp chế biến dầu diesel sinhhọc đã tạo nên sự “ thừa ” chất glycerol Nền công nghiệp đang phải đương đầu vớimột sự khủng hoảng đe dọa đối với chất thải glycerol Các nhà khoa học trên toàncầu đang chạy đua nhằm tìm ra các phương pháp biến chất thải glycerol thành lợinhuận Ngoài việc hướng tới quy trình sản xuất hóa chất truyền thống - tìm cách gâyxúc tác các phản ứng để biến glycerol thành những chất hóa học khác thì các nhàkhoa học cũng đang tập trung vào sự chuyển đổi sinh học Trong sự chuyển đổi sinhhọc, các nhà nghiên cứu tạo ra vi sinh vật có thể sử dụng glycerol để chuyển hóa

thành PHA - một loại nhựa sinh học có nhiều tiềm năng thay thế cho các loại nhựa

hóa dầu đang sử dụng hiện nay

1.3.2 Ứng dụng của glycerol

Glycerol được biết đến với rất nhiều ứng dụng trong đa dạng các lĩnh vựccủa đời sống thường ngày

Trong công nghiệp thực phẩm: glycerol được sử dụng như một chất tạo ẩm,

chất tạo ngọt, chất bảo quản Như một chất thay thế cho đường, glycerol chứakhoảng 27 calories trong một thìa cafe (đường chứa 20 calories) và có vị ngọt gầngiống đường sucrose, tuy nhiên nó lại không làm tăng lượng đường trong máu vàcũng không gây sâu răng Glycerol có hàm lượng calo tương đương đường ănnhưng chỉ số đường huyết thấp và có cách trao đổi chất khác trong cơ thể nên đượcnhững người ăn kiêng chấp nhận thay cho đường ăn Sử dụng glycerol như mộtthành phần thức ăn cho động vật đã được biết đến từ những năm 1970 Glyxerol

được bổ sung trong khẩu phần ăn của động vật không nhai lại có tỷ lệ hấp thụ cao.Sau khi hấp thụ, nó có thể được chuyển đổi thành glucose sản xuất năng lượngtrong gan động vật bằng các enzyme glycerol kinase Các phương pháp điều chỉnhchế độ ăn uống có bổ sung glycerol không có ảnh hưởng đáng kể về chất lượng thịt.Khi glyxerol thô đã được thêm vào khẩu phần ăn của heo con cai sữa, tại mức 10%hiệu suất thức ăn được nâng cao Glyxerol thêm vào lên đến 15% chất khô trong chế

độ ăn của con cừu có thể cải thiện hiệu suất vỗ béo, đặc biệt là trong 14 ngày đầutiên Glycerol tinh khiết được bổ sung lên tới 15% trong khẩu phần chất khô của bòđang cho sữa không có tác hại về lượng thức ăn, khả năng sản xuất sữa và năng suấtcủa chúng [15]

Glycerol còn được sử dụng trong y tế, dược phẩm và chăm sóc cá nhân: chủ

yếu được dùng như một chất làm trơn và chất giữ ẩm Nó cũng được dùng trongchất miễn dịch dị ứng, si rô trị ho, kem đánh răng, nước súc miệng, các sản phẩmchăm sóc da, kem cạo râu, các sản phẩm dưỡng tóc, xà phòng Glycerol tinh khiếthoặc gần như tinh khiết là một phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh vẩy nến,bỏng, vết cắn, vết cắt, phát ban và cả những cục chai

Chất chống đông: Giống ethylene glycol và propylene glycol, glycerol hình

thành liên kết hydro mạnh đối với các phân tử nước, làm giảm đi liên kết hydro giữacác phân tử nước với nhau Nhiệt độ đông đặc thấp nhất có thể đạt được vào khoảng-37.8oC tương ứng với 60-70% glycerol trong nước

Hóa chất trung gian: Glycerol được sử dụng để sản xuất nitroglycerine hoặc

glycerol trinitrate (GTN) là một thành phần thiết yếu của thuốc súng không khói vàmột số loại thuốc nổ khác GNT còn được dùng trong một số loại thuốc chống tứcngực

Sản xuất PHA: Glycerol có thể thay thế carbohydrate truyền thống trong sản

xuất PHA, chẳng hạn như sucrose, glucose và tinh bột Đã có rất nhiều nghiên cứu

về việc sử dụng glycerol như một nguồn carbon cho sự tích lũy PHA của vi khuẩn,hướng tới sản xuất polymer tự phân hủy thay thế cho polymer hóa dầu hiện nay Ví

dụ với Paracoccus denitrificans và Cupriavidus Necator JMP 134, cho thấy các

polyme thu được giống với polymer thu được khi sử dụng nguồn carbon là glucose

Zobellella denitrificans MW1 có thể sử dụng glyxerol cho sự phát triển và sản xuất

PHB với hiệu suất cao, đặc biệt là khi có mặt của NaCl Do đó, nó đã được pháttriển sản xuất trên quy mô lớn để tạo ra PHB từ glyxerol Gần đây, báo cáo cho thấy

Pseudomonas oleovorans NRRL B-14682 cũng có thể được sử dụng cho sản xuất PHB từ glycerol [15] Đầu những năm 90, Pseudomonas putida KT2442 đã được sử

dụng để sản xuất mcl-PHA từ glycerol [24] Polymer này có đặc điểm tương tự nhưcác polymer được sản xuất bởi cùng một chủng nhưng với nguồn carbon là glucose

và fructose Hai chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men sản xuất PHB là

Methylobacterium rhodesianum và C.necator có thể tích lũy PHB lần lượt lên đến

50% và 65% khối lượng khô của tế bào trong 45h [10] Sujatha và Shenbagarathai

(2006) đã sử dụng chủng E.Coli có gen phaC1 từ Pseudomonas sp LDC-5 Chủng

tái tổ hợp này đã tích lũy được 3,4 g PHAs/L trên môi trường có nguồn carbon làglycerol và pepton có nguồn gốc từ cá với hàm lượng trung bình [27] Cavalherio et

al (2009) đã công bố một kết quả đầy hứa hẹn: C.Necator DMS 545 đã sinh trưởng

lên tới 68,8g CDW/L với môi trường sử dụng nguồn carbon là glycerol [11] Các tếbào có khả năng tích lũy PHB tới 38% khối lượng khô của tế bào , với năng suất0,84 g/L/h Khi hạn chế lượng nitơ,hiệu suất chuyển hóa glycerol thành PHB có thểđược tăng lên đến 1,1 g / L/h với 50% PHB được tích lũy trong các tế bào khô [11]

Con đường sinh tổng hợp PHA từ các nguồn carbon là glycerol có thể đượctóm tắt như trong hình 1.2

Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp PHB ở vi khuẩn khi sử dụng nguồn