Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc việt nam

6 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ NĨC ĐỘC VIỆT NAM Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 62 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Khuất Hữu Thanh GS TS Phạm Quốc Long Hà Nội – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Những số liệu kết nghiên cứu Luận án trung thực chưa tác giả khác công bố Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hiền i LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu, học tập hồn thành Luận án này, tơi nhận giúp đỡ, bảo tận tình hai người thầy đáng kính PGS.TS Khuất Hữu Thanh Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS Phạm Quốc Long - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn tới hai thầy Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN giảng dạy, bảo tạo điều kiện giúp đỡ trau dồi kiến thức chuyên môn sống Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Shigeru SATO - Đại học Kitasato, Nhật Bản truyền đạt cho kiến thức quy trình cơng nghệ tách chiết, tinh độc tố Tetrodotoxin; TS Đào Thị Lương, TS Trịnh Thành Trung -Viện Vi sinh Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN; ThS Đinh Thu Thủy – Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện HLKHVN; KS Hoàng Thị Oanh, ThS Nguyễn Hữu Hoàng, ThS Bùi Trọng Tâm, ThS Phạm Thị Điềm -Viện Nghiên cứu Hải sản thực số nội dung Luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản, Lãnh đạo Phòng, anh chị em Phịng Nghiên cứu Cơng nghệ Sau thu hoạch, Công nghệ Sinh học Biển tạo điều kiện giúp đỡ thời gian vật chất để tơi hồn thành Luận án Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính u biết ơn tới gia đình, bố mẹ, chồng, anh chị em, bạn bè thực động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hiền ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nội dung viết tắt ADN Acid Deoxyribo Nucleic Anhy-TTX Anhydro Tetrodotoxin (dẫn xuất anhydro TTX) ARN Acid Ribo Nucleic CBS Chất bổ sung C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng dATP dCTP dGTP dNTP hưởng từ hạt nhân cacbon 13) Deoxyadenosine triphosphate Deoxycytidine triphosphate Deoxyguanosine triphosphate Deoxyribonucleotide triphosphate 10 dTTP Deoxythymidine triphosphate 11 Epi-TTX Epi-Tetrodotoxin (dẫn xuất epi TTX) 12 FLD Fluorescence Detector- Detecto huỳnh quang 13 FISH Flourescent in situ hybridization (Kỹ thuật lai phân tử đánh 14 1H-1H COSY dấu huỳnh quang) 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Phổ học tương quan vị trí H) Hetero nuclear Multiple Bond Connectivity (Tương tác 15 HMBC 16 H-NMR 17 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) 18 IgM Immunoglobulin M 19 KKT Kháng kháng thể 20 KN Kháng nguyên 21 KT Kháng thể 22 LB Luria Broth 23 LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khối phổ) hidro với cacbon bên cạnh) Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) iii 24 LC-MS/MS Liquid chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry (Sắc ký khối phổ/khối phổ) 25 MB Marine Broth 26 MSD Mass Spectrum Detector (Detecto phổ khối lượng) 27 MU Mouse unit (Đơn vị chuột) 28 NOESY Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy (Phổ trao đổi hiệu ứng Overhauser hạt nhân) 29 µCP Micro contact printing 30 µFN Micro fluidics networks 31 µM Micro Mol 32 OD Optical Density (Mật độ quang) 33 ORI Ocean Research Institute medium 34 PCR Polymerase Chain Reaction 35 TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose 36 TTX Tetrodotoxin 37 TTXs Tetrodotoxin dẫn xuất 38 TTX-s Na+ Kênh điện Na+ nhạy cảm TTX 39 TTX-r Na+ Kênh điện Na+ kháng TTX iv MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TETRODOTOXIN 1.1.1 Cơng thức phân tử, cấu tạo hóa học TTX 1.1.2 Đặc tính TTX 1.1.3 Cơ chế gây độc TTX 1.1.4 Ứng dụng TTX 1.2 NGUỒN THU NHẬN TTX 1.2.1 TTX từ động vật biển 1.2.2 TTX từ vi sinh vật biển 15 1.3 CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ CÁ NÓC 20 1.3.1 Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học Error! Bookmark not defined 1.3.2 Tách chiết tinh TTX từ cá Error! Bookmark not defined 1.4 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TTX TỪ VI SINH VẬT 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 26 2.1.1 Đối tượng 26 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 26 2.1.3 Hóa chất mơi trường nghiên cứu 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Phương pháp xác định độc tố lồi cá độc HPLC 28 2.2.2 Phương pháp phân tích, xác định tính chất TTX từ cá Việt Nam làm tiền đề kiểm chứng tính chất TTX từ vi sinh vật 28 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh TTX 29 2.2.4 Phương pháp phân loại chủng vi khuẩn có khả sản sinh TTX 30 2.2.5 Nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy vi khuẩn sản sinh TTX 33 2.2.6 Tối ưu hóa điều kiện ni vi khuẩn sinh TTX theo đường dốc Box-Wilson 34 2.2.7 Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết tinh TTX từ dịch nuôi vi khuẩn 36 2.2.8 Phương pháp phân tích xác định độc tính TTX từ vi sinh vật 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐỘC TỐ TTX CỦA CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 41 v 3.1.1 Lựa chọn mẫu vật để phân lập vi sinh vật từ cá độc 41 3.1.2 Nghiên cứu xác định tính chất TTX từ mẫu cá độc Việt Nam 43 3.2 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 48 3.2.1 Phân lập lựa chọn chủng vi sinh vật từ lồi cá độc 48 3.2.2 Lựa chọn chủng vi khuẩn sinh TTX từ loại mơ khác cá độc49 3.2.3 Nghiên cứu khả sinh TTX chủng vi sinh vật thu 51 3.2.3 Phân loại chủng vi sinh vật có khả sản sinh TTX 52 3.3 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI CẤY VI KHUẨN SẢN SINH TTX 59 3.3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 59 3.3.2 Ảnh hưởng pH nuôi cấy 61 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 63 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 64 3.3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung mơ trứng cá độc vào môi trường nuôi cấy 64 3.3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 65 3.3.7 Ảnh hưởng tốc độ khuấy thích hợp 66 3.4 TỐI ƯU HĨA ĐIỀU KIỆN NI CẤY CHỦNG M37 SẢN SINH TTX 67 3.4.1 Chọn miền khảo sát 67 3.4.2 Thiết lập mơ hình 69 3.4.3 Tối ưu hóa khả sinh độc tố TTX chủng M37 theo phương pháp lên dốc Box-Wilson 72 3.4.4 Kiểm định mơ hình tối ưu khả sinh TTX chủng M37 thực nghiệm 73 3.5 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ DỊCH NUÔI VI KHUẨN M37 76 3.5.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết TTX ngoại bào từ dịch nuôi vi khuẩn M37 76 3.5.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tinh TTX từ dịch độc tố thô chứa TTX tách chiết từ dịch nuôi vi khuẩn 77 3.6 KIỂM TRA CHẾ PHẨM TTX TỪ VI SINH VẬT 89 3.6.1 Kiểm tra chế phẩm TTX từ vi sinh vật 89 3.6.2 Thử nghiệm độc tính cấp TTX thu nhận từ dịch nuôi chủng vi khuẩn M37 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 KẾT LUẬN 92 KIẾN NGHỊ 92 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC 102 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vi khuẩn sinh TTX phân lập từ số loài sinh vật biển 16 Bảng 3.1 Hàm lượng độc tố TTX mơ cá thể lồi cá độc Việt Nam 41 Bảng 3.2 Hàm lượng độc tố TTX mơ cá thể đực lồi cá độc Việt Nam 42 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H 13C NMR tương tác xa H-C TTX 47 Bảng 3.4 Số lượng chủng vi sinh vật phân lập loại môi trường từ lồi cá 48 Bảng 3.5 Số lượng vi sinh vật phân lập từ mơ lồi cá độc 49 Bảng 3.6 Số lượng chủng vi sinh vật sinh TTX phân lập từ mơ lồi cá độc 50 Bảng 3.7 Kết phân tích định lượng hàm lượng TTX có dịch nuôi cấy 24 chủng 51 Bảng 3.8 Kết phân loại số chủng vi khuẩn sản sinh TTX hàm lượng cao 52 Bảng 3.9 Ảnh hưởng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp TTX 60 Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh TTX 61 Bảng 3.11 Hàm lượng TTX dịch nuôi cấy điều kiện chỉnh pH ban đầu chỉnh pH q trình ni 62 Bảng 3.12 Ảnh hưởng đệm điều chỉnh pH môi trường đến khả sinh TTX 63 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh TTX 63 Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh TTX 64 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nồng độ mơ trứng cá độc bổ sung vào mơi trường nuôi cấy 65 Bảng 3.16 Sinh trưởng chủng vi khuẩn M37 trình lên men tỷ lệ cấp giống khác 66 Bảng 3.17 Sinh trưởng sinh tổng hợp TTX chủng M37 trình lên men tốc độ khuấy khác 67 Bảng 3.18 Mức khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm (TN) 68 Bảng 3.19 Bảng ma trận thực nghiệm với biến X 69 Bảng 3.20 Ma trận thực nghiệm tâm phương án 70 Bảng 3.21 Ước lượng tính ý nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student 71 Bảng 3.22 Bảng tối ưu hóa theo đường dốc Box - Wilson 73 Bảng 3.23 Thử nghiệm lên men sinh tổng TTX 74 Bảng 3.24 Kết phân tích TTX HPLC mẫu tách chiết ngoại bào với tỷ lệ % axit axetic khác so với thể tích dịch 76 Bảng 3.25 Ảnh hưởng thành phần dịch giải hấp đến việc thu hồi độc tố TTX 78 Bảng 3.26 Kết phân tích định tính định lượng phân đoạn giải hấp theo tỷ lệ than hoạt tính/mẫu độc tố thô 79 Bảng 3.27 Kết định tính TTX từ phần dịch rửa than hoạt tính thí nghiệm 80 vii Bảng 3.28 Kết định tính định lượng TTX với thí nghiệm thay đổi tốc độ dòng chảy qua cột sắc ký 85 Bảng 3.29 Kết phân tích hàm lượng TTX dịch giải hấp từ than hoạt tính 83 Bảng 3.30 Kết phân tích TTX có dịch giải hấp với mẫu pH khác 83 Bảng 3.31 Định lượng TTXs có dịch giải hấp nồng độ axit axetic khác 84 Bảng 3.32 Kết định lượng phân đoạn dịch giải hấp tiến hành tinh cột sắc ký theo tỷ lệ gel Bio-gel P2/mẫu khác 85 Bảng 3.33 Kết phân tích hàm lượng TTX sau tinh sắc ký Bio-gel P2 85 Bảng 3.34 Hàm lượng TTX phân đoạn chứa độc từ cột Bio-Rex 70 (H+) 86 Bảng 3.35 Tỷ lệ chuột chết lô chuột 90 viii AAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGgCATTAACCTAA TaCGTTAGTGTCTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCA GCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAA AGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTG GGAACTgCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTT CCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGG CGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTggggAgCAAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGA GTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACA TCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGT GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAAC GAGCGCAACCCTTGTCCTTagTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAG ACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGC CCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCA AGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTC TGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTC ACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGT GGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTG TGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGG CTGGGATCACCTCCTTT 107 0.005 91 Pseudomonas congelans_AJ492828 52 Pseudomonas savastanoi_ DQ318862 72 56 51 Pseudomonas meliae_AB021382 86 Pseudomonas tremae_AJ492826 Pseudomonas cannabina_AJ492827 Pseudomonas aeruginosa_DQ683361 69 Pseudomonas mandelii_FM955880 Pseudomonas migulae_AM114525 Pseudomonas moorei_FM955889 54 71 53 99 56 92 Pseudomonas taetrolens_D84027 Pseudomonas fluorescens_ DQ084459 Pseudomonas lundensis_NR024704 Pseudomonas syringae_AJ576247 96 M10 56 Pseudomonas putida_AY450556 57 Pseudomonas fragi_AY195842 Pseudomonas veronii_AB056120 Pseudomonas aurantiaca_ DQ682655 Burkholderia cocovenenans_ AB021389 Hình 1.3 Cây phát sinh chủng loại chủng M10 lồi có quan hệ họ hàng gần sở trình tự đoạn gen mã hóa rARN 16S 4/ Trình tự rADN 16S chủng M19 GAACaTgCCTtgAGGtGGGGGaCaACaGTTGGAaACGAcTGcTaATACCgCatAATgTc TACGGaCCAAaGGGGGcTTCGGCTCTCgCcTtTAGATtGgCCCAAGTGGGATTAGC TAGTTGGTGAGGTAATGGcTCaCCAAGGCGACGATCCcTAGCTGGTTTGAGAGG ATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG CAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCcTGATGCAGCCATGCCGCGTGT GTGAAGAAGGCcTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGT AGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTC CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTG GGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCT CAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGT AGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGG CGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGA 108 GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGA AGCTCGGAACCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACAC TTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAT ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTaGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCT AAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCAT CATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTG CTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATT GGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAG AATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT GGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGATAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTTACC ACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCCTAGGGGAA CCTGGGGCTGGATCACCTCCTTT 0.002 20 80 27 97 Pseudoalteromonas elyakovii_ AB000389 Alteromonas elyakovii_AF082562 Alteromonas distincta_AF082564 Pseudoalteromonas paragorgicola_ NR025654 Pseudoalteromonas agarivorans_NR025509 61 96 57 Pseudoalteromonas issachenkonii_NR025139 M19 90 Pseudoalteromonas carrageenovora_AM691088 65 Pseudoalteromonas haloplanktis_ AF214729 Pseudoalteromonas aliena_ NR025775 Pseudoalteromonas citrea_ AF082562 82 Pseudoalteromonas translucida NR025655 65 Pseudoalteromonas antartica X98336 Psychrobacter_alimentarius_AY771725 Hình 1.4 Cây phát sinh chủng loại chủng M19 với lồi có quan hệ họ hàng gần sở trình tự đoạn gen mã hóa rARN 16S 109 5/ Trình tự ADNr 16S chủng M28 AAACGAtGGCTAATaCCGCaTAACCTctTcGGAGCAAAGCGGGGGACCTTCGGgC CTCGCGcTACTGGATACGCCTATgtGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTC aCCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTcTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCcTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT GGGCGAAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCcTTCGGGTTG TAAAGTACTTTCAGTTGTGAGGAAGGTTTCGTAGTTAATAACTGCGTTGCTTGA CGTTAGCAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTG GTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAAGGTCATTTGA AACTGGCAAACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTG AAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACA GATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGT GGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA TTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT TAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTC CAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTC GTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT ATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGAT AAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAG GGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAG TGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGAC TCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATAC GTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAA GAAGTAGGTAGTTTAACCTTCGGGAGGACGCTTACCACTTTGTGGTTCATGACT GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCCTAGGGGAACCTGGGGCTGGATCACCTC CTTT 110 0.005 Vibrio agarivorans_AJ310648 52 Vibrio halioticoli_AY426978 100 Vibrio ezurae_AY426981 60 Vibrio fortis_AJ514915 88 Vibrio natriegens_AJ874353 56 100 Vibrio parahaemolyticus_DQ026024 83 Vibrio harveyi_FJ227114 Vibrio lentus_AY292927 55 Vibrio penaeicida_EU073023 Vibrio litoralis_DQ097523 100 Vibrio rumoiensis_DQ530292 100 M28 Pseudoalteromonas paragorgicola_NR025654 Hình 1.5 Cây phát sinh chủng loại chủng M3 M28 lồi có quan hệ họ hàng gần sở trình tự đoạn gen mã hóa rARN 16S 6/ Trình tự ADNr 16S chủng M30 TGCAAGTCGAGCGGTAACAGAGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGACGAGCGGCGG ACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGA AACGACTGCTATTACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGCTCTCG CCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCA AGGCGACAATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAG ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG CGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAA AGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGCTTAGTGGTTAATACCCATTGAGTGTGACG TTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG GAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTT TGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCATCCTGGGAACTGCATTTCGAAC TGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAA TGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAAC ACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGT AGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTTTTT CAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA 111 ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT GGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGA GATGGTTTGGTGCTTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAG CTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTTA GTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGG AGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACAC ACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACCTGCGAAGGTAAGCGAAT CACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAG TCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGG CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGAT AGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAA GTCGTAACAAGGTAGCCCTAGGGGAACCTGGGGCTGGATCACCTCCTTT 112 0.02 65 Pseudoalteromonas issachenkonii_AF316144 67 M19 55 66 66 Alteromonas tetraodonis_X82139 Alteromonas carrageenovora_X82136 Alteromonas distincta_AF082564 53 Alteromonas nigrifaciens_X82146 73 M43 Alteromonas haloplanktis_X67024 67 68 Pseudoalteromonas translucida AY040230 Pseudoalteromonas aliena_ AY387858 100 Pseudoalteromonas antartica_X98336 86 M30 Pseudoalteromonas marina_ AY563031 Vibrio lentus_AJ278881 Vibrio agarivorans_AJ310647 57 Vibrio ezurae_AY426980 Vibrio harveyi_AY750575 55 Vibrio parahaemolyticus_ AF388386 66 Vibrio fluvialis_X76335 Vibrio fortis_AJ514916 63 Vibrio rumoiensis_AB013297 100 M28 59 100 51 52 100 100 Pseudomonas syringae_DQ318866 Pseudomonas mandelii_FM955880 97 100 Pseudomonas migulae_AM114525 Pseudomonas taetrolens_D84027 67 Pseudomonas fluorescens_ DQ084459 99 Pseudomonas lundensis_NR024704 63 Pseudomonas fragi_AF094733 M10 96 Burkholderia norimbergensis_ AB021389 59 Hình 1.6 Cây phát sinh chủng loại chủng M10, M19, M28, M30 M43 với lồi có quan hệ họ hàng gần sở trình tự đoạn gen mã hóa rARN 16S 7/ Trình tự ADNr 16S chủng M37 CAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGGG AAGATAGTTTAATATCTTTGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAG GGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCAT ACGGCCTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTCCGCGATTGGATGAA 113 CCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCC CTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGAT GCAGCCATGCGGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGT AGGGAGGAAAGGTAATAGTTTAATACGCTATTACTGTGACGTTACCTACAGAA GAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTCCGAG CGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGA TGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTCGAACTGGCGAACTAGA GTCTTGTAGAGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT GGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGG CACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT AAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGTCTTGAACACTGGGCTCTCAAGCTAAC GCATTAAGTAGACCGCCTGGGAAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG CGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACAGAAGCCAGTAGAGATACAGGTG TGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGT GAAATGTTTGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTATTTGCCAGC ACGTAATGGTGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGAGGAAGGTG GGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTAC AATGGCGAGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAA GCTCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATC GCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC ACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGCTTAAC CTTCGGGGGGGCGCTCACCACTTTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAAC AAGGTAGCCCTAGGGGAACC 114 So sánh mức độ tương đồng trình tự đoạn ADNr 16S chủng vi khuẩn M37 với chủng Shewanella baltica _NCTC10735 phương pháp xếp hàng dọc (alignment) 115 0.02 55 58 57 98 71 53 64 57 100 66 91 Psychrobacter cibarius_AY639871 75 M102 M105 Psychrobacter urativorans_AJ609555 Psychrobacter glacincola_AJ312213 Psychrobacter arcticus_AY444822 Psychrobacter fozii_AJ430827 Psychrobacter frigidicola_AJ609556 Psychrobacter okhotskensis_AB094794 Psychrobacter cryohalolentis_AY660685 Psychrobacter namhaensis_AY722805 Psychrobacter aquimaris_AY722804 Psychrobacter piscatorii_AB453700 M6 85 100 99 100 86 77 77 59 Psychrobacter nivimaris_AJ313425 Shewanella atlantica_AY579752 Shewanella hanedai _X82132 Shewanella woodyi_AF003549 Shewanella amazonensis_AF00524 Shewanella pacifica_AF500075 Shewanella frigidimarina_U85903 Shewanella oneidensis_AF005251 Shewanella arctica _AJ877256 Shewanella taiwanensis_ AB263191 57 50 Shewanella putrefaciens_X81623 Shewanella hafniensis_AB205566 Shewanella massilia_AJ006084 H17 M20 M69 93 M37 63 85 58 Shewanella baltica_ NCTC10735 Pseudoalteromonas marina_AY563031 Hình 1.7 Cây phát sinh chủng loại chủng M37 với lồi có quan hệ họ hàng gần sở trình tự đoạn gen mã hóa rARN 16S 8/ Trình tự rADN 16S chủng M43 GGAACATgCCtTGaGGtGGGggaCAaCAgTtGGAaACGAcTgCTaATACCgCaTAATgT cTaCGGaCCAAaGGGGgcTtCgGCTcTCgCcTtTAGATtGgCCCAAgtGGGAtTAGCTAG TtGgTGAGGTAaTgGCTCaCCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGA TCAGCCACACTGgGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCcTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAA GAAGGCcTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTA ATACCtGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA AAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCT 116 GGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATT TCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAG GCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAA CGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCcGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTC GGAGCCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGA GTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAaGAACCTTACCTACACTTGAC ATACAGAGAACTTACCAGAGATggTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGT GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACCCCTATCCTTaGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGA GACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGG CCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCG AACCTGCGAAGGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT CTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGA CGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAG TGGGTTGCTCCAGAAGTAGATAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTTACCACGGA GTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAgGTAGCCCTAGGGGAACCTGGG GCTGGATCACCTCCTTT 54 Pseudoalteromonas paragorgicola_ AY040229 85 Pseudoalteromonas distincta_ AF082564 83 Pseudoalteromonas elyakovii_ AF082562 Pseudoalteromonas agarivorans_ AJ417594 Pseudoalteromonas carrageenovora_ X82136 56 87 73 Pseudoalteromonas issachenkonii_ AF316144 M43 95 59 67 Pseudoalteromonas gracilis_ AF038846 Pseudoalteromonas haloplanktis_X67024 Pseudoalteromonas translucida_ AY040230 96 Pseudoalteromonas antartica_X98336 Pseudoalteromonas aliena_ NR025775 Psychrobacter alimentarius_AY771725 Hình 1.8 Cây phát sinh chủng loại chủng M43 với lồi có quan hệ họ hàng gần sở trình tự đoạn gen mã hóa rARN 16S 117 PHỤ LỤC 4: MỘT SỐ BẢNG PHÂN TÍCH THỐNG KÊ * Lập ma trận thực nghiệm: pH N 26 27 28 29 X2 ( C) X1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 N Nhiệt độ Thời gian Nồng độ CBS X4 X3 (ngày) (%) 20 20 30 30 20 20 30 30 20 20 30 30 20 20 30 30 6,5 25 11,28 25 7,05 25 6,5 42,3 6,5 28,2 6,5 25 6,5 25 6,5 25 6,5 25 Các thí nghiệm tâm phương án pH X1 6,5 6,5 6,5 6,5 Nhiệt độ X2 (0C) 25 25 25 25 Thời gian X3 (ngày) 3,5 3,5 3,5 3,5 2 2 5 5 2 2 5 5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 7,05 2,82 3,5 3,5 3 3 3 3 10 10 10 10 10 10 10 10 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 14,1 4,23 Nồng độ CBS X4 (%) 6,5 6,5 6,5 6,5 118 ANOVA Table for TTX by TN BANG Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 1306,15 0,0000 Squares Between groups 0,0246303 0,00410505 Within groups 0,000044 14 0,00000314286 Total (Corr.) 0,0246743 20 Table of Means for TTX by TN with 95,0 percent LSD intervals Stnd error Col_1 Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit TN 20 0,7033 0,0010 0,7018 0,7049 TN 21 0,7337 0,0010 0,7321 0,7352 TN 22 0,7847 0,0010 0,7831 0,7862 TN 23 0,7870 0,0010 0,7854 0,7886 TN 24 0,7503 0,0010 0,7488 0,7519 TN 25 0,7233 0,0010 0,7218 0,7249 TN 26 0,6927 0,0010 0,6911 0,6942 Total 21 0,7393 Multiple Range Tests for TTX by TN Method: 95,0 percent LSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups TN 26 0,693 X TN 20 0,703 TN 25 0,723 TN 21 0,734 TN 24 0,750 TN 22 0,785 X TN 23 0,787 X X X X X 119 Contrast Sig Difference +/- Limits TN 20 - TN 21 * -0,0303 0,0031 TN 20 - TN 22 * -0,0813 0,0031 TN 20 - TN 23 * -0,0837 0,0031 TN 20 - TN 24 * -0,0470 0,0031 TN 20 - TN 25 * -0,0200 0,0031 TN 20 - TN 26 * 0,0107 0,0031 TN 21 - TN 22 * -0,0510 0,0031 TN 21 - TN 23 * -0,0533 0,0031 TN 21 - TN 24 * -0,0167 0,0031 TN 21 - TN 25 * 0,0103 0,0031 TN 21 - TN 26 * 0,0410 0,0031 -0,0023 0,0031 TN 22 - TN 23 TN 22 - TN 24 * 0,0343 0,0031 TN 22 - TN 25 * 0,0613 0,0031 TN 22 - TN 26 * 0,0920 0,0031 TN 23 - TN 24 * 0,0367 0,0031 TN 23 - TN 25 * 0,0637 0,0031 TN 23 - TN 26 * 0,0943 0,0031 TN 24 - TN 25 * 0,0270 0,0031 TN 24 - TN 26 * 0,0577 0,0031 TN 25 - TN 26 * 0,0307 * denotes a statistically significant difference 0,0031 120 PHỤ LỤC 5: MỘT SỐ HÌNH ẢNH HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU Dịch nuôi vi khuẩn Cô quay giảm thể tích mẫu chiết Tinh độc tố thơ cột Bio Gel P2 Đưa mẫu độc tố thô lên cột Bio Rex 70 Nhồi cột than hoạt tính Kết tinh TTX 121 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ NÓC ĐỘC VI? ??T NAM Chuyên ngành: Công. .. phát từ ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn, tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy thu nhận Tetrodotoxin từ số chủng vi khuẩn phân lập từ cá độc Vi? ??t Nam? ?? * Mục tiêu nghiên cứu: ... CỦA CÁ NĨC ĐỘC VI? ??T NAM 41 v 3.1.1 Lựa chọn mẫu vật để phân lập vi sinh vật từ cá độc 41 3.1.2 Nghiên cứu xác định tính chất TTX từ mẫu cá độc Vi? ??t Nam 43 3.2 PHÂN LẬP VÀ